王雅楠，薛莉，雷家軍

（沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院，沈陽110866）

新疆百合鱗片離體培養(yǎng)研究

王雅楠，薛莉，雷家軍*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院，沈陽110866）

以新疆百合鱗片為外植體，建立新疆百合鱗片組織培養(yǎng)再生體系。結(jié)果表明，新疆百合鱗片最佳消毒方法為70%酒精處理30 s后0.1%HgCl2浸泡15m in；最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1mg·L-16-BA+1mg·L-1NAA；不同部位鱗片誘導(dǎo)率為內(nèi)層＞中層＞外層、中部＞下部＞上部。最適增殖培養(yǎng)基為MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA，增殖系數(shù)達3.46；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2mg·L-1NAA+0.2mg·L-1IBA，生根率達100%。

新疆百合；組織培養(yǎng)；鱗片

王雅楠,薛莉,雷家軍.新疆百合鱗片離體培養(yǎng)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2017,48(4):30-35.

Wang Yanan,Xue Li,LeiJiajun.Study on cu lture in vitro of sca les in Lilium martagon var.pilosiuscu lum[J].JournalofNortheastAgricu lturalUniversity,2017,48(4):30-35.(in Chinese w ith Eng lish abstract)

新疆百合（Lilium martagon var.pilosiusculum Freyn）為百合科百合屬多年生草本植物，是中國境內(nèi)除藏百合（L.paradoxum）、青島百合（L.tsing?tauense）和東北百合（L.distichum）外的4種輪葉百合之一。新疆百合花朵下垂，花瓣呈紫紅色，有斑點，花梗先端彎曲，觀賞性狀良好，具有珍貴食用和藥用價值。但新疆百合分布范圍狹窄，主要在新疆阿爾泰山及薩吾爾山地區(qū)[1]，生長于海拔200～2 500m山坡或林下灌木叢中[2]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)在百合種球快速繁殖中應(yīng)用廣泛。Hussey等開展百合離體培養(yǎng)研究[3]。羅鳳霞等研究表明新鐵炮百合不同外植體誘導(dǎo)再生能力依次為種子＞鱗片＞花絲＞花瓣＞葉片[4]。柳玉晶等以東方百合品種‘Bernini’的花柱、花絲、花瓣外植體通過愈傷組織途經(jīng)成功誘導(dǎo)植株[5]。王剛等研究認為MS+0.7～1.0mg·L-16-BA+0.07～0.2mg·L-1NAA條件下有利蘭州百合（L.davidii var.unicolor Salisb.）鱗片誘導(dǎo)成苗[6]。雷家軍等以鱗片作外植體，分別對垂花百合（L.cernum Kom.）和東北百合（L.distichum Nakai）作大量增殖擴繁[7-8]。孫旭才等試驗表明細葉百合（L.pumilum DC.）在1/2MS+0.5 mg·L-1IBA條件下生根培養(yǎng)中生根最快，生根率達100%[9]。目前新疆百合研究多集中在藥用價值[1]和核型分析[10]等方面，離體再生研究未見報道。本研究以新疆百合鱗片為外植體作誘導(dǎo)、擴繁及生根試驗，建立有效新疆百合離體再生體系，為加快新疆百合的繁殖利用及進一步誘變育種、雜交育種及分子育種奠定組培基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆百合（Lilium martagon var.pilosiusculum Freyn）引自新疆阿爾泰山，栽植保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學國家百合種質(zhì)資源庫。

1.2 方法

1.2.1 種球處理及培養(yǎng)條件

取飽滿無病、無機械損傷，生長健壯新疆百合鱗片，洗衣粉浸泡15min，流水沖洗2 h，置于超凈工作臺，無菌濾紙吸干多余水分待用。

試驗用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加30 g·L-1蔗糖，3.5 g·L-1瓊脂粉，pH調(diào)至5.8。培養(yǎng)條件為23～25℃，光照強度為2 000 lx，每天光照16 h。

1.2.2 鱗片消毒

將新疆百合鱗片用70%酒精處理30 s后，HgCl2消毒處理，消毒時間分別為5、10、15、20min。再用無菌水沖洗3～4次，晾干后接種在培養(yǎng)基中，每處理20個完整鱗片，3次重復(fù)，10 d后統(tǒng)計污染率和死亡率。

污染率（%）=（污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%

死亡率（%）=（死亡外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%

1.2.3 鱗片不同部位誘導(dǎo)不定芽

將種球鱗莖剝開，分為外、中、內(nèi)3層，分別用70%酒精處理30 s、HgCl2消毒15min，消毒后將不同層鱗片切成上、中、下3部分，將鱗片分成9個不同部位（外層上部、中部、下部；中層上部、中部、下部；內(nèi)層上部、中部、下部），分別接種于MS基本培養(yǎng)基中，每處理20個，3次重復(fù)。連續(xù)觀察鱗片誘導(dǎo)情況，培養(yǎng)10 d后統(tǒng)計污染率，60 d后統(tǒng)計誘導(dǎo)率。

