李廣興，趙蕾，陳慧杰，郎躍深，劉鵬，黃小丹，王洪微，任玉東，張瑞莉

（1.黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.河北省秦皇島市青龍滿族自治縣職教中心，河北秦皇島066500；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)電氣與信息學(xué)院，哈爾濱150030）

膽固醇對雞傳染性支氣管炎病毒感染雞胚腎細(xì)胞的影響

李廣興1，趙蕾1，陳慧杰1，郎躍深2，劉鵬1，黃小丹1，王洪微1，任玉東3，張瑞莉1

（1.黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.河北省秦皇島市青龍滿族自治縣職教中心，河北秦皇島066500；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)電氣與信息學(xué)院，哈爾濱150030）

膽固醇是維持細(xì)胞膜脂筏穩(wěn)定結(jié)構(gòu)重要組分。一些囊膜病毒感染過程依賴膽固醇。研究利用Real Time PCR和病毒滴度試驗，分析細(xì)胞膜和病毒囊膜膽固醇是否影響雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）感染雞胚腎（CEK）細(xì)胞。結(jié)果表明，膽固醇萃取劑甲基-β-環(huán)糊精去除細(xì)胞膜膽固醇后，可抑制IBV感染CEK細(xì)胞并呈劑量依賴性，補(bǔ)充外源性膽固醇后，IBV感染力部分恢復(fù)，說明IBV感染依賴細(xì)胞膜膽固醇；去除細(xì)胞膜膽固醇可影響IBV感染侵入和釋放過程。去除病毒囊膜膽固醇對IBV感染力無顯著影響。IBV感染CEK細(xì)胞時依賴細(xì)胞膜膽固醇，而非病毒囊膜膽固醇。

膽固醇；細(xì)胞膜；傳染性支氣管炎；雞胚腎細(xì)胞；感染

雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）為有囊膜單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬第Ⅲ群，長度27.6 kb[1]。IBV基因組至少有10個開放閱讀框（ORF），可編碼6.7～440 ku蛋白，病毒RNA各基因排列順序為：5' UTR-1a-1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3'UTR。除非結(jié)構(gòu)蛋白外主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突蛋白（S）、核衣殼蛋白（N）、膜蛋白（M）和小膜蛋白（E）[2]。IBV與宿主細(xì)胞結(jié)合和進(jìn)入，需要細(xì)胞表面受體與病毒結(jié)構(gòu)蛋白相互作用。IBV感染可引起雞急性、高度接觸性傳染病，并引發(fā)呼吸道、腎臟、輸卵管、腸道及腺胃等多組織器官病變[3]，影響?zhàn)B禽業(yè)健康發(fā)展。

脂筏是富含鞘磷脂、膽固醇和附屬蛋白的特定有序液體微區(qū)，在病毒感染和釋放過程中發(fā)揮重要功能。膽固醇為脂筏主要成分，具有一定硬度和疏水性，可維持鞘脂中飽和脂肪酸鏈緊密排列，去除后導(dǎo)致脂筏微區(qū)結(jié)構(gòu)破壞，影響質(zhì)膜特性[4]。李詠梅等研究表明，在多種囊膜病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中，細(xì)胞膜和病毒囊膜膽固醇均發(fā)揮重要作用[5]，包括病毒進(jìn)入、融合、復(fù)制、裝配和釋放[6-7]。豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、牛皰疹病毒1型（BoHV-1）和鼠白血病病毒感染過程需要細(xì)胞膜膽固醇[8]。流感病毒和鴨乙型肝炎病毒（DHBV）感染，僅依賴病毒囊膜膽固醇，無需細(xì)胞膜膽固醇，犬瘟熱病毒需要病毒囊膜膽固醇[9]。水泡性口膜炎病毒（VSV）無需膽固醇[10]。目前IBV感染宿主細(xì)胞過程與膽固醇關(guān)系尚未見報道。

甲基-β-環(huán)糊精為膽固醇結(jié)合劑，可抽提生物膜中膽固醇，破壞脂筏完整性。本試驗利用甲基-β-環(huán)糊精去除膜性結(jié)構(gòu)中膽固醇，通過實時熒光定量RT-PCR和病毒滴度試驗研究IBV感染雞胚腎細(xì)胞（Chicken embryo kidney cells,CEKs）時細(xì)胞膜和病毒囊膜膽固醇對病毒感染影響，闡明膽固醇與IBV感染相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和病毒株

