張 巖, 李長鳴, 祁瑞艷, 張夢茹, 李 迪

(沈陽大學(xué) 師范學(xué)院, 遼寧 沈陽 110044)

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載阿霉素的葉酸偶聯(lián)羧甲基殼聚糖自組裝納米粒的研制及體外釋放

張 巖, 李長鳴, 祁瑞艷, 張夢茹, 李 迪

(沈陽大學(xué) 師范學(xué)院, 遼寧 沈陽 110044)

采用化學(xué)交聯(lián)法制備葉酸-羧甲基殼聚糖偶聯(lián)物(FCC),用于裝載抗癌藥物阿霉素,形成具有腫瘤靶向功能的自組裝納米粒(DOX-FCC NPs),并對(duì)載藥納米粒的體外釋放特性進(jìn)行了研究.結(jié)果表明,納米粒呈球形,粒徑約為200 nm,包封率和載藥量受到藥物加入量的影響.該納米粒具有良好的pH敏感釋藥特性,葉酸修飾可以增強(qiáng)藥物在腫瘤部位的蓄積,減少對(duì)正常組織的毒性,達(dá)到靶向遞藥的效果.

葉酸; 羧甲基殼聚糖; 阿霉素; 納米粒; 自組裝

殼聚糖是一類用途很廣的天然高分子化合物,具有安全無毒、生物可降解性和生物相容性好等特性,在生物醫(yī)藥、環(huán)保、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[1-4].但殼聚糖分子水溶性差,有必要進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造提高其溶解性.羧甲基殼聚糖是殼聚糖的衍生物,殼聚糖經(jīng)過羧甲基化后,破壞了原有的二次結(jié)構(gòu),降低了其結(jié)晶性,提高了水溶性,使其在中性或堿性溶液中都可以溶解,同時(shí)羧甲基殼聚糖比殼聚糖的降解速度更快,擴(kuò)大了殼聚糖的應(yīng)用范圍[5-6].

羧甲基殼聚糖分子中具有大量的活性氨基和羧基,除了具有pH敏感性外,還可以修飾特定基團(tuán)賦予其功能性.此外,羧甲基殼聚糖還可以通過離子交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)法制成納米藥物載體,用于藥物遞送[7].Tan等將阿霉素負(fù)載到亞油酸修飾的羧甲基殼聚糖自組裝納米粒上,對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí),藥物結(jié)合到納米粒子后同樣對(duì)癌癥細(xì)胞具有很好的抑制作用.盡管羧甲基殼聚糖納米粒子在增強(qiáng)滲透和滯留(EPR)效應(yīng)下可將藥物被動(dòng)輸送到腫瘤組織,但藥物總量較少,無法保證療效.而如果在納米粒子的表面修飾一些與受體特異性結(jié)合的靶向基團(tuán),賦予納米載藥粒子主動(dòng)靶向功能,就可以進(jìn)一步提高藥物的利用效率,起到減毒增效的作用.

文獻(xiàn)表明[8],葉酸受體在許多腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá),而在正常細(xì)胞上很少表達(dá),它可以介導(dǎo)葉酸納米粒子的內(nèi)吞,實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向輸送.此外,葉酸作為疏水性分子,接枝到羧甲基殼聚糖分子后,使其具有兩親性,提高了納米粒自組裝能力.

本文以阿霉素為模型藥物,采用化學(xué)交聯(lián)法制備葉酸-羧甲基殼聚糖偶聯(lián)物,進(jìn)而形成自組裝納米粒,葉酸分子既是靶向基團(tuán),又提供疏水片段.采用核磁共振(H-NMR)對(duì)偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,采用動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)測定納米粒的粒徑,透射電鏡觀察粒子的形態(tài),并對(duì)納米粒的包封率和載藥量進(jìn)行測定.通過體外釋放實(shí)驗(yàn),對(duì)該納米粒的pH敏感性進(jìn)行了考察.

1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)材料

羧甲基殼聚糖(CMCS,平均相對(duì)分子質(zhì)量50 000,羧甲基取代度60%,脫乙酰度85%)購自濟(jì)南海德貝海洋生物工程有限公司;葉酸(FA)購自成都科龍化工試劑廠;1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)購自上海阿拉丁試劑有限公司;鹽酸阿霉素購自Sigma公司;其他試劑均為分析純.

