魏萍，張睿，張宏宇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

益生菌增加IPEC-J2細(xì)胞表面半乳糖在抑制RV感染中的作用

魏萍，張睿，張宏宇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

輪狀病毒通過識別細(xì)胞表面糖鏈附著于腸上皮細(xì)胞，一些腸道內(nèi)常駐菌群可以修改細(xì)胞表面糖鏈。以3種益生菌上清孵育豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2，豬輪狀病毒（PRV）感染細(xì)胞。采用凝集素?zé)晒饧夹g(shù)測定各處理組IPEC-J2細(xì)胞表面半乳糖，檢測對應(yīng)輪狀病毒滴度和RV含量變化。結(jié)果表明，對照組PRV TCID50·0.1mL-1為10-7.15±0.14，干酪乳桿菌組TCID50·0.1mL-1為10-3.875±0.125，食淀粉乳桿菌PRV TCID50·0.1mL-1為10-4.125±0.138，枯草芽孢桿菌PRV TCID50·0.1mL-1為10-4.16±0.144。3組益生菌上清組在RV感染48 h內(nèi)，RV量顯著低于未處理組。凝集素?zé)晒鈽?biāo)記表明，3株益生菌上清均可改變細(xì)胞表面半乳糖含量。干酪乳桿菌、食淀粉乳桿菌和枯草芽孢桿菌上清可增加IPEC-J2細(xì)胞表面半乳糖含量，提高細(xì)胞抗RV感染能力，阻斷RV黏附，保護(hù)腸道上皮細(xì)胞。

益生菌；輪狀病毒；凝集素；半乳糖

魏萍,張睿,張宏宇.益生菌增加IPEC-J2細(xì)胞表面半乳糖在抑制RV感染中的作用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,48(4):36-44.

WeiPing,Zhang Rui,Zhang Hongyu.Effectof probiotic increase IPEC-J2 cellsurface galactose on the inhibition o f RV infection[J].Journalo fNortheastAgricultura lUniversity,2017,48(4):36-44.(in Chinese w ith English abstract)

輪狀病毒屬于呼腸弧病毒家族，可造成幼齡動物、嬰幼兒病毒性腹瀉。輪狀病毒感染首先針對腸道細(xì)胞，需附著于細(xì)胞膜上特異聚糖[1]。輪狀病毒分為唾液酸敏感型和非唾液酸敏感型，大多數(shù)輪狀病毒需要識別特異性唾液酸[2-3]，涉及半乳糖等多種糖類[4]。

腸道微生物群落功能主要涉及吸收能量和營養(yǎng)物質(zhì)代謝、保護(hù)宿主免于外源微生物侵入、營養(yǎng)腸上皮細(xì)胞和調(diào)節(jié)免疫結(jié)構(gòu)功能等[5]。某些益生菌產(chǎn)生可溶性因子可修改或修飾細(xì)胞表面糖基，抑制輪狀病毒感染。腸道中多形擬桿菌具有聚糖修飾活性，修飾腸道細(xì)胞表面[6]，編碼200多種聚糖修飾酶[7]。腸上皮細(xì)胞表面覆蓋密集的糖分子，在機(jī)體發(fā)育及抵御疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Freitas等研究表明益生菌代謝產(chǎn)物可修改細(xì)胞表面糖基表達(dá)，增加半乳糖表達(dá)[8]。益生菌抗病毒研究方面，如乳酸桿菌、腸球菌及雙歧桿菌的有益作用已取得一定進(jìn)展，包括腸道常駐菌群建立與腸道屏障功能維持、抑制病原體粘附腸粘膜、增強(qiáng)先天免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)成熟[9-10]。Guandalini等表明益生菌可縮短病毒性腹瀉持續(xù)時間[11]。益生菌代謝產(chǎn)物抑制輪狀病毒侵染[12-14]。