IBVM41株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院病理解剖教研室保存；SPF雞胚購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑

甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）、外源性膽固醇、DNA marker購自大連寶生物試劑有限公司，M199培養(yǎng)液購自Hyclone公司。總RNA極速抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄酶購自大連寶生物TaKaRa生物試劑公司；溴化乙錠（Ethidium bromide,EB）購自Sigma公司；FastStart Universal SYBRGreen Master（ROX）購自羅氏公司。

1.3 CEK制備

[11]和[12]方法制備CEK細(xì)胞，取16～20胚齡雞胚，氣室朝上，碘酊消毒后酒精棉脫碘，晾干后無菌鑷子擊破蛋殼取出雞胚，剖開腹腔分離腎臟，于預(yù)熱的D-Hank's液中洗滌，剔除血液等雜質(zhì)，將腎臟轉(zhuǎn)移至新鮮D-Hank's液中，剪成小塊，加入適量0.25%胰酶，置于37℃水浴鍋中消化至組織疏松透明、呈絮狀。離心去除上清，加入1mL含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液懸起沉淀，混勻后用200目銅網(wǎng)過濾，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至約5×105個·m L-1，鋪板，37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h換液，至長成單層，更換為含2%胎牛血清M199維持液。

1.4 IBVM 41株感染CEK細(xì)胞

將長成單層的CEK細(xì)胞D-Hank's液洗3次，加入IBVM41株病毒懸液，放至37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，棄掉懸液，D-Hank's液洗3次，補(bǔ)充無血清M199培養(yǎng)液，未接種病毒細(xì)胞更換為無血清M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)作空白對照。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至感染組產(chǎn)生CPE，顯微鏡下觀察并拍照。

作IBV感染CEKs的RT-PCR鑒定。病毒懸液RNA提取按照上海飛捷總RNA極速抽提試劑盒說明書操作，以O(shè)ligo dT（18）為反轉(zhuǎn)錄引物，按照MLV反轉(zhuǎn)錄說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以IBV N基因引物（見表1）擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，55.7℃退火30 s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后取2μLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 IBV N基因引物Table1 Primers for am plification of IBV N gene

1.5 M TT法檢測MβCD對CEK細(xì)胞毒性

將分離CEK細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長至單層后，去除生長液。預(yù)冷的D-Hank's液洗細(xì)胞3次，加入100μL含不同濃度MβCD（0、2.5、5、7.5、10、15、20mmol·L-1）M199培養(yǎng)液處理細(xì)胞，于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，每個濃度5個重復(fù)。加入10μL 5mg·mL-1MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出孔內(nèi)液體后，每孔加入150μL DMSO液，室溫振搖10min，使結(jié)晶物溶解。酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長490 nm）。

1.6 MβCD去除CEK細(xì)胞膜膽固醇對病毒感染影響

1.6.1 MβCD膜膽去除CEK細(xì)胞膜膽固醇對IBV感染影響

選擇24孔板中狀態(tài)良好、每孔鋪滿80%CEK細(xì)胞的單層細(xì)胞，預(yù)冷D-Hank's液洗滌3次，設(shè)置感染組和對照組，每個濃度3個重復(fù)。感染組每孔分別加200μL含有2.5、5、7.5、10mmol·L-1MβCD無血清M199培養(yǎng)液處理細(xì)胞，對照組每孔加200μL無MβCD、無血清M199培養(yǎng)液，37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。棄去液體，預(yù)冷D-Hank's液洗3次，除去MβCD，然后加入100 TCID50的IBV病毒懸液，37℃培養(yǎng)1 h，棄去病毒液，再用預(yù)冷D-Hank's液洗3次，加入M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收取樣品[13]。

1.6.2 MβCD樣去除CEK細(xì)胞膜膽固醇對IBV吸附影響

按1.5.1方法使用MβCD處理CEK細(xì)胞后，加入100 TCID50病毒懸液，4℃吸附1 h，棄去病毒液，預(yù)冷D-Hank's液洗3次，加入M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收取樣品。

1.6.3 MβCD樣去除CEK細(xì)胞膜膽固醇對IBV釋放影響

感染組和對照組先接種100 TCID50病毒，37℃培養(yǎng)1 h，預(yù)冷D-Hank's液洗3次后，再按1.5.1方法使用MβCD處理細(xì)胞，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，按前述方法洗滌培養(yǎng)。待細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變時收取樣品。

