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        禽霍亂病原體的分離鑒定及藥敏試驗

        2017-05-12 02:42:59琪吉春粉魯
        中國畜牧獸醫(yī)文摘 2017年4期
        關鍵詞:新諾明殺性氏桿菌

        顧 琪吉春粉魯 洋

        (1.江蘇省興化市畜牧獸醫(yī)站,江蘇興化 225700; 2.江蘇省興化市合陳畜牧獸醫(yī)站,江蘇興化 225700)

        禽霍亂病原體的分離鑒定及藥敏試驗

        顧 琪1吉春粉2魯 洋2

        (1.江蘇省興化市畜牧獸醫(yī)站,江蘇興化 225700; 2.江蘇省興化市合陳畜牧獸醫(yī)站,江蘇興化 225700)

        本文通過對某蛋雞場的疑似禽霍亂發(fā)病雞進行采集病料,經過革蘭氏和瑞氏染色涂片鏡檢、細菌的無菌分離培養(yǎng)、生化試驗、動物致病性試驗,確診該批雞患有禽霍亂。后對其進行藥敏試驗,結果顯示分離到的禽多殺性巴氏桿菌對環(huán)丙沙星和恩諾沙星高度敏感,對青霉素鉀和土霉素耐藥。為該病的診斷和防控提供了依據。

        禽霍亂 多殺性巴氏桿菌A 病原分離鑒定 藥敏試驗

        禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌A型引起的家禽和野禽一種接觸性烈性傳染病。該病通常呈急性敗血性經過和劇烈下痢,死亡率高,各種類型的禽均可感染并導致死亡。最急性型無任何臨床癥狀,死后尸體外表和內臟均無明顯變化;急性型臨床上出現無神、厭食和腹瀉等癥狀,死后可見敗血癥變化,器官、組織表現出血性炎癥。目前,該病在我國各地均有發(fā)生,是危害我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要疫病之一。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 病料

        從雞場無菌取疑似禽霍亂病雞血液、肝臟、脾臟組織作為被檢材料。試驗用小白鼠購自醫(yī)學院實驗動物中心。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        普通瓊脂平板、血瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基,生化培養(yǎng)基為本實驗室自制。

        1.1.3 藥敏紙片

        恩諾沙星、紅霉素、卡那霉素、鏈霉素、土霉素、青霉素鉀、慶大霉素、復方新諾明、環(huán)丙沙星、諾氟沙星,購自生物藥店。

        1.2 方法

        1.2.1 發(fā)病情況

        2012年5月份,某蛋雞場5000余只在無任何前期臨床癥狀下,雞群突然出現大批死亡,第1 d死亡量在百余只。第二日雞群死亡量繼續(xù)增加,并相繼出現腹瀉,精神沉郁,雞冠和肉髯腫脹、發(fā)紺,采食量減少,產蛋率下降,呼吸困難,口鼻分泌物增加,排白色水樣或淡綠色稀糞等現象,個別雞還出現呼吸困難等癥狀。

        1.2.2 病理變化

        對病死雞進行剖檢,觀察各組織器官的病理變化。

        1.2.3 細菌形態(tài)學

        無菌取病死雞心血、肝臟、脾臟等組織涂片,分別進行革蘭氏和瑞氏色染色后鏡檢。

        1.2.4 細菌分離

        無菌取病死雞心血、肝臟、脾臟分別接種普通瓊脂平板、血瓊脂平板培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h后觀察細菌的生長情況及菌落特征,取生長良好的菌落接種于血瓊脂斜面待鑒定。取上述純培養(yǎng)菌涂片,經亞甲藍染色后觀察細菌形態(tài),取所分離細菌接種于肉湯培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)24h后作為供試菌液。取菌液分別腹腔接種健康小白鼠5只,每只0.3 ml;另設對照小白鼠5只,腹腔注射營養(yǎng)肉湯。觀察結果,如出現發(fā)病或死亡立即進行涂片鏡檢和細菌分離培養(yǎng)。

        1.2.5 藥敏試驗

        用無菌棉拭子蘸取菌液,在管內壁將多余菌液旋轉擠去后在瓊脂表面均勻涂布接種3次,每次旋轉平板6O°,最后沿平板內緣涂抹1周,將平板置室溫下干燥5 min;用鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面,各紙片中心距離大于24 mm,紙片距離平板內緣大于15 mm。置37℃培養(yǎng)16h,觀察結果。

        1.2.6 體外最低抑菌濃度(MIC)的測定

        每種藥物需要10支無菌試管:第1管加肉湯1.9ml,其余各管加1.0ml;取已制備好的藥液,用吸管吸取0.1ml加入第1管中,充分混勻后吸取1.0 ml加入到第2管中,充分混勻后吸取1.0ml加到第3管中,依次進行倍比稀釋到第9管,充分混勻后吸取1.0 ml棄去;第10管不加藥液作為空白對照。向各管內加入已制備好的菌液0.05 ml,混勻后,放入37℃溫箱中培養(yǎng)18 h,觀察結果。沒有細菌生長(培養(yǎng)液澄清)的藥液最大稀釋倍數即為最低抑菌濃度(MIC)。

        2 結果

        2.1 病理變化

        剖檢可見病雞雞冠、肉髯發(fā)紺,嗉囊中有食物。心包腔蓄積有淡黃色的液體。冠狀脂肪及心外膜有大小不一的出血點和出血斑。肝腫大,質脆,呈棕黃色,表面分布針尖大小的灰黃色或灰白色的壞死灶。胃腸道中的變化以十二指腸的最突出,呈明顯的卡他-出血性炎的變化,黏膜紅腫,有出血點或出血斑。腺胃與肌胃交界處有條紋狀的出血斑。蛋雞卵泡變形,有嚴重的充血出血,呈半煮熟狀或空卵泡。死雞的輸卵管內有軟皮蛋、破殼蛋。