本研究以具有抗輪狀病毒能力的干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、食淀粉乳桿菌培養(yǎng)上清液為原料，探究其對IPEC-J2細(xì)胞膜表面半乳糖表達(dá)影響及糖基改變對輪狀病毒感染豬IPEC-J2細(xì)胞干擾作用，為闡述3種益生菌對輪狀病毒影響機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、食淀粉乳桿菌（Lactobacillusamylovorus）和枯草芽孢桿菌（Bacil?lusSubtilis）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病實驗室分離保存，MA-104細(xì)胞及IPEC-J2細(xì)胞由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院惠贈，豬輪狀病毒OSU株引自ATCC。

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Hyclone（美國）；胎牛血清購自Gibco（美國）；MRS液體培養(yǎng)基；D-Hanks溶液；ITSG胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉混合液；RCA-120；正置熒光顯微鏡；豬β-半乳糖苷酶定量檢測試劑盒購自北京誠林生物科技有限公司；豬RV-Ag定量檢測試劑盒購自北京誠林生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 益生菌處理

枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌及食淀粉乳桿菌置于厭氧罐在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，活化3次后，細(xì)菌增殖對數(shù)期收獲菌液，于4℃離心機(jī)，7 000 r·min-1獲得各菌株上清，氫氧化鈉調(diào)至pH 7.3，0.2mm Durapore濾器過濾后4℃留存。37℃條件下孵育1 d，若MRS離心液中無細(xì)菌生長，則驗證上清液中無細(xì)菌，可作為試驗上清液備用。

1.2.2 益生菌上清最大無毒劑量測定

將IPEC-J2細(xì)胞在含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞80%融合時用0.25%胰酶-EDTA消化，稀釋細(xì)胞懸液至2.5×104a.i.·L-1，以每孔200μL接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔5 000個細(xì)胞），邊緣孔用無菌PBS充填。37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h備用。

將3種益生菌培養(yǎng)上清倍比稀釋，得到終濃度為原液濃度1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128的代謝產(chǎn)物稀釋液，加入長成單層96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，每個孔設(shè)5個重復(fù)，同時設(shè)病毒和正常細(xì)胞對照組及調(diào)零孔。觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)病毒對照組細(xì)胞病變達(dá)80%時，移液器吸去各孔液體，每孔加入20μL MTT（貯存濃度）及180μL未加血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。37℃溫箱孵育10min或搖床低速振蕩10min后每孔加入150μL的DMSO測定OD490nm值（A值），確定代謝產(chǎn)物最大無毒劑量。

細(xì)胞活力=（藥物組A值-調(diào)零孔A值）/（對照孔A值-調(diào)零孔A值）×100%。

1.2.3 細(xì)胞處理

細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM,使用前添加10%胎牛血清（FBS），1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒補(bǔ)充劑。細(xì)胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 d更換1次培養(yǎng)基，一般2 d形成單層細(xì)胞。正常組：將IPEC-J2細(xì)胞用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液作常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合至60%后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。半乳糖組：以5 nmola.i.·L-1半乳糖取代葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d，誘導(dǎo)得到IPEC-J2細(xì)胞分化型細(xì)胞IPEC-Gal[15-17]。

1.2.4 凝集素?zé)晒鈾z測

PBS洗滌細(xì)胞6次后，用2%新鮮制備的多聚甲醛（P FA）固定20min。以含50mmol·L-1NH4Cl的PBS室溫下浸泡10min后，將益生菌處理的細(xì)胞與FITC處理的RCA在黑暗中封閉45min，正常細(xì)胞與FITC（異硫氰酸熒光素）處理的RCA在黑暗中封閉45min。外源凝集素RCA工作濃度為20mg a.i.· L-1。PBS洗滌細(xì)胞6次后。熒光正置顯微鏡觀測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，以DMEM作空白校正。

1.2.5 RV感染細(xì)胞的半乳糖苷酶定量檢測

將3種益生菌上清處理組（食淀粉乳桿菌處理組簡稱s組、干酪乳桿菌處理組簡稱g組、枯草芽孢桿菌組簡稱k組），半乳糖組（簡稱gal組）和細(xì)胞對照組接種于96孔板，用100倍半數(shù)組織感染量（TCID50），RV病毒分別感染12、24、36、48、72 h，收集細(xì)胞及上清液。未感染5種細(xì)胞作對照組。將收集好細(xì)胞及細(xì)胞液以6 000 r·min-1離心15min，收集上清。試劑盒檢測，操作步驟如下：

