楊利艷 虞 波 楊 楠 張翔宇 高妙妙 陜嘉楠 張慧潔

（1山西師范大學(xué)現(xiàn)代文理學(xué)院 山西臨汾 041004 2山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山西臨汾 041004）

草甘膦，即 N-（膦羧甲基）甘氨酸（C3H8NO5P）,通過(guò)抑制EPSP合成酶破壞莽草酸途徑，由此造成EPSP缺乏導(dǎo)致芳香族氨基酸減少，同時(shí)草甘膦也能通過(guò)抑制光合作用中ATP合成酶而抑制光合磷酸化的過(guò)程，從而達(dá)到除草效果［1］。研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦在植物和動(dòng)物飼料中都有殘留，大豆中草甘膦的殘留量達(dá)到17 mg/kg。噴灑過(guò)草甘膦的農(nóng)田，在后茬作物例如草莓、生菜、胡蘿卜、大麥等作物中仍發(fā)現(xiàn)有草甘膦殘留［4］。草甘膦作為廣譜除草劑目前已成為世界上應(yīng)用最廣、使用量最大的農(nóng)藥品種，對(duì)農(nóng)業(yè)高產(chǎn)豐收起到重要作用。草甘膦的主要應(yīng)用及全球需求量如表1所示［2-3］。近年來(lái)，除草劑殘留的安全性受到公眾越來(lái)越多的關(guān)注。有人認(rèn)為殘留的草甘膦可能會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體從而引起異常的生理效應(yīng)［5］。有研究表明，高濃度的草甘膦會(huì)輕微抑制人體的免疫功能［6］；草甘膦對(duì)皮膚有輕度刺激作用，急性中毒時(shí)可出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭昏、腹痛、呼吸困難、共濟(jì)失調(diào)，甚至造成低血壓或肺水腫［7］。草甘膦進(jìn)入消化道后對(duì)重要的消化酶有無(wú)影響，經(jīng)消化后進(jìn)入血液會(huì)產(chǎn)生何種效應(yīng)等問(wèn)題亟待了解，本研究試圖探究不同濃度草甘膦對(duì)生物大分子如胰蛋白酶、胃蛋白酶、DNA構(gòu)象的影響，并通過(guò)模擬體內(nèi)消化環(huán)境，了解草甘膦殘留對(duì)血液的影響。

表1 草甘膦的用量及應(yīng)用（2006—2010年）

1 材料與方法

1.1 材料 除草劑草甘膦（孟山都農(nóng)達(dá)41%草甘膦滅生性除草劑）按照說(shuō)明，分別配制標(biāo)準(zhǔn)使用濃度（T1）、1.5 倍（T2）、2 倍（T3）、3 倍（T4）濃度的草甘膦溶液進(jìn)行玉米葉片噴施，以噴施等量蒸餾水為對(duì)照（CK）。

玉米（Zea mays）種子鄭58由山西省農(nóng)科院小麥研究所玉米課題組提供。溫室種植，常規(guī)管理，待長(zhǎng)至三葉期，取材。

胃蛋白酶、胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 雞血DNA的提取 取新鮮雞血細(xì)胞液（5～10 mL），利用 DNA在 0.14 mol/L的氯化鈉溶液中溶解度最低，蛋白質(zhì)溶解度高的特點(diǎn)，提取DNA并純化。

1.2.2 胃蛋白酶、胰蛋白酶、DNA構(gòu)象的變化測(cè)定 計(jì)算并稱(chēng)量胃蛋白酶粉末，加蒸餾水溶解，水浴至37℃，分裝，分別加入1/1 000體積的T1、T2、T3、T4草甘膦溶液，以加入等量蒸餾水為對(duì)照。采用TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì)（北京普析公司）分別測(cè)定各組胃蛋白酶吸光值。胰蛋白酶吸收峰及吸光度的變化測(cè)定同胃蛋白酶。