1.7 細(xì)胞膜膽固醇去除再補(bǔ)充對病毒感染影響

用含10mmol·L-1MβCD無血清M199培養(yǎng)液處理細(xì)胞后，分別加入含有0、50、100、150、200μmol·L-1膽固醇無血清M199培養(yǎng)液，37℃作用1 h，冷D-Hank's洗3次，加入100 TCID50病毒懸液，培養(yǎng)24 h后收取樣品。

1.8 去除病毒囊膜膽固醇

為檢測病毒囊膜膽固醇對IBV感染重要性，分別用0～10mmol·L-1MβCD處理10 000 TCID50病毒懸液，37℃孵育30min。生長良好CEK單層細(xì)胞用預(yù)冷D-Hank's液洗3次，將MβCD處理病毒懸液用M199培養(yǎng)液100倍稀釋后加入感染組細(xì)胞，37℃培養(yǎng)1 h，對照組接種100 TCID50無處理病毒。最后，感染組和對照組細(xì)胞分別用預(yù)冷DHank's液洗3次，37℃CO2培養(yǎng)箱中24 h后收取樣品。

1.9 Real Time PCR

采用上海飛捷總RNA極速抽提試劑盒分離細(xì)胞漿或懸液中總RNA，Oligo dT（18）反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)cDNA。熒光定量PCR操作按照羅氏FastStart Universal SYBRGreen Master(ROX)兩步法操作，IBV上下游引物分別為：IBV-NF：5'CAAGCTAGGTTT AAGCCAGGT 3'，IBV-NR：5'TCTGAAAACCGTAG CGGATAT 3'。β-actin上下游引物為：5'ATTGCTG CGCTCGTTGTT 3'，5'CTTTTGCTCTGGGCTTCA 3'。每組設(shè)3個重復(fù)，細(xì)胞組作陰性對照，水對照作空白對照。

1.10 病毒效價TCID50測定

處理后病毒樣品M199培養(yǎng)液作連續(xù)10倍系稀釋，從10-1～10-8，分別加至鋪滿單層CEK細(xì)胞96孔細(xì)胞板中，每個稀釋度接種6孔，每孔100μL，對照組細(xì)胞加入等量無血清M199培養(yǎng)液。48 h后顯微鏡下觀察記錄，按Reed-Muench法計算。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0和Graphpad Prism 6作統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBV M 41株感染CEK細(xì)胞

IBVM41株感染CEK細(xì)胞后，倒置顯微鏡下觀察。接種病毒CEK細(xì)胞在感染后24 h出現(xiàn)輕微病變，48 h時CEK細(xì)胞變圓、固縮，75%細(xì)胞脫落并觀察到細(xì)胞融合現(xiàn)象，失去原有細(xì)胞形態(tài)?？瞻讓φ諢o病變（見圖1）。

圖1 IBV在CEK細(xì)胞上細(xì)胞病變Fig.1 Cytopathic effects(CPE)of IBV on CEK s

病毒培養(yǎng)物經(jīng)RT-PCR鑒定，產(chǎn)物大小約為1 750 bp（見圖2），與預(yù)期結(jié)果相同。表明IBVM41毒株可以在CEK細(xì)胞增殖。

圖2 IBV N基因PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR am plification of IBV N gene

2.2 MβCD對CEK細(xì)胞毒性檢測

采用MTT檢測法確定MβCD對CEK細(xì)胞毒性作用。結(jié)果顯示，隨著MβCD濃度增大，細(xì)胞產(chǎn)生損傷性變化，OD值降低，而當(dāng)MβCD濃度≤10 mmol·L-1時，對CEK細(xì)胞活性影響較小（見圖3）。因此，后續(xù)試驗中MβCD最高濃度為10mmol·L-1。

圖3 MTT檢測MβCD對CEK細(xì)胞膜毒性Fig.3 Toxicity of MβCD to CEK sdetected by M TT assay

2.3 MβCD去除細(xì)胞膜膽固醇對IBV感染CEK細(xì)胞影響

2.3.1 MβCD去除細(xì)胞膜膽固醇對IBV感染CEK細(xì)胞影響

為研究IBV進(jìn)入CEK細(xì)胞是否需要細(xì)胞膜膽固醇，向CEK單層細(xì)胞中加入含不同濃度MβCD的M199培養(yǎng)液，隨后感染IBVM41株病毒。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，Real Time PCR和病毒滴定法測定病毒量。結(jié)果顯示，隨著MβCD濃度增大，CEK細(xì)胞產(chǎn)生病毒量以劑量依賴性方式減少，10mmol·L-1的MβCD處理后，感染率下降約68%（見圖4A），從TCID50結(jié)果看，隨著MβCD濃度增大，病毒滴度也以劑量依賴性方式降低（見圖4B）。