①標(biāo)準(zhǔn)品稀釋與加樣：酶標(biāo)板設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔10孔，在第一、二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μL，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；從第一、二孔中各取100μL分別加至第三、四孔，分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻；第三、四孔中先各取50μL棄掉，各取50μL分別加入第五、六孔中，分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL；在第五、六孔中各取50μL分別加入第七、八孔中，分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，混勻后從第七、八孔中各取50μL分別加入第九、十孔中，混勻后各取50μL棄掉（稀釋后各孔加樣量均為50 μL，濃度分別為15、10、5、2.5、1.25 ng a.i.·L-1）。

②加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，再加樣品液10μL（原細(xì)胞上清液稀釋5倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部。

③溫育：封板膜封板后置于37℃溫育30min。

④配液：30倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍后備用。

⑤洗滌：小心揭掉封板膜，棄掉液體，甩干后每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄掉，重復(fù)5次后拍干。

⑥加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。

⑦溫育：同步驟3。

⑧洗滌：同步驟5。

⑨顯色：每孔加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。

⑩終止：每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)。

?測定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長測量各孔吸光度。加終止液后15min內(nèi)測定。

1.2.6 RV的半數(shù)組織感染量檢測

RV病毒在MA104細(xì)胞上傳代增殖。將s、k、g、gal、細(xì)胞對照組以5×104·mL-1密度鋪入96孔板，待長滿單層后，將RV用DMEM培養(yǎng)基作10-1～10-8倍連續(xù)倍比稀釋，分別接種鋪滿細(xì)胞96孔板，每孔接種病毒量為100μL，每個稀釋度設(shè)置5個平行孔，同時設(shè)未加病毒細(xì)胞為對照，對照孔細(xì)胞只加維持液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4 d。持續(xù)觀察細(xì)胞CPE情況，采用Reed-Muench方法計算病毒TCID50。

logTCID50=高于50%病毒稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)對數(shù)。

1.2.7 RV感染中病毒定量檢測

將s、k、g、gal、正常細(xì)胞接種于96孔板，100倍TCID50的RV病毒分別感染12、24、36、48、72 h，收集細(xì)胞及上清液。將收集好細(xì)胞及細(xì)胞液，以6 000 r·min-1離心15min，收集上清。試劑盒檢測，按說明書操作。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步整理后，采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件作單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種益生菌上清最大無毒劑量

細(xì)胞活力＞80%的上清濃度為本試驗最大無毒劑量。1/8為3種益生菌上清最大無毒劑量（見表1）。

2.2 3種益生菌上清及半乳糖對IPEC-J2細(xì)胞表面半乳糖影響

在熒光顯微鏡下,可觀察到所有組別細(xì)胞表面均存在半乳糖。由圖1可知，半乳糖誘導(dǎo)后，細(xì)胞表面半乳糖增多，細(xì)胞熒光亮度最大（gal組），3種益生菌上清處理后細(xì)胞（s、k、g組）熒光亮度均大于正常組細(xì)胞（c組）。對照組細(xì)胞（c組）熒光亮度最弱。3種益生菌上清均改變IPEC-J2細(xì)胞表面半乳糖含量，細(xì)胞表面半乳糖增多。

2.3 3種益生菌上清及半乳糖對IPEC-J2細(xì)胞表面半乳糖苷酶影響

樣品濃度與OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2）。RV感染12～72 h時細(xì)胞中半乳糖苷酶時間趨勢如圖3所示。可知，RV感染IPEC細(xì)胞后24 h內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)半乳糖苷酶含量無明顯變化，24～48 h半乳糖苷酶含量下降，48～72 h半乳糖苷酶含量上升。

表1 益生菌上清最大無毒劑量Table 1 M axim um nontoxic dose of probiotics supernatant

圖1 食淀粉乳桿菌組、枯草芽孢桿菌組、干酪乳桿菌組、半乳糖組與對照組的FITC-RCA染色(100×)Fig.1 FITC-RCA stain of Lactobacillusamylovorus group,Bacillussubtilis group, Lactobacillus L.casei group,Controlgroup,Galactosegroup(100×)

