張曉藝, 張秀堯*, 蔡欣欣, 李瑞芬, 林學(xué)堯, 林 潔

(1. 溫州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 溫州 325001; 2. 瑞安市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 瑞安 325200)

研究論文

二維超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用快速測定全血和尿液中魚藤酮

張曉藝1, 張秀堯1*, 蔡欣欣1, 李瑞芬1, 林學(xué)堯2, 林 潔2

(1. 溫州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 溫州 325001; 2. 瑞安市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 瑞安 325200)

建立了采用二維超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用快速測定全血和尿液中魚藤酮的檢測方法。尿液經(jīng)水等量稀釋后直接進樣分析;全血用乙腈沉淀除蛋白質(zhì),上清液用水稀釋后進樣分析。樣品中的魚藤酮被Cyclone柱保留并去除大分子雜質(zhì),然后再被流動相洗入第1維Kinetex Biphenyl色譜柱(聯(lián)苯基核殼柱)進行分離,再將含有魚藤酮的流分切割至第2維Acquity BEH C8色譜柱上進行分離,采用多離子監(jiān)測觸發(fā)的增強子離子(MRM-IDA-EPI)掃描方式檢測,溶劑標準外標法定量。全血和尿液中的平均加標回收率分別為84.6%～94.3%和88.4%～95.7%,相對標準偏差為2.6%～7.3%和2.8%～6.8%(n=6),方法的檢出限為0.2和0.03 μg/L。該方法已成功應(yīng)用于魚藤酮中毒樣品的檢測。

二維超高效液相色譜;三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜;中心切割;魚藤酮;全血;尿液

魚藤酮(rotenone)屬雙氫異黃酮衍生物(見圖1),存在于熱帶及亞熱帶地區(qū)豆科魚藤屬和豆薯屬植物中,如地瓜籽、苦檀子等,曾一直被認為是安全有效的農(nóng)用殺蟲劑,具有高效、低毒、廣譜、殺蟲快、殘留期短等特點,廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物病蟲害的防治和魚塘清理。但最近的研究表明魚藤酮是線粒體復(fù)合體Ⅰ的抑制劑,具有多巴胺神經(jīng)元毒性,可以使大鼠產(chǎn)生與帕金森病相似的癥狀,如運動遲緩、肌肉僵直、震顫等。對于人類,魚藤酮屬中等毒性毒物,口服致死量約為300～500 mg/kg體重[1-4]。中毒時先興奮延髓中樞,引起呼吸中樞興奮和驚厥,繼而發(fā)生呼吸中樞及血管運動中樞麻痹,大劑量時可直接抑制心臟,使心跳減慢,最終導(dǎo)致死亡。

圖 1 魚藤酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of rotenone

魚藤酮的檢測方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)法[5-7]、液相色譜紫外檢測法[8,9]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]等,但以上方法的測定對象多為食物和植物。有報道[11]采用LC-MS/MS法測定人血清中的魚藤酮,檢出限達2 μg/L,但該法測定的是血清,與全血中魚藤酮的含量并不一定相關(guān),且未應(yīng)用于實際樣品的測定。

二維超高效液相色譜(two-dimensional ultra performance liquid chromatography, 2D-UPLC)技術(shù)具有峰容量大、能夠顯著降低復(fù)雜樣品基質(zhì)效應(yīng)、可實現(xiàn)樣品分析自動化等優(yōu)點,已成為復(fù)雜樣品分離分析的有力工具,在中藥有效成分分析、環(huán)境科學(xué)、藥物分析等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[12]。本研究采用中心切割二維超高效液相色譜技術(shù)同時對樣品進行凈化和分離,消除了基質(zhì)效應(yīng),使用三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)進行檢測,建立了全血和尿液中魚藤酮的檢測方法,方法簡便、靈敏、準確。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

