吳利春 涂浩 段麗 佘慧宇 張偉 張長城 袁丁 劉朝奇

摘要：目的 觀察木瓜提取物對小鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的影響，探討其可能的分子機(jī)制。方法 將40只雄性昆明小鼠隨機(jī)分成正常組、模型組和藥物低（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）劑量組。正常組給予普通飼料，其他組給予高糖高脂飼養(yǎng)造模，4周后處死，檢測體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、血清相關(guān)指標(biāo)及肝臟三酰甘油（TG）水平，HE及油紅O染色觀察肝臟組織形態(tài)，RT-PCR和Western blot檢測脂代謝相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠肝臟明顯增大，肝指數(shù)明顯升高（P<0.01），附睪脂肪指數(shù)明顯升高（P<0.05）；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖水平升高（P<0.05）；肝臟TG水平升高（P<0.05）；病理結(jié)果顯示，肝臟脂肪變性明顯；RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，模型組肝臟組織SIRT1、FoxO1表達(dá)水平下調(diào)，SERBP-1c表達(dá)水平上調(diào)。與模型組比較，藥物低、高劑量組脂肪肝病理損傷明顯改善，肝指數(shù)、肝臟TG含量均下降，SIRT1和FoxO1表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論 木瓜提取物對高糖高脂誘導(dǎo)的NAFLD有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過SIRT1-FoxO1信號通路發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：木瓜提取物；非酒精性脂肪性肝??；脂質(zhì)代謝；SIRT1信號通路；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.012

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）05-0048-04

Effects of Extracted Active Components of Chaenomeles Speciosa on Non-alcoholic Fatty Liver Disease in Model Mice induced by High-fat–high-fructose Diet WU Li-chun1， TU Hao1， DUAN Li1， SHE Hui-yu2， ZHANG Wei1， ZHANG Chang-cheng2， YUAN Ding2， LIU Chao-qi1 （1. Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy， Yichang 443002， China； 2. Medical College， China Three Gorges University， Yichang 443002， China）

Abstract： Objective To study the effects of extracted active components of Chaenomeles Speciosa （EACCS） on non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） in mice； To discuss the possible molecular mechanism. Methods Forty male KM mice were randomized into four groups， namely normal group， model group， low-dose （50 mg/kg） EACCS group and high-dose （100 mg/kg） EACCS group. Except that the normal group was daily given routine diet， the other groups were given high-fat–high-fructose diet （HFFD）. The mice were put to death 4 weeks later. Body weight， liver weight and serum TG were measured. HE and oil red O staining were used to observe liver tissue morphology. RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of lipid metabolism related genes. Results Compared with the normal group， the liver size， liver index （P<0.01） and epididymal fat index （P<0.05） increased significantly； The ALT and GLU in serum increased （P<0.05）， TG increased （P<0.05）， and pathological findings showed significant steatosis； RT-PCR and Western blot showed that the expression levels of SIRT1 and FoxO1 mRNA decreased and the level of SERBP-1c increased in the model group. Compared with the model group， the hepatic lipid accumulation of EACCS groups was obviously improved， and the serum ALT， GLU， and TG levels significantly decreased， the expression levels of hepatic SIRT1 and FoxO1 mRNA increased. Conclusion EACCS has protective effects on NAFLD mice induced by HFFD， and its mechanism may be related to the activation of SIRT1-FoxO1 signaling pathway in the liver tissues.

Key words： Chaenomeles Speciosa extracts； non-alcoholic fatty liver disease； lipid metabolism； SIRT1 signaling pathway； mice

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指無飲酒或每周飲酒低于140 g，由其他各種原因?qū)е碌母渭?xì)胞脂肪變性，三酰甘油（TG）明顯升高，進(jìn)一步發(fā)展成脂肪性肝炎、肝纖維化甚至肝癌的一組臨床綜合征。隨著我國居民生活水平不斷提高，體力勞動減少，NAFLD發(fā)病率逐年上升，大、中城市普通成人的NAFLD發(fā)病率高達(dá)20%[1]，至今尚無有效的干預(yù)措施。因此，急需尋找有效手段防治NAFLD。木瓜是薔薇科植物貼梗海棠近成熟果實，味酸、性溫、歸肝脾經(jīng)，具有祛濕舒筋、平肝和胃的作用[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，木瓜對小鼠NAFLD具有良好的干預(yù)作用[3]。為此，本實驗對木瓜進(jìn)行提取分離，進(jìn)一步研究該藥物有效成分對NAFLD的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料