RV感染中各組半乳糖苷酶濃度時間變化如圖4所示。未感染時，g、k、s、gal組半乳糖苷酶含量均低于細(xì)胞對照組（P＜0.05）；感染12和24 h時細(xì)胞對照組和g組半乳糖苷酶含量高于k、s、gal組（P＜0.05），正常細(xì)胞與g組無差異（P≥0.05）；感染48 h時，g和s組半乳糖苷酶顯著高于細(xì)胞對照組（P＜0.05）、k和gal組，g和s組間差異不顯著（P≥0.05）；感染72 h時，gal組顯著低于其他組（P＜0.05）。

圖2 半乳糖苷酶樣品濃度與OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curveof concentration and OD valueof galactosidase

圖3 RV感染后12～72h半乳糖苷酶含量變化Fig.3 Time trend ofgalactosidase content changes from 12 h to 72 h after in fection

圖4 RV感染中各組半乳糖苷酶濃度的時間變化(n=3)Fig.4 Tem poral changesofgalactosidase concentration in each group(n=3)

2.4 TCID50檢測結(jié)果

輪狀病毒對各組細(xì)胞半數(shù)組織感染量測定結(jié)果如圖5所示（標(biāo)識不同字母代表差異顯著）：對照組IPEC-J2細(xì)胞組PRV TCID50·0.1·mL-1為10-7.15±0.14，IPEC-J2細(xì)胞抗輪狀病毒感染能力顯著低于gal組TCID50·0.1·m L-1為10-4.875±0.115及其他益生菌組（P＜0.05）；g組TCID50·0.1mL-1為10-3.875±0.125，s組PRV TCID50·0.1 mL-1為10-4.125±0.138，k組PRV TCID50·0.1m L-1為10-4.16±0.144，3個益生菌處理組的抗輪狀病毒感染能力顯著高于正常組及半乳糖組（P＜0.05），各益生菌處理組之間抗輪狀病毒感染能力差異不顯著（P＞0.05）。

圖5 輪狀病毒侵襲Fig.5 Resultsof Rotavirus Invasion

圖6 樣品濃度與OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curveofsamp le concentration and OD value

圖7 感染12～72h RV含量的變化Fig.7 Changes in RV content from 12 h to72 h after infection

2.5 RV感染中病毒量檢測結(jié)果

RV含量與OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得RV感染的病毒量隨時間變化如圖7所示。由圖7可知，RV感染IPEC-J2細(xì)胞的前24 h內(nèi)細(xì)胞增值緩慢，24～48 h病毒迅速增殖，病毒量達(dá)到峰值，48～72 h病毒數(shù)量有所下降。各組細(xì)胞在RV感染后第12～72 hRV含量及同一時間各組細(xì)胞間差異見圖8。

RV感染后12 h，正常細(xì)胞RV量顯著高于g、k、s、gal組。g、k、s、gal組間差異不顯著；RV感染后第24 h，正常細(xì)胞RV量顯著高于g、k、s、gal組（P＜0.05）；g、k、s及gal組無顯著差異（P≥0.05）；感染第48 h，正常細(xì)胞中RV量顯著高于其他組（P＜0.05），g、k、s及gal組無顯著差異（P≥0.05）；感染第72 h，k、正常、s和gal組RV量無顯著差異（P≥0.05），gal組RV量高于g組（P＜0.05）。

圖8 RV感染細(xì)胞的病毒含量隨時間變化(n=3)Fig.8 RV infection of cellsw ith the changes in theamountof time(n=3)