二維超高效液相色譜儀由Acquity UPLC QSM四元溶劑管理系統(tǒng)(第1維)、Acquity UPLC BSM二元溶劑管理系統(tǒng)(第2維)、Acquity UPLC FTN樣品管理系統(tǒng)和Acquity UPLC CM-A色譜柱管理系統(tǒng)組成,稀釋泵為515泵,由Empower 3工作站控制(美國Waters公司); QTRAP 6500三重四極桿/復(fù)合線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀由Analyst 1.6.2軟件控制(美國AB SCIEX公司);MS3旋渦混旋器(德國IKA-WERKE公司); 3-30K高速冷凍離心機(德國Sigma公司); 2510超聲波清洗機(美國Branson公司); Gradient A10 Milli-Q超純水器(法國Millipore公司)。

乙腈為HPLC級(德國Merck公司);甲酸、異丙醇和丙酮為HPLC級(美國Tedia公司);魚藤酮標準物質(zhì)(純度≥99%,德國Dr. Ehrenstorfer公司),用乙腈配制成1 000 mg/L標準貯備溶液,保存于-35 ℃冰箱中。

圖 2 中心切割二維超高效液相色譜流路圖Fig. 2 Flow diagram for heart-cutting two-dimensional ultra-performance liquid chromatography (2D-UPLC)a. first dimension, separation of rotenone; b. second dimension, heart-cutting of fraction containing rotenone. P: pump; T: tee.

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜分離條件

中心切割二維超高效液相色譜流路圖見圖2。

第1維:凈化柱為Cyclone柱(50 mm×0.5 mm, 60 μm,柱1,美國Thermo Fisher Scientific公司),分離色譜柱為Kinetex Biphenyl(聯(lián)苯基核殼柱)(50 mm×4.6mm, 2.6 μm,柱2,美國Phenomenex公司),柱溫為45 ℃,進樣體積為20 μL。流動相A為0.1%(v/v,下同)甲酸水溶液,流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液,流動相C為乙腈-異丙醇-丙酮(45∶45∶10, v/v/v)。梯度洗脫程序見表1。

第2維:捕集柱為XBridge C8Direct Connect HP柱(30 mm×2.1 mm, 10 μm,柱3,美國Waters公司),分離柱為Acquity BEH C8柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm,柱4,美國Waters公司),柱溫為45 ℃。流動相A為乙腈,流動相B為0.2%甲酸水溶液。梯度洗脫程序見表1。

表 1 超高效液相色譜梯度洗脫條件及閥切換程序

A, B, C, D are the flow-path channels of solvent manager.

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源正離子掃描,多離子監(jiān)測觸發(fā)的增強子離子(MRM-IDA-EPI)掃描方式。離子化電壓(IS): 5 500 V;離子源溫度(TEM): 500 ℃;氣簾氣壓(CUR): 277 kPa;噴霧氣壓(GS1): 345 kPa;輔助加熱氣(GS2): 345 kPa;碰撞氣(CAD): High。定量離子對為m/z395.1>213.2;定性離子對為m/z395.1>192.2;去簇電壓(DP)均為90 V;碰撞能量(CE)分別為31 eV和30 eV;增強子離子掃描范圍為m/z50～450。

運行開始時,在0～6.00 min,第2維色譜柱流出液經(jīng)質(zhì)譜儀的六通切換閥切換至廢液中,質(zhì)譜開始采集數(shù)據(jù)直到7.20 min結(jié)束,同時六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。

1.3 樣品前處理

尿液樣品:吸取200 μL尿液于1.5 mL Eppendroff管中,加入200 μL水,混勻,以15 000 r/min的速度離心5 min,取上清液,待測。

全血樣品:用肝素抗凝。吸取200 μL全血于1.5 mL Eppendroff管中,加入400 μL乙腈,混勻,超聲提取5 min,以15 000 r/min的速度離心5 min,吸取200 μL上清液,加入400 μL水,混勻,以15 000 r/min的速度離心5 min,取上清液,待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

在電噴霧正離子檢測方式下對質(zhì)譜測定條件進行優(yōu)化,Q1掃描時可見[M+H]+峰,然后對準分子離子峰進行碰撞,通過子離子掃描得到魚藤酮碎片離子信息(圖3),然后再對去簇電壓,碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化,使得分子離子對的信號達到最強,選擇兩對分子離子對,以響應(yīng)相對較強的子離子作為定量離子,另一子離子作為定性離子。同時設(shè)定合適的峰駐留時間(dwell time)確保色譜峰的采樣點數(shù)在15～20點,從而得到較好的定量重復(fù)性。優(yōu)化后的測定條件見1.2.2節(jié)。