2.3.2 細(xì)胞膜去除膽固醇后再補(bǔ)充對病毒感染影響

如圖5所示，隨著補(bǔ)充外源膽固醇濃度增大，細(xì)胞內(nèi)病毒產(chǎn)量和病毒滴度均呈劑量依賴性恢復(fù)。當(dāng)補(bǔ)充200μmol·L-1膽固醇時，病毒產(chǎn)量恢復(fù)至MβCD處理前水平（見圖5A）。

2.3.3 MβCD去除細(xì)胞膜膽固醇對IBV吸附影響

為進(jìn)一步確定IBV吸附過程是否受膽固醇影響，去除細(xì)胞膜膽固醇后，作病毒吸附試驗。如圖6所示，隨著MβCD濃度增大，病毒產(chǎn)量和病毒滴度均劑量依賴性降低。

圖4 去除CEK細(xì)胞膜膽固醇對IBV感染力影響Fig.4 Effect of CEK cellularm em brane cholesterol dep letion on IBV infection

圖5 細(xì)胞膜去除膽固醇后再補(bǔ)充對IBV感染力影響Fig.5 Effectof exogenous cholesterol recovery on IBV in fection after cellularmembrane cholesteroldep letion

圖6 去除細(xì)胞膜膽固醇對IBV吸附影響Fig.6 E ffect of cellularmem brane cholesterol dep letion on IBV adsorption

2.3.4 MβCD去除細(xì)胞膜膽固醇對IBV釋放影響

為確定病毒釋放過程是否需要細(xì)胞膜膽固醇，樣品出現(xiàn)CPE后取上清懸液。Real Time PCR和病毒滴定結(jié)果均顯示，隨著MβCD濃度增大，IBV從CEK細(xì)胞釋放病毒量劑量依賴性降低（見圖7）。

2.4 去除病毒囊膜膽固醇對IBV進(jìn)入CEK細(xì)胞影響

為探究IBV病毒囊膜膽固醇是否影響IBV進(jìn)入CEK細(xì)胞，去除病毒囊膜膽固醇后再接種至CEK細(xì)胞。去除病毒囊膜膽固醇后，對病毒進(jìn)入無規(guī)律性影響（見圖8）。

圖7 去除細(xì)胞膜膽固醇對IBV釋放影響Fig.7 Effectof cellu larmembrane cholesteroldepletion on IBV release

圖8 去除病毒膜膽固醇對IBV感染力影響Fig.8 Effectofvirusmembrane cholesteroldep letion on IBV infection

3 討論與結(jié)論

膽固醇為細(xì)胞膜重要組分，和鞘磷脂類及一些蛋白共同形成脂筏結(jié)構(gòu)，在病毒感染細(xì)胞及釋放過程中發(fā)揮重要功能。脂筏中膽固醇在多種病毒感染過程中起作用，特別是一些囊膜病毒，如人免疫缺陷病毒（HIV）、脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）、偽狂犬病毒（PrV）[14]、牛痘病毒、單純疤疹病毒（HSV）、手足口病毒（HFMD）等[15]。在冠狀病毒生命周期中，膽固醇必不可少[16]。與IBV同屬冠狀病毒的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）進(jìn)入細(xì)胞時依賴細(xì)胞膜膽固醇[17]，豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）感染則同時需要細(xì)胞膜和病毒囊膜膽固醇[18]。

Alonso-Caplen等研究表明，IBV Beaudette株可在非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）、人肝癌細(xì)胞等常見細(xì)胞系中復(fù)制[19-20]，Holte毒株可在乳倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）中復(fù)制[21]，Da株可在猴腎細(xì)胞（Marc145）等細(xì)胞中生長[22]，而幾乎所有IBV毒株均可在雞胚腎細(xì)胞（CEK）、雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）、肺細(xì)胞、肝細(xì)胞和雞腎細(xì)胞（CK）中生長[23]，其中以雞胚腎細(xì)胞和雞腎細(xì)胞中生長良好。由于CEK細(xì)胞源于IBV易感宿主，相較于其他細(xì)胞系更接近IBV感染環(huán)境，且對IBV具有極高敏感性，接種后可見明顯細(xì)胞病變，成為研究IBV感染細(xì)胞致病過程及機(jī)制適宜宿主細(xì)胞模型[11]。本試驗中IBV M41株感染CEK細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞變圓、固縮、聚集成團(tuán)等典型CPE，且PCR結(jié)果鑒定正確，說明M41可有效感染CEK細(xì)胞并產(chǎn)生典型病變。