將不同濃度的草甘膦滴入DNA溶液中，采用TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的吸光度。

1.2.3 人體胃液、腸液的模擬 分別加入1 g Na-Cl，1.6 g胃蛋白酶，3.5 mL 36.5%濃鹽酸，然后定容至 500 mL，調(diào)節(jié) pH到 1.3，配制成模擬胃液。將1.36 g磷酸氫二鉀溶于約100 mL蒸餾水中，另取2 g胰蛋白酶加水溶解，定容至200 mL，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.6，制成模擬腸液。將模擬唾液環(huán)境中的噴施過(guò)不同濃度草甘膦的玉米葉分別轉(zhuǎn)移到胃液5 h后再轉(zhuǎn)移到模擬腸液中。

1.2.4 血相指標(biāo)的測(cè)定 離心腸液消化后的產(chǎn)物，棄上清液，加入已加抗凝劑的等量雞血中振蕩培養(yǎng)2 min，取血樣送于山西省臨汾市堯都區(qū)明林動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)行血相指標(biāo)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶、禽類(lèi)DNA的影響

2.1.1 不同濃度草甘膦對(duì)胃蛋白酶構(gòu)象的影響蒸餾水加入胃蛋白酶溶液后，將其反應(yīng)液于波長(zhǎng)為280 nm處進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示胃蛋白酶在276 nm處有最大吸收峰，吸光度為1.105 Abs。

圖1 不同濃度草甘膦下胃蛋白酶的光譜掃描圖

不同濃度的草甘膦溶液加入胃蛋白酶溶液后，其最大吸收峰和吸光度均發(fā)生了變化，總趨勢(shì)為：隨著草甘膦濃度的增加，胃蛋白酶溶液的吸光度增大；T1組草甘膦較蒸餾水使胃蛋白酶溶液最大吸收峰左移，草甘膦濃度增加，其最大吸收峰不再改變。

表2 不同濃度草甘膦下胃蛋白酶的最大波峰及其吸光度

表2中的數(shù)據(jù)與圖1掃描結(jié)果相吻合?？梢?jiàn)，草甘膦處理后，其反應(yīng)液吸光度較對(duì)照組增大，表明一定濃度的草甘膦對(duì)胃蛋白酶有一定影響，且在等量的人工胃液中加入0.01 g草甘膦時(shí)影響最大。結(jié)果說(shuō)明，草甘膦與胃蛋白酶的相互作用會(huì)改變芳香族氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境，使其所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)。同時(shí)表明，取食有草甘膦殘留達(dá)0.01 g的作物后可能對(duì)動(dòng)物胃蛋白酶的構(gòu)象影響最大。

2.1.2 不同濃度草甘膦對(duì)胰蛋白酶構(gòu)象的影響結(jié)果可見(jiàn)，4個(gè)濃度的草甘膦均使胰蛋白酶最大吸收峰左移至268 nm，各處理均較對(duì)照吸光度升高，且隨著草甘膦濃度升高，胰蛋白酶吸光度增加。

表3數(shù)據(jù)與圖2結(jié)果一致，即隨著草甘膦濃度的增加，胰蛋白酶的最大吸收峰均向左移，且均在268 nm處有最大吸收峰，同時(shí)吸光度也逐漸增加且均高于對(duì)照組。結(jié)果表明：草甘膦與胰蛋白酶的相互作用改變了芳香族氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境，使其所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)。說(shuō)明動(dòng)物取食有草甘膦殘留的作物后對(duì)動(dòng)物的胰蛋白酶的構(gòu)象有一定影響，且隨著草甘膦濃度的增加影響愈大。

表3 不同濃度草甘膦下胰蛋白酶的最大波峰及其吸光度

圖2 不同濃度草甘膦下胰蛋白酶的光譜掃描圖

2.1.3 不同濃度草甘膦對(duì)DNA構(gòu)象的影響 由圖3可知，對(duì)照組和處理組均在同一波長(zhǎng)下有最大吸收峰。表4數(shù)據(jù)表明，各處理組中DNA均在260 nm處有最大吸收值，隨著草甘膦濃度的增加，DNA的吸光度值在不斷增加，且均高于對(duì)照。由此可知，一定濃度的草甘膦對(duì)DNA的構(gòu)象有影響，且草甘膦的濃度越大影響越大。