圖 3 魚藤酮子離子全掃描質(zhì)譜圖(ESI+)Fig. 3 Full scan daughter ion mass spectrum (ESI+) of rotenone

2.2 中心切割二維色譜條件的選擇與優(yōu)化

魚藤酮屬雙氫異黃酮衍生物,極性較弱,在反相液相色譜柱上易保留。選擇Cyclone柱作為樣品凈化柱,Cyclone柱屬TurboFlow在線凈化柱,TurboFlow在線凈化技術(shù)結(jié)合了擴散、化學(xué)和體積排除等原理,在捕獲待測分析物的同時可以快速凈化樣品,在簡化樣品前處理的同時保證了方法的靈敏度,是近年發(fā)展起來的一種新型聯(lián)用檢測技術(shù),與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用已在生物樣品分析中得到了較好的應(yīng)用[13,14]。

圖 4 魚藤酮二維超高效液相色譜MRM色譜圖Fig. 4 MRM chromatograms of rotenone by two-dimensional UPLCa. first dimension chromatogram; b. second dimension chromatogram.

試驗發(fā)現(xiàn)樣品處理液中乙腈含量在23%以下時,魚藤酮能被Cyclone柱保留,而強極性的雜質(zhì)(鹽分等)不被保留,大流速的流動相形成渦流,可以去除大分子雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、脂肪等),雜質(zhì)去除完成后,左切換閥將Cyclone柱切至與第1維Kinetex Biphenyl色譜柱(聯(lián)苯基核殼柱)串聯(lián)的位置,采用具有較強洗脫能力的流動相(60%乙腈)將Cyclone柱中的魚藤酮快速洗入聯(lián)苯基核殼柱中,再進行梯度分離,魚藤酮的保留時間為4.28 min(見圖4a)。經(jīng)過試驗,在4.00～4.50 min內(nèi)將第1維分離色譜柱含有魚藤酮的流分通過右切換閥切入第2維的捕集柱(XBridge C8DC HP)中,同時515泵啟動,以1.00 mL/min的流速泵入水,通過三通先與一維色譜柱切割的流分混合,再流入捕集柱,使魚藤酮捕集在捕集柱的柱頭。切割完成后,右切換閥回到原位,第2維的流動相將魚藤酮反向洗入第2維的分離色譜柱(BEH C8柱)進行分離和檢測,同時515泵停泵,左切換閥切換至1位,并用強洗脫劑沖洗Cyclone柱,沖洗液流入廢液而不污染聯(lián)苯基核殼柱,然后左切換閥切換至2位,強洗脫劑再沖洗Cyclone和聯(lián)苯基核殼柱,沖洗之后再用梯度初始流動相平衡Cyclone和聯(lián)苯基核殼柱。第2維檢測完成后,再用強洗脫劑沖洗系統(tǒng),然后用梯度初始流動相平衡捕集柱和色譜柱。此時魚藤酮得到聚焦,色譜峰較窄,靈敏度高,保留時間穩(wěn)定(見圖4b)。優(yōu)化好的二維色譜條件見1.2.1節(jié)。

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

魚藤酮不溶于水,可溶于醇、乙腈、丙酮、氯仿和乙酸乙酯等有機溶劑,目前文獻[7,11]報道的提取方法主要有乙酸乙酯萃取法和乙腈提取法,考慮到乙腈更適合作為反相色譜進樣溶劑,因此采用乙腈作為提取劑,提取液經(jīng)離心去除蛋白質(zhì)后,再用水稀釋至乙腈含量小于23%,直接進樣分析。

本法采用中心切割二維色譜法同時進行凈化和分離,魚藤酮分子含有2個苯基,在第1維的聯(lián)苯基核殼柱上能增強保留,聯(lián)苯基核殼柱與第2維的BEH C8分離色譜柱具有一定的正交性,有利于魚藤酮與樣品基質(zhì)成分的分離。全血和尿液樣品采用本法分離后基質(zhì)效應(yīng)[15]分別為95%和93%,若采用傳統(tǒng)的一維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分離,基質(zhì)效應(yīng)分別為46%和53%。本方法基本消除了基質(zhì)抑制效應(yīng),可采用溶劑標準外標法定量,無需基質(zhì)匹配,既方便操作,又能得到準確結(jié)果。