1.2 葉酸修飾羧甲基殼聚糖偶聯(lián)物(FCC)的合成及表征

采用化學(xué)交聯(lián)法對(duì)FA和CMCS進(jìn)行交聯(lián)[9].稱取0.2 g葉酸溶于10 mL DMSO中,加入0.1 g的NHS和0.2 g的DCC(n(FA)∶n(NHS)∶n(DCC)=1∶2∶2),室溫活化12 h,直到FA全部溶解.向葉酸溶液中加入1%的羧甲基殼聚糖溶液(用pH值哦4.7的PBS配制)和EDC(n(CMCS)∶n(FA)∶n(EDC)=1∶1∶1),繼續(xù)室溫避光攪拌16 h.然后向溶液中滴加NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.0,用pH值為7.4的PBS透析24 h,然后用水透析24 h后,凍干處理,得到FCC偶聯(lián)物.采用核磁共振H-NMR(Bruker ARX300)對(duì)FCC的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征.

1.3 FCC自組裝納米粒的制備及藥物裝載

將FCC偶聯(lián)物分散在pH值7.4的PBS中,室溫放置過夜,然后用探頭式超聲處理樣品,功率30 W,每次3 min(超聲5 s,停1 s),重復(fù)兩次,直到得到接近透明的溶液.然后將上述溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾,得到空白FCC自組裝納米粒.取空白FCC納米粒適量,用PBS配成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的稀釋液.取納米粒稀釋液1 mL,向其中加入等體積不同質(zhì)量濃度的鹽酸阿霉素溶液(200、400、600、800 μg/mL),避光攪拌24 h,未被包載的阿霉素用超濾膜(截留分子質(zhì)量為10 kD)除去,凍干后得到載藥納米粒.

1.4 載藥納米粒的形態(tài)觀察及粒徑測定

采用透射電鏡(TEM,JEM-2100,Japan)觀察載藥納米粒的形態(tài)[10].取納米粒(m(藥物)∶m(載體材料)=1∶10)適量,用PBS適當(dāng)稀釋,滴至覆有支持膜的銅網(wǎng)上,停留2 min,以濾紙吸去多余溶液,然后向銅網(wǎng)上滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的磷鎢酸溶液負(fù)染色,用濾紙吸取多余溶液,自然干燥,然后用透射電鏡觀察粒子的形態(tài).

采用激光粒度儀(Malvern Instruments,UK)測定納米粒的粒徑.取載藥納米粒(m(藥物)∶m(載體材料)=1∶10)適量,用蒸餾水稀釋至0.1 mg/mL,采用動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)測定.

1.5 包封率和載藥量

阿霉素含量通過熒光法測定,檢測波長490 nm.納米粒的包封率(LE)和載藥量(LC)通過如下式計(jì)算:

其中,A為溶液中阿霉素的總量;B為超濾后上清液中阿霉素的含量;C為凍干后納米粒的質(zhì)量.

1.6 體外釋放特性

取3份10mg的DOX-FCC納米粒(m(藥物)∶m(載體材料)=1∶5),分別重新分散在pH值為7.4,6.8和5.0的PBS緩沖液中.將溶液裝入透析袋(截留分子質(zhì)量為14kD)中并分別置于含20mLpH值為7.4,6.8和5.0的PBS緩沖液的玻璃瓶中,在恒溫37 ℃振蕩箱中以100r/min進(jìn)行釋放.在預(yù)定的時(shí)間間隔,取出3mL透析液并補(bǔ)充加入相應(yīng)pH的等量新鮮PBS溶液,阿霉素的含量用熒光法在480nm處測定,計(jì)算藥物累積釋放量.

2 結(jié)果和討論

2.1FCC的合成及結(jié)構(gòu)表征

FCC結(jié)構(gòu)用HNMR表征,結(jié)果如圖1所示.其中化學(xué)位移在3.0～4.5為CMCS分子中糖環(huán)基團(tuán)的質(zhì)子峰,化學(xué)位移7.8、7.4、7.2對(duì)應(yīng)FA分子中-CONH-、苯環(huán)及-NH-的質(zhì)子峰,化學(xué)位移2.3、1.8對(duì)應(yīng)FA分子中H22和H21,這與文獻(xiàn)報(bào)道[11]是一致的,結(jié)果表明,FA與CMCS成功連接.