圖3 不同濃度草甘膦下DNA在190～600 nm波段處的綜合光譜掃描圖

表4 不同濃度草甘膦下DNA在最大波峰處的吸光度值

2.2 草甘膦殘留對(duì)雞血相指標(biāo)的影響 由檢測(cè)結(jié)果（表5）可以看出草甘膦殘留對(duì)于雞血相的各項(xiàng)指標(biāo)均有不規(guī)律的影響，其中白細(xì)胞數(shù)量隨草甘膦濃度增加呈先增后降的趨勢(shì)，這是動(dòng)物自身的免疫反應(yīng)，同時(shí)也表明當(dāng)草甘膦濃度達(dá)2倍標(biāo)準(zhǔn)使用濃度時(shí)，動(dòng)物自身已無(wú)法調(diào)節(jié)。

表5 玉米葉片草甘膦殘留對(duì)雞血相指標(biāo)的影響

3 結(jié)論與討論

在動(dòng)物體內(nèi)，消化功能依靠胃腸運(yùn)動(dòng)的機(jī)械性消化和消化酶作用的化學(xué)性消化完成。消化液中含有大量消化酶，可促進(jìn)食物中糖、脂肪、蛋白質(zhì)的水解，由大分子物質(zhì)變?yōu)樾》肿游镔|(zhì)，以便被機(jī)體吸收利用。消化酶的生物活性受到影響時(shí)會(huì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收造成不利，使機(jī)體產(chǎn)生一些病癥［8］。胃液中的胃蛋白酶和胰液中的胰蛋白酶是2種重要的消化酶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的草甘膦作用于胃蛋白酶和胰蛋白酶后會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定影響：隨著草甘膦劑量的增加，胃蛋白酶和胰蛋白酶的最大吸收峰均向左移，且與對(duì)照組相比其吸光度值都明顯增大，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明使用標(biāo)準(zhǔn)濃度1.5倍以上劑量的草甘膦，與胃蛋白酶和胰蛋白酶的相互作用，會(huì)改變芳香族氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境，使其所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，胃蛋白酶和胰蛋白酶構(gòu)象受到影響，可能會(huì)對(duì)動(dòng)物的消化產(chǎn)生影響。血相指標(biāo)的變化表明，草甘膦殘留經(jīng)消化吸收進(jìn)入血液中將會(huì)對(duì)禽類(lèi)血液大部分指標(biāo)（WBC、MCHC、PLT等）產(chǎn)生無(wú)規(guī)律且較大的影響。生物有機(jī)體內(nèi)的主要遺傳物質(zhì)是DNA，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可知，不同劑量的草甘膦作用于DNA后其吸光度值均較對(duì)照組相比增大，且草甘膦的量越大，作用DNA后，DNA的吸光度值越大。核酸變性時(shí)，吸光度升高［9］，因此說(shuō)明草甘膦與DNA相互作用后改變了DNA的構(gòu)象破壞了其三級(jí)結(jié)構(gòu)，使得游離的核苷酸濃度增加。