2.4 標準曲線、檢出限和定量限

將魚藤酮標準品溶液稀釋,制成質(zhì)量濃度分別為0.020、0.10、0.50、1.0、5.0和50 μg/L的系列標準溶液進行測定,采用MultiQuant(Ver. 3.0)定量軟件進行數(shù)據(jù)處理,以定量離子對的峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x, μg/L)進行回歸,二者在0.020～50 μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)大于0.996,回歸方程為y=9.42×105x-0.22×104。

在空白樣本中加入系列低質(zhì)量濃度的魚藤酮,按本法測定,以信噪比等于3時對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度作為檢出限(LOD),以信噪比等于10時的樣品質(zhì)量濃度作為定量限(LOQ),試驗測得全血樣品的檢出限為0.2 μg/L,定量限為0.5 μg/L；尿液樣品的檢出限為0.03 μg/L,定量限為0.1 μg/L；測定上限分別為450和100 μg/L。預(yù)計測量的質(zhì)量濃度范圍包括了大部分中毒樣品中魚藤酮的含量水平。

2.5 加標回收試驗和方法的精密度

選取不含魚藤酮的全血和尿液進行加標回收和精密度試驗,樣品中添加了不同濃度的標準溶液后,放置60 min,使待測成分與樣品基體成分相互作用達到平衡,再按本文樣品前處理方法進行操作,其回收率和精密度結(jié)果見表2。全血和尿液樣品的加標回收率分別為84.6%～94.3%和88.4%～95.7%,相對標準偏差分別為2.6%～7.3%和2.8%～6.8%,符合痕量分析的要求。

表 2 全血和尿液中魚藤酮的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

2.6 實際樣品分析

2015年5月30日,本市發(fā)生一起因誤食地瓜籽(豆科豆薯屬植物豆薯Pachyrhizuserosus的種子)引起的食物中毒事件,共有5人發(fā)病。中毒后出現(xiàn)頭暈、嘔吐、全身軟弱無力、四肢發(fā)麻等癥狀,其中1例重癥患者出現(xiàn)神志不清、呼吸困難,最終醫(yī)治無效死亡。收到5份全血、1份尿液和1份地瓜籽樣本,采用本法測得5份全血中魚藤酮的含量分別為1.4、2.7、2.1、9.2和17.3 μg/L,尿液中魚藤酮的含量為0.41 μg/L(見圖5),地瓜籽樣本中魚藤酮的含量為443 mg/kg。尿液中魚藤酮子離子掃描質(zhì)譜圖與譜庫中魚藤酮的匹配率達92%。

圖 5 尿液中魚藤酮的MRM色譜圖(0.41 μg/L)Fig. 5 MRM chromatograms of rotenone in a urine sample (0.41 μg/L)

3 結(jié)論

本文建立了中心切割二維超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測定尿液和全血中魚藤酮的分析方法。通過優(yōu)化色譜分離和質(zhì)譜檢測條件,得到了較高的檢測靈敏度。通過對樣品凈化效果和基質(zhì)效應(yīng)的評估,證明了樣品在線凈化方法的有效性。方法學(xué)驗證結(jié)果表明,本法靈敏度高、選擇性好、定量準確、精密度好,應(yīng)用于實際樣品的檢測取得了滿意的結(jié)果。本法適合于尿液和全血中魚藤酮的中毒檢測和臨床監(jiān)測。

[1] Chen X, Zhang N, Li C. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica, 2009, 17(2): 135

陳忻, 張楠, 厲春. 中國實驗動物學(xué)報, 2009, 17(2): 135

[2] Qi C, Liu Z G, Fan G H, et al. Chinese Journal of Neurology, 2004, 37(6): 538

戚辰, 劉振國, 范國華, 等. 中華神經(jīng)科雜志, 2004, 37(6): 538

[3] Cheng Y X. Chinese Medicine Modern Distance Education of China, 2011, 9(20): 100

