廖德芳，苗海生，李 樂，寇美玲，王文華，沙麗東，李國(guó)華，李華春

（1. 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224；2. 元陽(yáng)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南元陽(yáng) 662400；3. 富民縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南富民 650400；4. 墨江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南墨江 654800）

云南省邊境地區(qū)口蹄疫抗體檢測(cè)

廖德芳1，苗海生1，李 樂1，寇美玲1，王文華2，沙麗東3，李國(guó)華4，李華春1

（1. 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224；2. 元陽(yáng)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南元陽(yáng) 662400；3. 富民縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南富民 650400；4. 墨江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南墨江 654800）

應(yīng)用口蹄疫O、A、Asia-1型cELISA抗體檢測(cè)試劑盒和口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體單抗阻斷ELISA試劑盒，對(duì)采集自云南省10個(gè)邊境縣的牛和豬血清進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，?？谔阋逴、A、Asia-1型抗體陽(yáng)性率分別在9.23%～37.75%、3.00%～23.57%、9.75%～48.67%之間，陽(yáng)性率偏低，并且地區(qū)間差異較大。非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率在14.16%～51.00%之間，其中勐海為51.00%、芒市為48.96%，動(dòng)物帶毒風(fēng)險(xiǎn)較大。境內(nèi)牛與境外入境?？谔阋逴、A、Asia-1型抗體陽(yáng)性率基本相當(dāng)，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率略高于境內(nèi)牛。由于入境牛免疫率較低，須加大對(duì)入境牛的監(jiān)控。黃牛和水?？谔阋逴、A、Asia-1型抗體陽(yáng)性率基本一致，但黃牛非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為36.47%，水牛為26.86%，黃牛陽(yáng)性率顯著高于水牛，這可能是因?yàn)樵颇鲜∵吘车貐^(qū)的黃牛主要來(lái)自印度、孟加拉國(guó)，經(jīng)緬甸進(jìn)入我國(guó)。豬口蹄疫血清抗體陽(yáng)性率較低，除芒市O型口蹄疫抗體陽(yáng)性率達(dá)到81.00%外，其余均在0～6.00%之間，這可能與云南省近年來(lái)大量免疫合成肽疫苗有關(guān)。建議加強(qiáng)云南省邊境地區(qū)的口蹄疫防控工作，提高口蹄疫免疫密度和抗體水平，嚴(yán)控邊境地區(qū)口蹄疫易感動(dòng)物的無(wú)序流動(dòng)。

口蹄疫；邊境地區(qū)；抗體檢測(cè)

云南省地處我國(guó)西南部，有26個(gè)邊境縣分別與緬甸、越南、老撾接壤，邊境線長(zhǎng)4 061 km，有11個(gè)國(guó)家級(jí)口岸、9個(gè)省級(jí)口岸和近百條邊境通道，與周邊國(guó)家乃至東南亞、南亞的其他國(guó)家和地區(qū)交往頻繁，是我國(guó)溝通東南亞、南亞地區(qū)的主要陸上通道。與云南省接壤的東南亞國(guó)家的口蹄疫防控意識(shí)薄弱，防控水平較低，口蹄疫疫情不斷發(fā)生，動(dòng)物帶毒情況較普遍[1]。近年來(lái)，由于國(guó)內(nèi)豬、牛肉價(jià)格較高，每年有大量豬、牛通過口岸或邊境線進(jìn)入我國(guó)境內(nèi)，因此云南省邊境地區(qū)的口蹄疫疫情防控形勢(shì)嚴(yán)峻。為掌握云南省邊境地區(qū)牛、豬口蹄疫疫苗免疫效果，本調(diào)查應(yīng)用口蹄疫C-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（O、A、Asia-1型）和口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體單抗阻斷ELISA試劑盒，對(duì)2015年底和2016年初采集自云南省10個(gè)邊境縣（市）的境內(nèi)和入境牛血清2 799份、豬血清800份進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，評(píng)估當(dāng)?shù)乜谔阋呙庖郀顩r和傳入風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 血清采集

