顧 琪吉春粉魯 洋

(1.江蘇省興化市畜牧獸醫(yī)站,江蘇興化 225700; 2.江蘇省興化市合陳畜牧獸醫(yī)站,江蘇興化 225700)

禽霍亂病原體的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

顧 琪1吉春粉2魯 洋2

(1.江蘇省興化市畜牧獸醫(yī)站,江蘇興化 225700; 2.江蘇省興化市合陳畜牧獸醫(yī)站,江蘇興化 225700)

本文通過(guò)對(duì)某蛋雞場(chǎng)的疑似禽霍亂發(fā)病雞進(jìn)行采集病料，經(jīng)過(guò)革蘭氏和瑞氏染色涂片鏡檢、細(xì)菌的無(wú)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)，確診該批雞患有禽霍亂。后對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示分離到的禽多殺性巴氏桿菌對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星高度敏感，對(duì)青霉素鉀和土霉素耐藥。為該病的診斷和防控提供了依據(jù)。

禽霍亂 多殺性巴氏桿菌A 病原分離鑒定 藥敏試驗(yàn)

禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌A型引起的家禽和野禽一種接觸性烈性傳染病。該病通常呈急性敗血性經(jīng)過(guò)和劇烈下痢，死亡率高，各種類型的禽均可感染并導(dǎo)致死亡。最急性型無(wú)任何臨床癥狀，死后尸體外表和內(nèi)臟均無(wú)明顯變化；急性型臨床上出現(xiàn)無(wú)神、厭食和腹瀉等癥狀，死后可見(jiàn)敗血癥變化，器官、組織表現(xiàn)出血性炎癥。目前，該病在我國(guó)各地均有發(fā)生，是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要疫病之一。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

從雞場(chǎng)無(wú)菌取疑似禽霍亂病雞血液、肝臟、脾臟組織作為被檢材料。試驗(yàn)用小白鼠購(gòu)自醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

普通瓊脂平板、血瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基，生化培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.3 藥敏紙片

恩諾沙星、紅霉素、卡那霉素、鏈霉素、土霉素、青霉素鉀、慶大霉素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、諾氟沙星，購(gòu)自生物藥店。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)病情況

2012年5月份，某蛋雞場(chǎng)5000余只在無(wú)任何前期臨床癥狀下，雞群突然出現(xiàn)大批死亡，第1 d死亡量在百余只。第二日雞群死亡量繼續(xù)增加，并相繼出現(xiàn)腹瀉，精神沉郁，雞冠和肉髯腫脹、發(fā)紺，采食量減少，產(chǎn)蛋率下降，呼吸困難，口鼻分泌物增加，排白色水樣或淡綠色稀糞等現(xiàn)象，個(gè)別雞還出現(xiàn)呼吸困難等癥狀。

1.2.2 病理變化

對(duì)病死雞進(jìn)行剖檢，觀察各組織器官的病理變化。

1.2.3 細(xì)菌形態(tài)學(xué)

無(wú)菌取病死雞心血、肝臟、脾臟等組織涂片，分別進(jìn)行革蘭氏和瑞氏色染色后鏡檢。

1.2.4 細(xì)菌分離

無(wú)菌取病死雞心血、肝臟、脾臟分別接種普通瓊脂平板、血瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況及菌落特征，取生長(zhǎng)良好的菌落接種于血瓊脂斜面待鑒定。取上述純培養(yǎng)菌涂片，經(jīng)亞甲藍(lán)染色后觀察細(xì)菌形態(tài)，取所分離細(xì)菌接種于肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h后作為供試菌液。取菌液分別腹腔接種健康小白鼠5只，每只0.3 ml；另設(shè)對(duì)照小白鼠5只，腹腔注射營(yíng)養(yǎng)肉湯。觀察結(jié)果，如出現(xiàn)發(fā)病或死亡立即進(jìn)行涂片鏡檢和細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后在瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板6O°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周，將平板置室溫下干燥5 min；用鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心距離大于24 mm，紙片距離平板內(nèi)緣大于15 mm。置37℃培養(yǎng)16h，觀察結(jié)果。

1.2.6 體外最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

每種藥物需要10支無(wú)菌試管：第1管加肉湯1.9ml，其余各管加1.0ml；取已制備好的藥液，用吸管吸取0.1ml加入第1管中，充分混勻后吸取1.0 ml加入到第2管中，充分混勻后吸取1.0ml加到第3管中，依次進(jìn)行倍比稀釋到第9管，充分混勻后吸取1.0 ml棄去；第10管不加藥液作為空白對(duì)照。向各管內(nèi)加入已制備好的菌液0.05 ml，混勻后，放入37℃溫箱中培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)（培養(yǎng)液澄清）的藥液最大稀釋倍數(shù)即為最低抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果

2.1 病理變化

剖檢可見(jiàn)病雞雞冠、肉髯發(fā)紺，嗉囊中有食物。心包腔蓄積有淡黃色的液體。冠狀脂肪及心外膜有大小不一的出血點(diǎn)和出血斑。肝腫大，質(zhì)脆，呈棕黃色，表面分布針尖大小的灰黃色或灰白色的壞死灶。胃腸道中的變化以十二指腸的最突出，呈明顯的卡他-出血性炎的變化，黏膜紅腫，有出血點(diǎn)或出血斑。腺胃與肌胃交界處有條紋狀的出血斑。蛋雞卵泡變形，有嚴(yán)重的充血出血，呈半煮熟狀或空卵泡。死雞的輸卵管內(nèi)有軟皮蛋、破殼蛋。