程勇祥. 中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育, 2011, 9(20): 100

[4] Huang C P, Zhao P. Journal of Toxicology, 2006, 20(3): 205

黃超培, 趙鵬. 毒理學(xué)雜志, 2006, 20(3): 205

[5] Yang F, Zheng D P, Liu Z C, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2011, 39(4): 556

楊方, 鄭丹萍, 劉正才, 等. 分析化學(xué), 2011, 39(4): 556

[6] Zhao Z Y, Shi Z H, Kang J, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(4): 372

趙志遠, 石志紅, 康健, 等. 色譜, 2013, 31(4): 372

[7] Yang F, Liu Z C, Zhen D P, et al. Food Anal Methods, 2011, 4(4): 601

[8] Wang S N, Li G H, Li Y Z, et al. Agrochemicals, 2012, 51(4): 278

王蘇寧, 李冠華, 李有志, 等. 農(nóng)藥, 2012, 51(4): 278

[9] Jimenez J J, Bernal J L, Nozal M J D, et al. J Chromatogr A, 2000, 871: 67

[10] Han F M, Li X D, Lai S J, et al. Forensic Science and Technology, 2011(3): 35

韓鳳鳴, 李曉東, 賴仕均, 等. 刑事技術(shù), 2011(3): 35

[11] Caboni P, Sarais G, Vargiu S, et al. Chromatographia, 2008, 68(9/10): 739

[12] Xiao W B, Jian Y, Li H. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2014, 42(12): 1851

蕭偉斌, 蹇陽, 李樺. 分析化學(xué), 2014, 42(12): 1851

[13] Ling Y S, Liang H J, Lin M H, et al. Biomed Chromatogr, 2014, 28: 1284

[14] Jourdil J F, Tonini J, Stanke-Labesque F. J Chromatogr B, 2013, 919/920: 1

[15] Chambers E, Wagrowski-Diehl D M, Lu Z, et al. J Chromatogr B, 2007, 852: 22

Rapid determination of rotenone in whole blood and urine by two-dimensional ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometry

ZHANG Xiaoyi1, ZHANG Xiuyao1*, CAI Xinxin1, LI Ruifen1, LIN Xueyao2, LIN Jie2

(1.WenzhouMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Wenzhou325001,China,2.RuianCenterforDiseaseControlandPrevention,Ruian325200,China)

The two-dimensional ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometry (2D-UPLC-QTRAP MS) method has been developed for the determination of rotenone in whole blood and urine. This method is based on the use of two columns of different stationary phases (Kinetex Biphenyl and Acquity BEH C8) connected through two six-port two-position switching valves. Urine samples were diluted with equal quantity of water and then directly injected into the separation system. Blood samples were prepared by precipitation of proteins with acetonitrile, and then the supernatants were diluted with water and injected into the system. The samples were loaded onto the Cyclone column at high flow-rates, allowing the excluded proteinaceous material to flow through to waste. Then the retained rotenone was eluted into the Kinetex Biphenyl column, and the first dimension separation was completed. The fraction containing rotenone was switched into a trap column (XBridge C8Direct Connect HP). After the rotenone was retained completely by trap column, the valve switched it into the stream of the second dimension. The rotenone was separated on the Acquity BEH C8column with gradient elution of mobile phases of acetonitrile-H2O containing 0.2% (v/v) formic acid, detected by positive electrospray ionization tandem mass spectrometry in the multiple reaction monitoring-information-dependent acquisition-enhanced product ion (MRM-IDA-EPI) mode, and quantified by solvent standard solutions. The average recoveries were 84.6%-94.3% and 88.4%-95.7% for rotenone in blood and urine with relative standard deviations of 2.6%-7.3% and 2.8%-6.8% (n=6). The limits of detection were 0.2 and 0.03 μg/L for blood and urine, respectively. The method is sensitive, selective, and has been successfully applied to the detection of rotenone in the samples resulting in food poisoning.

two-dimensional ultra-performance liquid chromatography (2D-UPLC); triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometry (QTRAP MS); heart-cutting; rotenone; whole blood; urine

10.3724/SP.J.1123.2016.12023

2016-12-12

O658

A

1000-8713(2017)05-0482-05

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(0577)55597838,E-mail:xyzwz123@126.com.