        2.2 形態(tài)特征

        革蘭氏染色可見陰性,單個或成對的短桿菌,瑞氏染色成典型的兩極著色。

        2.3 菌落特征

        分離菌在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上生長貧瘠,形成細小的菌落;在血瓊脂平板培養(yǎng)基上生長良好,經37℃培養(yǎng)24 h可見淡灰白色、邊緣整齊、表面光滑、閃光的露珠樣小菌落,直徑為1~2 mm,菌落周圍無溶血現象。

        2.4 理化特性

        對病料的理化特性做了生化試驗,結果詳見表1。

        表1 生化試驗結果

        從表1中可以看出該菌能發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、木糖、乳糖,產酸不產氣;不能發(fā)酵鼠李糖、肌醇、側金盞花,不產生H2S;MR試驗、VP試驗陰性。該結果基本與巴氏桿菌生化特征相符合。

        2.5 動物致病性試驗結果

        將病料做了動物試驗,結果詳見表2。

        表2 動物致病性試驗結果

        試驗組小白鼠精神沉郁,腹瀉,排出黃色、灰白色或綠色的稀糞,渴欲增加,口、鼻分泌物增多,且在l8~24 h內相繼死亡。取試驗組死亡小白鼠的心血、肝、脾、肺等病料觸片染色鏡檢并進行細菌分離培養(yǎng),鏡檢可見革蘭氏染色為陰性短桿菌,亞甲藍染色呈兩極著色。細菌分離培養(yǎng)后可見到典型的禽多殺性巴氏桿菌的菌落特征。對照組小白鼠飼養(yǎng)觀察7 d均健活。

        2.6 藥敏試驗結果

        選擇了10種抗菌藥做了藥敏試驗,結果詳見表3和表4。

        表3 10種抗菌藥物的抑菌圈與敏感標準

        表4 10種藥物對禽巴氏桿菌的體外抑菌活性結果

        從表4可以看出,分離到的禽多殺性巴氏桿菌對環(huán)丙沙星和恩諾沙星高度敏感,對復方新諾明、硫酸卡那霉素、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素、甲砜霉素和諾氟沙星6種藥物中度敏感,對青霉素鉀和土霉素耐藥。對復方新諾明的敏感性與選用的培養(yǎng)基密切相關,用含蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)時,復方新諾明對禽多殺性巴氏桿菌有較強的體外抗菌活性,而用無蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)時,復方新諾明對禽多殺性巴氏桿菌的體外抗菌活性明顯增強。

        2.7 抗菌藥MIC值的測定結果

        設計了抗菌藥的MTC值的判定標準,并做了檢測,結果詳見表5和表6。

        表5 抗菌藥MIC值的測定結果及判定標準

        表6 10種藥物對禽巴氏桿菌的體外抑菌活性結果

        從表6中可以看出各種抗菌藥物的MIC值從大到小依次為土霉素、青霉素鉀、復方新諾明、甲砜霉素、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星。

        3 討論

        該雞場發(fā)生本病后,曾用抗生素類藥物進行治療,但是效果不佳,說明禽多殺性巴氏桿菌比較容易產生耐藥性,進行藥物治療難以根除此病,因此也就增加了生產成本。所以在治療時應及時使用敏感藥物,從而避免耽誤治療時機。

        由于禽霍亂、雞傷寒和雞新城疫的臨床癥狀和剖檢病理變化比較相似,因此在診斷上應注意區(qū)別。雞傷寒是由雞沙門氏菌引起的家禽的敗血性傳染病,多發(fā)生于3周齡以上的青年雞和成年雞,而禽霍亂則很少在16周齡以下發(fā)生,雞傷寒一般病程較長,腹瀉嚴重,常見到肝臟腫大,呈綠褐色或青銅色,表面有粟粒狀灰白色病灶,同時還有脾腫大、膽囊腫大并充滿綠色油狀膽汁等病變,而禽霍亂則不顯著;雞新城疫是由新城疫病毒引起的疾病,具有很高的傳染率、發(fā)病率和死亡率,一年四季均可發(fā)生,顯微鏡不可見病源,臨床表現有消化道和神經癥狀,剖檢可見嗉囊充滿食物,口腔、食道和嗉囊內黏液比較多,腺胃乳頭出血明顯,胰腺常有小出血點或小壞死灶,肝臟變化不明顯,抗生素和磺胺類藥物治療無效,常采用緊急接種方法,也可用高免血清或干擾素肌注進行治療,可與禽霍亂相區(qū)別。如要確診,應進一步進行細菌學檢查。

        同時,飼養(yǎng)場應建立良好的飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生防疫制度,制定嚴格的消毒方案,加強對引進種禽的檢疫,杜絕其他家畜接近養(yǎng)殖區(qū),嚴防禽霍亂病原菌的傳入;對于那些禽霍亂常發(fā)地區(qū),應定期進行禽霍亂弱毒苗的預防接種;對發(fā)病的養(yǎng)殖群,應及時采取隔離、封鎖、治療;定期觀察雞群情況,也可以適當添加適宜的抗生素進行預防。

        [1] 馬學恩.家畜病理學.第四版[M].北京:中國農業(yè)出版社,2007:285-286.

        [2] 陸承平.獸醫(yī)微生物學.第四版[M].北京:中國農業(yè)出版社,2007:134-137.

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