1.2.4 不同激素濃度配比誘導(dǎo)不定芽

將百合鱗片接種在不同濃度6-BA（0.5、1、2 mg·L-1）和NAA（0.5、1mg·L-1）的MS培養(yǎng)基中，以不添加6-BA和NAA的MS基本培養(yǎng)基為對照。每處理25個完整鱗片，3次重復(fù)，觀察鱗片誘導(dǎo)情況，60 d后統(tǒng)計誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率（%）=（誘導(dǎo)不定芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%

1.2.5 不同激素濃度配比誘導(dǎo)增殖不定芽

將誘導(dǎo)出高2～3 cm不定芽接種到不同濃度6-BA（0.5、1、1.5mg·L-1）和NAA（0.05、0.1mg· L-1）MS培養(yǎng)基中。每處理接種80個不定芽，60 d后觀察增殖生長情況，統(tǒng)計增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=增殖不定芽數(shù)/接種不定芽數(shù)

1.2.6 不同激素及濃度配比誘導(dǎo)試管苗生根

將增殖培養(yǎng)基中長至5 cm以上、尚未生根的健壯苗轉(zhuǎn)入添加不同濃度NAA及IBA的1/2MS培養(yǎng)基中。每處理接種20株，3次重復(fù)。30 d后觀察統(tǒng)計生根情況。

生根率（%）=（生根株數(shù)/接種株數(shù)）×100%平均單株生根數(shù)=生根總數(shù)/株數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對新疆百合鱗片消毒效果影響

由表1可知，不同消毒時間的污染率和死亡率存在顯著差異，隨著消毒時間延長，污染率下降，死亡率上升。0.1%HgCl2消毒20min時，外植體污染率（7.22%）顯著低于其他處理；其次為15min處理（10.55%）；20min處理死亡率（25.55%）顯著高于其他3個處理，15min處理（17.77%）和10min處理（14.99%）死亡率差異不顯著?？芍x用0.1%HgCl2消毒15min為宜。

2.2 新疆百合鱗片不同部位對不定芽誘導(dǎo)影響

由表2可知，不同層及不同鱗片部位誘導(dǎo)不定芽能力差異較大。內(nèi)層中部誘導(dǎo)率（48.08%）最高，顯著高于其他處理，污染率（30.55%）較低。外層鱗片污染率最高，誘導(dǎo)率低于其他層?？傮w呈現(xiàn)規(guī)律為：同一層鱗片誘導(dǎo)能力為中部＞下部＞上部，同一部位鱗片誘導(dǎo)能力為內(nèi)層＞中層＞外層。

表1 不同消毒時間對新疆百合鱗片消毒效果影響Table1 Effectof different timeon disin fection of bu lb scales in Lilium martagon var.pilosiusculum

表2 新疆百合鱗片不同部位對不定芽誘導(dǎo)影響Table2 Effectof different positionsof bulb scaleson induction in Lilium martagon var.pilosiuscu lum

2.3 不同激素濃度配比對新疆百合鱗片誘導(dǎo)影響

將鱗片接種于培養(yǎng)基中（圖1A），1周內(nèi)開始膨大增厚，鱗片由黃白色變?yōu)榫G色，部分切口邊緣出現(xiàn)紅褐色，2周內(nèi)鱗片基部或邊緣形成1個或幾個白色小突起，30 d后白色小突起開始分化形成不定芽（圖1B），60 d不定芽增殖成叢（圖1C）。

不同激素配比對新疆百合鱗片誘導(dǎo)率影響見表3。由表3可知，各處理間差異較大，I4處理（MS+ 1mg·L-16-BA+1mg·L-1NAA）誘導(dǎo)率（78.66%）顯著高于其他處理，其次為未添加NAA和6-BA對照組，而I1、I2、I3處理間差異不顯著，分別為44.44%、39.99%和43.99%。I5處理誘導(dǎo)率（23.11%）顯著低于其他處理。因此，新疆百合鱗片最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1mg·L-16-BA+1mg·L-1NAA。

2.4 不同激素濃度配比對新疆百合鱗片不定芽增殖影響

將不定芽接種至增殖培養(yǎng)基中，30 d長成高5～6 cm大苗（圖1D）。

由表4可知，不同激素濃度配比對新疆百合試管苗增殖影響較大，其中G1處理（MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA）增殖系數(shù)為3.46，顯著高于其他處理，不定芽成簇生長，且苗生長健壯（圖2A）。G2、G4和G6處理間差異不顯著，增殖系數(shù)分別為2.51、2.25、2.59，長勢一般（圖2B、D、F）。G3和G5處理增殖系數(shù)較低，長勢較弱，葉片較細（圖2C、E）。

因此，新疆百合最適增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA。

2.5 不同激素及濃度對新疆百合試管苗生根影響

將擴繁后獲得的未生根試管苗轉(zhuǎn)入不同激素及濃度生根培養(yǎng)基中，20 d根部出現(xiàn)白色突起。隨后突起逐漸伸長，形成不定根，30 d左右不定根增長、變粗（圖1E）。由表5可知，H7處理（1/2MS+ 0.2 mg·L-1NAA+0.2mg·L-1IBA）生根率（100%）顯著高于其他處理，且植株健壯，平均生根數(shù)為17.0條；H8生根率為93.49%，長勢良好，根多細長，平均生根數(shù)為16.6條；H2、H3、H4、H6處理間差異不顯著，生根率在80%左右，長勢一般，根較細。綜上，最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-1NAA+0.2mg·L-1IBA（圖3）。