雄性昆明小鼠40只，SPF級，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，三峽大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃、相對濕度50%～80%、明暗交替12 h/12 h環(huán)境，自由攝食飲水，每2 d稱重1次。高糖高脂飼料：按照56.5%普通飼料、30%果糖、10%豬油、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉的比例壓制而成。

1.2 藥物及制備

將木瓜塊粉碎成粗粉后按料液比1∶10加入60%乙醇，浸泡2 h，水浴回流提取3次，每次2 h，過濾。合并3次濾液，減壓回收乙醇至無醇味。取木瓜提取液適量，通過大孔樹脂進(jìn)一步分離，應(yīng)用梯度乙醇作為移動相，收集相應(yīng)洗脫液，進(jìn)行濃縮、干燥，獲取不同組分木瓜提取物。本實驗中應(yīng)用的是在細(xì)胞水平已篩選活性較好的10%乙醇洗脫組分，命名為10%醇木瓜組分，用于后續(xù)實驗。

1.3 主要試劑與儀器

膽固醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，大連寶生物科技有限公司提供；PCR引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成；兔單抗β-actin（sc-4778），兔多抗FoxO3a（ab1096290），美國Santa Cruz公司；兔多抗SIRT1（#07-131），Millipore公司；羊抗兔二抗，武漢科瑞有限公司提供；顯影化學(xué)發(fā)光劑ECL，碧云天生物技術(shù)研究所。Powerpas Basic蛋白電泳儀器，美國伯樂公司；梯度PCR儀，德國Applied Biosysterms公司；Gellogic 200凝膠成像分析系統(tǒng)，美國柯達(dá)公司。

1.4 造模

將40只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和藥物低、高劑量組，每組10只。除正常組給予普通飼料外，其余各組均給予高糖高脂飼料造模，藥物低、高劑量組分別給予50、100 mg/kg藥物灌胃，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃。給藥體積0.5 mL/d，連續(xù)4周。

1.5 血清及肝臟生化指標(biāo)測定

小鼠脫頸椎處死，眼球取血，室溫靜置30 min，3000 r/min離心10 min后取血清，按葡萄糖（GLU）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。稱取100 mg肝臟組織，加入900 μL 95%異丙醇于冰上研磨，室溫靜置2 h，4 ℃、2000 r/min離心4 min，取上清液，并按試劑盒說明書檢測TG含量。

1.6 肝指數(shù)及附睪脂肪指數(shù)測定

處死小鼠前稱重，處死后完整取下肝臟及附睪脂肪組織，分別稱重，計算肝指數(shù)（肝臟質(zhì)量÷體質(zhì)量）和附睪脂肪指數(shù)（附睪脂肪質(zhì)量÷體質(zhì)量）。

1.7 肝組織HE和油紅O染色

取10 mm×3 mm新鮮肝臟大葉放入包埋盒中，于10%中性甲醛溶液中固定24 h，用水清洗后經(jīng)梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片（厚度4 μm），HE染色，顯微鏡下觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及病理變化。取新鮮肝臟作冰凍切片，油紅O染色，顯微鏡下觀察肝細(xì)胞脂肪變性情況。

1.8 RT-PCR檢測肝組織mRNA表達(dá)

應(yīng)用試劑盒提取總RNA，測定濃度，通過電泳觀察RNA的完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲得cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系總體積為25 ?L：10.5 ?L DEPC水，12.5 ?L PCR Master mix（2×），加入SIRT1、FoxO1、SREBP、GAPDH引物上下游各0.5 ?L，最后加入cDNA模板1 ?L。使用GAPDH作為內(nèi)參。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)測定灰度平均值，以樣品各基因的灰度值與其內(nèi)參照GAPDH的比值代表其mRNA相對量。

1.9 Western blot檢測肝組織蛋白表達(dá)

稱取50～100 mg肝臟組織勻漿后，加入蛋白裂解液提取總蛋白。95 ℃變性5～10 min，SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜，再5%牛奶封閉，4 ℃一抗孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯色。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描分析，以樣品各基因的灰度值與其內(nèi)參照β-actin的比值代表蛋白相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木瓜提取物對模型小鼠相關(guān)指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組肝臟指數(shù)、附睪脂肪指數(shù)、肝臟TG含量及血清GLU、ALT水平明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，藥物各劑量組均有不同程度改善，其中藥物高劑量組肝臟指數(shù)、附睪脂肪指數(shù)及血清ALT、GLU水平明顯降低（P<0.05，P<0.01），藥物低劑量組肝臟TG含量明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見表2。