血清樣本采自云南省景洪、勐臘、勐海、孟連、滄源、鎮(zhèn)康、耿馬、芒市、瑞麗、富寧等10個(gè)邊境縣的散養(yǎng)戶、養(yǎng)殖場(chǎng)、交易市場(chǎng)，由當(dāng)?shù)乜h級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)樣本采集。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 口蹄疫O、A、Asia-1型血清抗體檢測(cè)。采用相應(yīng)血清型檢測(cè)試劑盒，對(duì)3種口蹄疫血清型進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒均為云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院自行研制，各試劑盒操作方法相同。取出試劑盒內(nèi)的ELISA抗原固定板，置室溫15 min；用試劑盒提供的稀釋液按1:1 000倍稀釋競(jìng)爭(zhēng)抗體，在稀釋板上按每孔120 μL加入稀釋好的競(jìng)爭(zhēng)抗體，然后在每個(gè)孔中加30 μL待檢血清，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性血清對(duì)照，充分混勻；將1:5稀釋的待檢血清和陰陽(yáng)性對(duì)照血清轉(zhuǎn)移到活化好的ELISA板上，50 μL每孔，每個(gè)待檢樣品2孔，將稀釋板上剩余的50 μL棄去；37 ℃溫育1 h，用PBST洗液洗板3次，拍干；用稀釋液按1:1 000稀釋兔抗豚鼠酶標(biāo)二抗，每孔50 μL，37 ℃溫育30 min，用PBST洗液洗板5次，拍干；每孔加50 μL底物反應(yīng)液，室溫避光或37 ℃避光溫育10～15 min，然后每孔再加50 μL終止液；立即在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值（OD值）。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD值≥0.8，陽(yáng)性對(duì)照孔OD值≤0.3時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立，否者不成立；根據(jù)抑制率=1－樣品OD值/陰性血清OD值平均數(shù)，當(dāng)抑制率≥40%時(shí)判為陽(yáng)性，當(dāng)抑制率＜40%時(shí)判為陰性。

1.2.2 口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)。采用口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體單抗阻斷ELISA試劑盒（北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)CB20151201）對(duì)牛血清進(jìn)行口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定：按照阻斷率=（陰性對(duì)照OD450平均值－樣品孔OD450平均值）/陰性對(duì)照OD450平均值×100%進(jìn)行計(jì)算，陽(yáng)性對(duì)照OD450平均值≥55%、陰性對(duì)照OD450平均值－陽(yáng)性對(duì)照OD450值≥0.6時(shí)檢測(cè)成立，當(dāng)被檢樣品阻斷率≥40%時(shí)判為陽(yáng)性，當(dāng)被檢樣品阻斷率在25%～40%間時(shí)判為可疑，否者為陰性。

1.3 檢測(cè)結(jié)果分析

分別按地區(qū)、畜種、飼養(yǎng)方式、境內(nèi)外家畜進(jìn)行口蹄疫抗體統(tǒng)計(jì)分析，其中對(duì)畜種、飼養(yǎng)方式、境內(nèi)外家畜的統(tǒng)計(jì)分析僅針對(duì)牛。

2 結(jié)果

2.1 口蹄疫牛血清抗體陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

2.1.1 不同地區(qū)牛的口蹄疫抗體統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，?？谔阋逴、A、Asia-1型抗體陽(yáng)性率分別在9.23%～37.75%、3.00%～23.57%、9.75%～48.67%之間，陽(yáng)性率顯著偏低，并且地區(qū)間差異較大。非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率在14.16%～51%之間，其中勐海為51.00%、芒市為48.96%，動(dòng)物帶毒風(fēng)險(xiǎn)較大（表1）。

表1 各地區(qū)牛口蹄疫血清抗體調(diào)查統(tǒng)計(jì)（單位：份/%）

2.1.2 境內(nèi)牛和入境?？谔阋呖贵w統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：境內(nèi)牛O、A、Asia-1型抗體陽(yáng)性率分別為23.43%、9.4%、39.72%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為25.56%；入境牛O、A、Asia-1型抗體陽(yáng)性率分別為30.5%、7.5%、26.75%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為28.33%；背景不詳牛O、A、Asia-1型抗體陽(yáng)性率分別為32.96%、6.24%、30.34%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為45.06%（表2）。鑒于云南省邊境地區(qū)實(shí)際情況，背景不詳?shù)呐O有可能也來(lái)自國(guó)外。