圖1 FCC的結(jié)構(gòu)及核磁譜圖

2.2 DOX-FCC納米粒的理化性質(zhì)

DOX-FCC納米粒的形態(tài)如圖2所示,TEM觀察納米粒呈球形,平均粒徑在200 nm左右,在溶液中分散較好.DLS法測得的納米粒粒徑為232.5±18.2 nm,數(shù)值比TEM法大,主要是由于DLS法測得的數(shù)據(jù)為水化直徑,而TEM法為脫水處理的直徑,納米粒體積縮小所致[12].

DOX-FCC納米粒的包封率和載藥量如表1所示.隨著藥物與載體材料的質(zhì)量比的提高,納米粒的載藥量逐漸升高,從4.6%提高到18.9%,而包封率卻逐漸降低,從90.3%降低到71.7%,說明過多的藥物可能超出載體材料的包載能力,導(dǎo)致包封率下降.

圖2 DOX-FCC納米粒的形態(tài)(a)及粒徑分布(b)

m(DOX)/mgLE/%LC/%0．290．3±0．54．6±0．10．484．6±0．68．5±0．20．677．5±0．813．4±0．20．871．7±0．418．9±0．2

2.3 藥物體外釋放

藥物的體外釋放見圖3所示.由圖可見,納米粒具有明顯的pH敏感釋放特征.藥物從納米粒的釋放都經(jīng)歷先突釋后緩釋的特征,突釋由納米粒表面吸附的藥物引起,緩釋則是藥物從納米粒內(nèi)部擴(kuò)散所致.隨著pH值從7.4降低到5.0,藥物從納米粒中的釋放速度明顯加快,在pH值為7.4、6.8和5.0的釋放介質(zhì)中48 h累積釋放量分別為27.5%、42.8%和66.9%.這可能是由于隨著pH值降低,羧甲基殼聚糖的溶解性增強(qiáng),納米粒外層表面孔道增多,利于藥物的釋放.文獻(xiàn)報(bào)道[13],腫瘤組織的pH值比正常組織更低,腫瘤組織間隙pH值一般在6.3～6.8,正常體液的pH值在7.4,而腫瘤細(xì)胞核內(nèi)環(huán)境pH值一般在5.0～5.5.結(jié)合DOX-FCC納米粒的釋放特點(diǎn)可知,該納米粒可以在正常組織及血液運(yùn)輸中減少藥物釋放而降低系統(tǒng)毒性,到達(dá)靶部位后加速釋放,殺傷腫瘤細(xì)胞.

圖3 DOX-FCC納米粒在不同pH值的釋放介質(zhì)中48 h累積釋放曲線

3 結(jié) 論

本文通過化學(xué)交聯(lián)法將葉酸與羧甲基殼聚糖偶聯(lián),作為抗腫瘤藥物阿霉素的載體,在水溶液中依靠聚合物分子相互作用自組裝形成DOX-FCC納米粒.該納米粒對(duì)阿霉素包載率較高,可以靶向腫瘤細(xì)胞,而對(duì)正常組織細(xì)胞傷害較小.研究發(fā)現(xiàn),DOX-FCC納米粒具有明顯的pH敏感釋藥特性,在偏酸性條件下釋放較快而在中性條件下釋放較慢,這更有利于提高藥效而降低毒性.這種主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞的納米藥物載體為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新的思路.

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【責(zé)任編輯: 胡天慧】

Doxorubicin Loaded Folate Modified Carboxymethyl Chitosan Self-Assembled Nanoparticles and in Vitro Release

ZhangYan,LiChangming,QiRuiyan,ZhangMengru,LiDi

(Normal School, Shenyang University, Shenyang 110044, China)

Folate (FA) modified carboxymethyl chitosan (FCC) has been synthesized by chemical crosslinking method, and doxorubicin (DOX) loaded FCC nanoparticles (NPs) were prepared by self-assembly, which has the ability of targeting the tumor cells. Results showed that the nanoparticles were spherical and the particle size was about 200 nm. The drug loading content (DLC) and encapsulation efficiency (EE) were both affected by the adding DOX. The in vitro release showed that the NPs had a good pH-sensitive and sustained release for DOX. FA could enhance the DOX enrichment in the tumor cells, and reduce the toxicity for the normal tissues, which could improve the therapeutic effect of the tumor.

folate; carboxymethyl chitosan; doxorubicin; nanoparticle; self-assembly

2016-12-15

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81503014).

張 巖(1982-),男,遼寧沈陽人,沈陽大學(xué)講師,博士.

2095-5456(2017)02-0087-04

R 318.08

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