3 討論

糖生物學(xué)涉及結(jié)構(gòu)、生物合成研究，生物和自然界中蛋白質(zhì)識別[18]，豬小腸上皮細(xì)胞中優(yōu)勢糖基為巖藻糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、甘露糖、N-乙酰基葡萄糖胺和半乳糖及多種糖基。豬小腸各段巖藻糖和甘露糖為優(yōu)勢糖基，腸道不同部位糖基組成比例不同。腸上皮細(xì)胞表面糖基存在多樣性，高速準(zhǔn)確檢測其表面糖基，確定和RV結(jié)合受體所含糖基種類至關(guān)重要。凝集素是一類可與糖專一共價可逆結(jié)合蛋白，具有高度專一性，為糖檢測常用物質(zhì)。本研究將經(jīng)過熒光標(biāo)記的蓖麻凝集素（FITC-RCA）與活細(xì)胞孵育，充分結(jié)合，除去未與半乳糖基結(jié)合多余熒光標(biāo)記的蓖麻凝集素，再檢測細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度，以細(xì)胞表面平均熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞表面半乳糖基含量?？焖贉?zhǔn)確地反映細(xì)胞表面半乳糖基化水平改變情況。

Freitas等證明多形擬桿菌分泌的可溶性因子可增加半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，但不改變唾液酸酶活性，調(diào)節(jié)翻譯后活動[8]。Haselhorst等發(fā)現(xiàn)輪狀病毒黏附細(xì)胞大多數(shù)通過半乳糖識別[19]。益生菌可縮短病毒性腹瀉持續(xù)時間[11]，且可通過分泌可溶性物質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞自動調(diào)節(jié)、刺激免疫系統(tǒng)而降低病毒感染，減少病毒對機(jī)體侵染。

半乳糖苷酶定量檢測顯示未感染時，g、k、s、gal組半乳糖苷酶含量均低于細(xì)胞對照組。RV感染12～72 h細(xì)胞中半乳糖苷酶時間趨勢如圖3。由圖可知在RV感染IPEC細(xì)胞后24 h內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)半乳糖苷酶含量呈上升趨勢，24～48 h內(nèi)半乳糖苷酶含量下降。這可能由于在感染24 h內(nèi)，RV黏附在細(xì)胞上未大量進(jìn)入宿主細(xì)胞[20]，病毒粒子細(xì)胞刺激半乳糖苷酶增多，細(xì)胞表面半乳糖減少，暴露更多RV親和糖基，有利于RV黏附、入侵。24～48 h RV大量入侵細(xì)胞進(jìn)入復(fù)制狀態(tài)，半乳糖苷酶可能代償性降低。s和g組半乳糖苷酶變化趨勢基本一致，具有相似抗感染機(jī)制。

本文推測，3種益生菌均可修飾細(xì)胞表面半乳糖，在細(xì)胞感染初期阻止細(xì)胞粘附和入侵，對半乳糖苷酶影響機(jī)制表現(xiàn)為多方面。因為半乳糖含量不僅與半乳糖苷酶有關(guān)，還受其他種類酶調(diào)控。益生菌上清的修飾作用除影響半乳糖相關(guān)酶類之外不排除存在一過性。即經(jīng)3種益生菌上清處理后細(xì)胞中半乳糖苷酶量減少。干酪乳桿菌和食淀粉乳桿菌可顯著減少細(xì)胞內(nèi)半乳糖苷酶，半乳糖苷酶可切掉細(xì)胞膜表面糖鏈末端半乳糖殘基，細(xì)胞表面半乳糖含量降低，半乳糖苷酶含量減少，細(xì)胞表面半乳糖增多。干酪乳桿菌、食淀粉乳桿菌可顯著減低細(xì)胞內(nèi)的半乳糖苷酶，細(xì)胞表面半乳糖含量增多，巖藻糖、甘露糖或唾液酸等糖基減少，產(chǎn)生占位或掩蔽效應(yīng)。