2.2 形態(tài)特征

革蘭氏染色可見(jiàn)陰性，單個(gè)或成對(duì)的短桿菌，瑞氏染色成典型的兩極著色。

2.3 菌落特征

分離菌在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)貧瘠，形成細(xì)小的菌落；在血瓊脂平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h可見(jiàn)淡灰白色、邊緣整齊、表面光滑、閃光的露珠樣小菌落，直徑為1～2 mm，菌落周圍無(wú)溶血現(xiàn)象。

2.4 理化特性

對(duì)病料的理化特性做了生化試驗(yàn)，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

從表1中可以看出該菌能發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、木糖、乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不能發(fā)酵鼠李糖、肌醇、側(cè)金盞花，不產(chǎn)生H2S；MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)陰性。該結(jié)果基本與巴氏桿菌生化特征相符合。

2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

將病料做了動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小白鼠精神沉郁，腹瀉，排出黃色、灰白色或綠色的稀糞，渴欲增加，口、鼻分泌物增多，且在l8～24 h內(nèi)相繼死亡。取試驗(yàn)組死亡小白鼠的心血、肝、脾、肺等病料觸片染色鏡檢并進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，鏡檢可見(jiàn)革蘭氏染色為陰性短桿菌，亞甲藍(lán)染色呈兩極著色。細(xì)菌分離培養(yǎng)后可見(jiàn)到典型的禽多殺性巴氏桿菌的菌落特征。對(duì)照組小白鼠飼養(yǎng)觀察7 d均健活。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選擇了10種抗菌藥做了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果詳見(jiàn)表3和表4。

表3 10種抗菌藥物的抑菌圈與敏感標(biāo)準(zhǔn)

表4 10種藥物對(duì)禽巴氏桿菌的體外抑菌活性結(jié)果

從表4可以看出，分離到的禽多殺性巴氏桿菌對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星高度敏感，對(duì)復(fù)方新諾明、硫酸卡那霉素、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素、甲砜霉素和諾氟沙星6種藥物中度敏感，對(duì)青霉素鉀和土霉素耐藥。對(duì)復(fù)方新諾明的敏感性與選用的培養(yǎng)基密切相關(guān)，用含蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，復(fù)方新諾明對(duì)禽多殺性巴氏桿菌有較強(qiáng)的體外抗菌活性，而用無(wú)蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，復(fù)方新諾明對(duì)禽多殺性巴氏桿菌的體外抗菌活性明顯增強(qiáng)。

2.7 抗菌藥MIC值的測(cè)定結(jié)果

設(shè)計(jì)了抗菌藥的MTC值的判定標(biāo)準(zhǔn)，并做了檢測(cè)，結(jié)果詳見(jiàn)表5和表6。

表5 抗菌藥MIC值的測(cè)定結(jié)果及判定標(biāo)準(zhǔn)

表6 10種藥物對(duì)禽巴氏桿菌的體外抑菌活性結(jié)果

從表6中可以看出各種抗菌藥物的MIC值從大到小依次為土霉素、青霉素鉀、復(fù)方新諾明、甲砜霉素、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星。

3 討論

該雞場(chǎng)發(fā)生本病后，曾用抗生素類藥物進(jìn)行治療，但是效果不佳，說(shuō)明禽多殺性巴氏桿菌比較容易產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)行藥物治療難以根除此病，因此也就增加了生產(chǎn)成本。所以在治療時(shí)應(yīng)及時(shí)使用敏感藥物，從而避免耽誤治療時(shí)機(jī)。

由于禽霍亂、雞傷寒和雞新城疫的臨床癥狀和剖檢病理變化比較相似，因此在診斷上應(yīng)注意區(qū)別。雞傷寒是由雞沙門氏菌引起的家禽的敗血性傳染病，多發(fā)生于3周齡以上的青年雞和成年雞，而禽霍亂則很少在16周齡以下發(fā)生，雞傷寒一般病程較長(zhǎng)，腹瀉嚴(yán)重，常見(jiàn)到肝臟腫大，呈綠褐色或青銅色，表面有粟粒狀灰白色病灶，同時(shí)還有脾腫大、膽囊腫大并充滿綠色油狀膽汁等病變，而禽霍亂則不顯著；雞新城疫是由新城疫病毒引起的疾病，具有很高的傳染率、發(fā)病率和死亡率，一年四季均可發(fā)生，顯微鏡不可見(jiàn)病源，臨床表現(xiàn)有消化道和神經(jīng)癥狀，剖檢可見(jiàn)嗉囊充滿食物，口腔、食道和嗉囊內(nèi)黏液比較多，腺胃乳頭出血明顯，胰腺常有小出血點(diǎn)或小壞死灶，肝臟變化不明顯，抗生素和磺胺類藥物治療無(wú)效，常采用緊急接種方法，也可用高免血清或干擾素肌注進(jìn)行治療，可與禽霍亂相區(qū)別。如要確診，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查。

同時(shí)，飼養(yǎng)場(chǎng)應(yīng)建立良好的飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生防疫制度，制定嚴(yán)格的消毒方案，加強(qiáng)對(duì)引進(jìn)種禽的檢疫，杜絕其他家畜接近養(yǎng)殖區(qū)，嚴(yán)防禽霍亂病原菌的傳入；對(duì)于那些禽霍亂常發(fā)地區(qū)，應(yīng)定期進(jìn)行禽霍亂弱毒苗的預(yù)防接種；對(duì)發(fā)病的養(yǎng)殖群，應(yīng)及時(shí)采取隔離、封鎖、治療；定期觀察雞群情況，也可以適當(dāng)添加適宜的抗生素進(jìn)行預(yù)防。

[1] 馬學(xué)恩.家畜病理學(xué).第四版[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：285-286.

[2] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué).第四版[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：134-137.