表2 境內(nèi)牛和入境?？谔阋呖贵w統(tǒng)計(jì)（單位：份/%）

2.1.3 不同品種牛的口蹄疫抗體統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：黃牛的O、A、Asia-1型抗體陽(yáng)性率分別為33.99%、5.75%、19.52%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為36.47%，免疫效果較差，非結(jié)構(gòu)蛋白陽(yáng)性率偏高；水牛O、A、Asia-1型抗體陽(yáng)性率分別為32.26%、5.91%、26.01%，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為26.86%，免疫效果與黃牛基本一致，非結(jié)構(gòu)蛋白陽(yáng)性率比黃牛低（表3）。

表3 不同品種牛的口蹄疫抗體統(tǒng)計(jì)（單位：份/%）

2.2 口蹄疫豬血清抗體陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

豬血清口蹄疫抗體陽(yáng)性率較低，除芒市O型口蹄疫抗體陽(yáng)性率達(dá)81.00%外，其余均在0～6.00%之間，這可能是因?yàn)樵颇鲜〗陙?lái)大量免疫合成肽疫苗，普通ELISA抗體檢測(cè)試劑盒無(wú)法檢出抗體（表4）。

表4 豬口蹄疫血清抗體統(tǒng)計(jì)（單位：份/%）

3 討論

本次調(diào)查選取云南省10個(gè)具有代表性的邊境縣（區(qū)）進(jìn)行口蹄疫O、A、Asia-1型以及非結(jié)構(gòu)蛋白抗體監(jiān)測(cè)，共檢測(cè)了2 799份牛血清、800份豬血清，區(qū)域涉及德宏州、臨滄市、普洱市、西雙版納州，動(dòng)物來(lái)源涉及入境牛、境內(nèi)飼養(yǎng)牛，動(dòng)物種類涉及黃牛、水牛以及本地飼養(yǎng)豬。

監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，?？谔阋逴型、A型、Asia-1型總體血清抗體陽(yáng)性率偏低，未能達(dá)到可以有效抵抗口蹄疫病毒傳播的標(biāo)準(zhǔn)，口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率偏高，平均達(dá)34.67%，牛隱性帶毒風(fēng)險(xiǎn)極大。隱性帶毒或者持續(xù)性感染是造成口蹄疫難以根除的一個(gè)重要原因，對(duì)此必須引起足夠的重視。不同縣（區(qū)）間口蹄疫抗體陽(yáng)性率差異較大，這在一定程度上可以反映出該地區(qū)的口蹄疫疫苗免疫效果，但也不排除采樣時(shí)在動(dòng)物和時(shí)間選擇方面的影響，畢竟樣品數(shù)量有限。境內(nèi)?？谔阋叻墙Y(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為25.56%，外來(lái)牛陽(yáng)性率為28.33%，略高于境內(nèi)牛，但對(duì)于經(jīng)緬甸、印度、孟加拉等國(guó)家進(jìn)入我國(guó)境內(nèi)的牛，由于其原產(chǎn)國(guó)的獸醫(yī)防疫體系嚴(yán)重落后，生物制品生產(chǎn)能力低下，大多不免疫，因此感染口蹄疫風(fēng)險(xiǎn)較高。黃牛和水牛口蹄疫O、A、Asia-1型抗體陽(yáng)性率基本一致，但黃牛非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率顯著高于水牛，這可能是因?yàn)樵颇线吘车貐^(qū)的黃牛主要來(lái)自印度、孟加拉國(guó)，其經(jīng)緬甸進(jìn)入我國(guó)。