病毒測定結(jié)果顯示，3組益生菌組相對于正常組均顯著增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞抗輪狀病毒感染能力（P＜0.05）；gal組相對于正常組顯著增強(qiáng)抗輪狀病毒感染能力（P＜0.05）；凝集素?zé)晒饨Y(jié)果顯示，3組益生菌組及gal組相對于正常組均顯著上調(diào)半乳糖含量。RV定量檢測結(jié)果表明IPEC-J2細(xì)胞在感染后12～24 h RV增殖緩慢，24～48 h病毒迅速增殖，病毒量達(dá)峰值，48～72 h病毒數(shù)量下降。gal組在RV感染后24 h內(nèi)，RV量顯著低于任意組細(xì)胞，提示病毒復(fù)制期前半乳糖抗病毒作用最明顯，推測半乳糖可能影響病毒復(fù)制期前感染過程，即半乳糖主要抑制RV病毒對細(xì)胞粘附作用。3組益生菌上清組在RV感染48 h內(nèi)，RV量顯著低于未處理組RV含量，12 h內(nèi)3組間RV含量差異不顯著。說明這3種益生菌上清在RV感染包括黏附和增殖等過程具有持續(xù)抑制作用。益生菌可減少病毒對細(xì)胞受體黏附。Vollenbroich等證明干酪乳桿菌和多形擬桿菌可在體外改變細(xì)胞表面糖鏈，改變RV感染的細(xì)胞受體構(gòu)象，阻止RV感染[21]。本研究證明3種益生菌均可使細(xì)胞表面半乳糖增多，通過半乳糖擬誘導(dǎo)細(xì)胞并結(jié)合RV感染試驗證得知，細(xì)胞表面半乳糖增多可抵抗輪狀病毒感染。RV感染試驗證明益生菌上清可通過增加細(xì)胞對RV抵抗能力降低輪狀病毒感染程度，顯著降低RV感染細(xì)胞病毒量。因而推測干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌和食淀粉乳桿菌上清通過上調(diào)細(xì)胞表面半乳糖表達(dá)改變細(xì)胞表面糖基化，導(dǎo)致唾液酸掩蔽，抑制輪狀病毒進(jìn)入細(xì)胞及感染。

4 結(jié)論

綜上所述，細(xì)胞表面半乳糖增多可抑制RV黏附，干酪乳桿菌，枯草芽孢桿菌和食淀粉乳桿菌上清均可上調(diào)IPEC-J2細(xì)胞表面半乳糖含量，阻止RV黏附，抑制輪狀病毒感染；3組益生菌上清還可提高細(xì)胞的抗RV能力。

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Effect of p robiotic increase IPEC-J2 cell surface galactose on the inhibition of RV infection

WEIPing,ZHANG Rui,ZHANG Hongyu
(School of Veterinary Medicines,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin 150030,China)

Rotaviruses attached to intestinal cells requires glycan recognition.Some bacteria from the gutm icroflora have been shown to m odify cell-surface glycans.In this study,IPEC-J2 cultured cells were incubated w ith supernatants of probiotics and then infected w ith rotavirus.The porcine sm all intestina l epithe lia l ce ll line IPEC-J2 was incubated w ith three p robiotic supernatants and then in fected w ith porcine rotavirus(PRV).The surface galactose of IPEC-J2 cells was measured through lectin fluorescence technique,and the virulence of rotavirus was detected in each treatment group.The results showed that the PRV TCID50·0.1 m L-1of controlgroup,Lactobacillus casei goup,Lactobacillus amylovorus group and Bacillus Subtilis group were 10-7.15±0.14,10-3.875±0.125,10-4.125±0.138and 10-4.16±0.144.The RV content of the three probiotics group was significantly lower than that of the untreated group w ithin 48 h o f RV in fection.Lectin fluorescence labe ling indicated that the three p robiotics supernatants cou ld change the contento f ga lactose on the surface o f the ce lls.Lactobacillus casei supernatant,Lactobacillus amylovorus supernatant and Bacillus subtilis supernatant could increase the content ofgalactose on the surface of IPEC-J2 cells,im prove the ability of anti-RV infection,inhibit the adhesion of the virus,and thus p lay a role in the protection of intestinalepithelialcells.

probiotics;rotavirus;lectin;galactose

S855.3；S858.28

A

1005-9369（2017）04-0036-09

時間2017-4-24 6:19:59[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170424.0619.012.html

2017-03-28

黑龍江省教育廳重點項目（12521z001）；哈爾濱市科技局項目（2014RFXGJ096）

魏萍（1961-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為獸醫(yī)傳染病學(xué)與流行病學(xué)。E-mail:weiiping@163.com