本研究通過Real Time PCR和病毒滴度試驗探究細(xì)胞膜和病毒囊膜膽固醇對IBV感染CEK細(xì)胞影響。首先確定IBV感染CEK細(xì)胞時依賴細(xì)胞膜膽固醇，使用MβCD去除細(xì)胞膜膽固醇后，病毒感染力顯著降低且呈劑量依賴性。為進(jìn)一步驗證去除膽固醇影響，MβCD去除細(xì)胞膜膽固醇后，梯度劑量補(bǔ)充外源膽固醇，結(jié)果顯示IBV病毒繁殖數(shù)量恢復(fù)，當(dāng)外源性膽固醇濃度為200μmol·L-1時，感染力恢復(fù)至處理前，證實病毒感染力降低由膽固醇缺失引起，且此抑制作用可逆。本研究還發(fā)現(xiàn)IBV吸附和釋放過程也受CEK細(xì)胞膜膽固醇影響。而去除病毒囊膜膽固醇后，病毒感染力和病毒滴度均無規(guī)律性變化，故認(rèn)為IBV感染時無需病毒囊膜膽固醇。綜上，IBV感染CEK細(xì)胞過程，為細(xì)胞膜膽固醇而非病毒囊膜膽固醇發(fā)揮功能，對闡明IBV感染宿主細(xì)胞相互作用過程及致病機(jī)制具有重要意義。

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Effect of cholesterol on infectious bronchitis virus infection of CEKs/LI

Guangxing1,ZHAO Lei1,CHEN Huijie1,LANG Yueshen2,LIU Peng1,HUANG Xiaodan1,WANG Hongwei1,REN Yudong3,ZHANG Ruili1
(1.Key Labo ratory fo r Labo rato ry Anim a ls and Com pa rative Med icine o f Heilongjiang Province,Schoo lo f Ve te rina ryMed icine,No rtheast Agricu ltu ra l University, Ha rbin 150030,China;2.Qinglong Manchu Autonom ous County Voca tiona l Education Cen ter, Qinhuangdao Hebei066500,China;3.School o f Electrica l and In form ation,No rtheast Ag ricu ltu ra l University,Harbin 150030,China)

Cholesterol is an important component to maintain the stable structure of lipid rafts on cellular membrane.For som e enveloped viruses,the infection of host cell depends on the participation of cholesterol.In this paper,pretreatment of chicken em bryo kidney cells(CEKs)w ith methyl-β-cyclodextrin (MβCD),a drug used to dep lete cholesterol from membranous structure,to analyze whether the cellular or viralmembrane cholesterol played a role in chicken infectious bronchitis virus(IBV)infection of CEKs.The results showed thatsignificantly decrease of IBV infection in a dose-dependentmanner through real time RTPCR and virus titer test,and IBV infection could be partially restored by supplementing exogenous cholesterol,indicated that IBV infection depended on cellular membrane cholesterol.Further studies discovered that the rem oval of cellular membrane cholesterol affected IBV attachment and release stage.李廣興,趙蕾,陳慧杰,等.膽固醇對雞傳染性支氣管炎病毒感染雞胚腎細(xì)胞的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,48(4):45-52. LiGuangxing,Zhao Lei,Chen Huijie,etal.Effectof cholestero lon in fectious bronchitis virus infection ofCEKs[J].Journalof NortheastAgricultura lUniversity,2017,48(4):45-52.(in Chinese w ith English abstract)However,the removal of viral envelope cholesterol had no effect on IBV infection.These results demonstrated that IBV infection of CEKs was dependent on cellular membrane and no viral envelope cholesterol.

Cholestero l;ce llularmembrane;infectious bronchitis virus;chicken embryo kidney ce lls; infection

S831.7

A

1005-9369（2017）04-0045-08

時間2017-4-24 6:19:54[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170424.0619.010.html

2017-03-02

國家自然科學(xué)基金項目（31172295，31272569）

李廣興（1968-），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為動物病理學(xué)。E-mail:liguangxing1968@hotmail.com