本次豬口蹄疫抗體抽樣檢測(cè)結(jié)果顯示，除芒市O型口蹄疫抗體陽(yáng)性率達(dá)81.00%外，其余均在0～6.00%之間。經(jīng)了解芒市著重免疫了口蹄疫O型單價(jià)滅活疫苗，檢測(cè)結(jié)果與當(dāng)?shù)氐墓ぷ髦攸c(diǎn)一致。其它地區(qū)免疫背景不詳，但云南省近年來(lái)大量免疫豬口蹄疫合成肽疫苗，普通口蹄疫ELISA抗體檢測(cè)試劑盒無(wú)法檢出其抗體。

近年來(lái)，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)口蹄疫疫情流行的毒株均來(lái)自于境外，因此我國(guó)防堵境外口蹄疫流行毒株的任務(wù)越來(lái)越重要[2]。建議繼續(xù)加強(qiáng)云南省邊境地區(qū)口蹄疫防控工作，提高口蹄疫免疫密度和抗體水平，嚴(yán)控邊境地區(qū)口蹄疫易感動(dòng)物的無(wú)序流動(dòng)，降低境外口蹄疫病毒對(duì)國(guó)內(nèi)家畜的威脅。

[1] KLEIN J. Understanding the molecular epidemiology of foot-and-mouth-disease virus[J]. Infection，Genetics and Evolution，2009，9（92）：153-161.

[2]何繼軍，楊亞民，馬維民，等. 我國(guó)O型Mya-98口蹄疫病毒流行情況與毒株分析[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2014，31（5）：45-50.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Antibody Detection of Foot-and-mouth Disease in Border Areas of Yunnan Province

Liao Defang1，Miao Haisheng1，Li Le1，Kou Meiling1，Wang Wenhua2，Sha Lidong3，Li Guohua4，Li Huachun1
（1. Yunnan Academy of Sciences of Animal Husbandry and Veterinary，Kunming，Yunnan 650224；2. Yuanyang Animal Disease Prevention and Control Center，Yuanyang，Yunnan 662400；3. Fumin Animal Disease Prevention and Control Center，F(xiàn)umin，Yunnan 650400；4. Mojiang Animal Disease Prevention and Control Center，Mojiang，Yunnan 654800）

By using cELISA kits to detect antibodies against foot-and-mouth disease（FMD）type O，A，Asia-1，as well as the monoclonal antibody blocking ELISA kits to detect non-structural protein of FMDV，serum samples of bovine and swine that were collected from 10 border counties of Yunnan province were tested. Results showed that the FMD type O，A，Asia-1 antibody positive rates of cattle were 9.23%～9.23%，3.00%～23.57%，23.57%～48.67%，respectively，showing low levels，and the regional differences were relatively large. On the other side，the antibody positive rates of nonstructural protein were in the range of 14.16%～51.00%，specifically，the rate in Menghai was 51.00%，in Mangshi was 48.96%. Besides，a high risk of animals carrying FMDV was observed. As to the cattle both in and outside borders，the antibody levels against type O，A，Asia-1 were basically the same，while antibodies against nonstructural protein were higher in cattle outside the borders. Given the immunization rate of entry cattle was relatively low，monitoring for these cattle should be strengthened. Antibody positive rates of type O，A，Asia-1 between cattle and buffaloes also showed basic consistent results. Unlike that，the antibody positive rate of nonstructuralprotein in battle was 36.47%，while in buffalo it was 26.86%. The reason caused this significant difference may related to the fact that cattle in Yunnan border areas were mostly transported from India and Bangladesh via Myanma. Antibody positive rate of FMD of swine was low，ranges of 0～6.00% were detected in most counties except a rate of 81.00% against type O of FMD in Mang city，immunization with synthetic peptide vaccines in great quantities may be responsible for these results. At the end，suggestions were put forward，including strengthening FMD prevention and control，intensifying vaccination and enhancing the antibody levels，as well as strictly controlling the unordered fl ow of susceptible bovines in border areas.

Foot-and-mouth disease；border area；antibody detection

S851.3

：B

：1005-944X（2017）05-0025-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.05.007

國(guó)家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201103008）

李華春