草甘膦目前注冊(cè)登記作物已達(dá)50種以上［5］。研究表明，草甘膦可以在植物中進(jìn)行代謝［6］，同時(shí)對(duì)動(dòng)物有影響。妊娠期雌鼠長(zhǎng)期接觸草甘膦除草劑，會(huì)引起后代大腦的多種功能性變異［10］；草甘膦對(duì)懷孕雌鼠有毒害作用，并延遲其胎兒的骨骼發(fā)育［11］。在一定條件下草甘膦等除草藥劑均會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧［12］，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞造成損傷［13］。 趙偉等［14］研究表明，草甘膦能降低小鼠的總抗氧化能力，引起機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化，損害蛋白質(zhì)，使機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，增強(qiáng)致病因素的毒性作用，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。有實(shí)驗(yàn)證明草甘膦對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有致突變性，對(duì)小鼠精子產(chǎn)生損害，對(duì)雄性生殖細(xì)胞具有潛在的誘變危害［15］。肖永紅等［16］研究表明，亞致死劑量的草甘膦溶液對(duì)中華大蟾蜍蝌蚪的生長(zhǎng)發(fā)育具有明顯的抑制作用，蝌蚪體長(zhǎng)、體寬、尾長(zhǎng)、尾寬和體質(zhì)量的增長(zhǎng)率均與草甘膦濃度呈負(fù)相關(guān)［17］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著草甘膦濃度的增加，其對(duì)雞血DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響愈大，即草甘膦濃度越高，動(dòng)物精細(xì)胞吸收草甘膦后對(duì)生殖的潛在影響越大。草甘膦經(jīng)消化吸收進(jìn)入血液后會(huì)造成何種影響，也是本研究關(guān)注的問(wèn)題。血相指標(biāo)對(duì)血液吸收的物質(zhì)非常敏感，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)模擬胃液、腸液消化后的殘留物對(duì)血相指標(biāo)均有一定影響。因此，綜合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，建議采用不同策略，例如：1）采用綜合防治技術(shù)，例如農(nóng)藝措施、機(jī)械除草、化學(xué)除草相結(jié)合；2）交替使用不同除草劑；3）開(kāi)發(fā)新型除草劑；4）培育不同抗除草劑作物品種，以延緩或降低作物對(duì)草甘膦的抗性，從而降低草甘膦的使用，對(duì)保證動(dòng)物的安全有重要意義。

［1］陳虎保,朱慧香,陳國(guó)海.草甘膦的作用機(jī)理及部位.林業(yè)科技通訊,1997(1):23.

［2］汪國(guó)瑜.草甘膦行業(yè)現(xiàn)狀分析.瀘天化科技,2015(2):88.

［3］汪家銘.草甘膦發(fā)展概況及市場(chǎng)前景.廣州化工,2008,36(2):18.

［4］Cessna A J,Cain N P.Residues of glyphosate and its metabolite AMPA in strawberry fruit following spot and wiper applications.Canadian Journal of Plant Science,1992,72(4):1359．

［5］Thomas W E,Pline-Strniae W A,Thomas J E,et al.Glyphosate negatively affects pollen viability but no pollination and seed set in glyphosate-resistant corn.Weed Science,2004(52):725.

［6］Arregui M C,Lenardon A Sanchez D,et al.Monitoring glyphosate residues in transgenic glyphosate-resistant soybean.Pest Management Science,2004,60(2):163.

［7］楊水蓮,匡興亞,姚峰,等.急性草甘膦中毒4例病例報(bào)告.中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué),2008,35(2):135.

［8］劉婷,李宗軍,廖勇,等.乳酸菌和茶多酚對(duì)肉雞消化酶活性的影響.中國(guó)畜牧雜質(zhì),2014,50(3):78.

［9］趙霞,范闊海.熒光探針?lè)ㄑ芯裤U離子對(duì)小牛胸腺DNA構(gòu)象的影響.安徽農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,37(34):16859.

［10］Fujii T.Transgenerational effects of matermal exposure to chemicals on the functional development of the brain in the offspring.Cancer Causes Control,1997,8(3):525.

［11］Dallegrave E,Mantese F D.The teratogenic potential of the herbicide glyphosate-Roundup in Wistar rats.Toxicology Letters,2003,142(1-2):45.

［12］馬旭俊,朱大海.植物超氧化歧化酶（SOD）的研究進(jìn)展.遺傳,2003,25(2):225．

［13］Foyer C H,Lelandis M,Kunert K J.Photoxidative stress in plants.Physiologia Planrumt,1994,92(4):696.

［14］趙偉,曹曦予,吳艷萍,等.草甘膦致小鼠機(jī)體氧化損傷作用的研究.毒理學(xué)雜志,2011(5):364.

［15］康菊芳,曾明,關(guān)嵐,等.草甘膦對(duì)小鼠的致突變作用研究.癌變 畸變 突變,2008,20(3):227.

［16］肖永紅,廖永強(qiáng),周昌旭,等.除草劑草甘膦對(duì)中華大蟾蜍的慢性毒性.四川動(dòng)物,2007,26(2):430.

［17］楊治峰,張振玲.草甘膦生殖發(fā)育毒性的研究進(jìn)展.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2013,30(2):154.

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