圖1 新疆百合鱗片離體培養(yǎng)過程Fig.1 Bu lb scales in vitro culture of L.martagon var.pilosiuscu lum

表3 不同激素濃度配比對新疆百合鱗片誘導(dǎo)影響Table 3 Effect of different hormone concentrationson scales induction of L.martagon var.pilosiusculum

表4 不同激素濃度配比對新疆百合不定芽誘導(dǎo)增殖影響Table4 Effectsofdifferenthormone concentrationson the proliferation of bulb letsof L.martagon var.pilosiusculum

圖2 不同培養(yǎng)基對新疆百合不定芽誘導(dǎo)增殖影響Fig.2 Effectsof different cu lturemedia on shoots regeneration of L.martagon var.pilosiusculum

表5 不同激素及濃度配比對新疆百合試管苗生根影響Tab le 5 Effectsof different concentration of hormone on rooting of L.martagon var.pilosiuscu lum

圖3 不同培養(yǎng)基對新疆百合試管苗生根影響Fig.3 Effectsofdifferent cu lturemedia on rooting of L.martagon var.pilosiusculum

3 討論與結(jié)論

我國是百合屬植物自然分布中心之一，有毛百合（Lilium dauricum）、臺灣百合（L.formosanum）及新疆百合（L.martagon var.pilosiusculum）[11]等。野生百合原種是改良現(xiàn)代百合品種花色、香味、株型、抗性重要親本。我國對野生百合資源利用較少，大量野生百合資源生境遭到嚴重破壞，瀕臨滅絕。組織培養(yǎng)技術(shù)具有快速繁殖特點，可應(yīng)用于種質(zhì)資源保存和利用[12-13]。新疆百合生長在高海拔、高緯度高山地區(qū)抗寒抗逆性強，為輪葉百合之一，花色艷麗，觀賞及藥用價值較高。因此，建立新疆百合高效離體繁殖技術(shù)具有重要意義。

目前，國內(nèi)外學者已從激素濃度、外植體選擇等方面對不同百合離體培養(yǎng)作系統(tǒng)研究，如麝香百合（L.longiflorum）[14]、青島百合（L.tsingtauense）[15]、細葉百合（L.pumilum）[16]、蘭州百合（L.davidii var. unicdor）[17]等。本試驗以新疆百合鱗片為外植體，發(fā)現(xiàn)最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1mg·L-16-BA+1mg· L-1NAA，最適增殖培養(yǎng)基為MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA，與垂花百合鱗片外植體最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基結(jié)果一致[7]。王冬梅等認為IBA具有較強生根作用，促生根多且細長，而NAA促生根少且粗[18]。本試驗中，在1/2 MS培養(yǎng)基上添加0.2 mg·L-1IBA和0.2mg·L-1NAA生根率可達100%，且根數(shù)量多、質(zhì)量好、馴化移栽成活率較高。儲成才等試驗表明朱頂紅內(nèi)層鱗片具有較高形態(tài)發(fā)生能力，由內(nèi)向外逐漸降低[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)新疆百合同一層鱗片不同部位誘導(dǎo)不定芽能力依次為中部＞下部＞上部，與Pan等在卷丹百合同層鱗片不同部位誘導(dǎo)能力依次為下部＞中部＞上部的試驗結(jié)果不完全一致，可能與百合品種有關(guān)[20]。本研究建立新疆百合鱗片離體再生和快繁體系，可為其利用、保護奠定基礎(chǔ)。

[1]帕里罕,馬忠杰.新疆黨參、新疆野百合、西北百合的質(zhì)量考察[J].新疆中醫(yī)藥,2007,25(5):76-78.

[2]中國科學院植物志編輯委員會.中國植物志(第14卷)[M].北京:科學出版社,1980.

[3]Hussey G.Totipotency in tissue explants and callus of somemem? bers of the Liliaceae,Iridaceae,and Amaryllidaceae[J].Journal of Experimental Botany,1975,26(2):253-262.

[4]羅鳳霞,徐桂華,金麗麗,等.新鐵炮百合微繁的研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,2000,31(3):254-257.

[5]柳玉晶,龔束芳,樊金萍,等.百合愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2007,38(3):352-355.

[6]王剛,杜捷,李桂英,等.蘭州百合和野百合組織培養(yǎng)及快速繁殖研究[J].西北師范大學學報:自然科學版,2002,38(1):69-71.

[7]雷家軍,徐瑩.垂花百合離體培養(yǎng)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2013,44(1):96-100.

[8]雷家軍,潘玲立.東北百合鱗片離體培養(yǎng)研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,2009,40(5):532-535.

[9]孫旭才,馮春光,黃春燕,等.細葉百合組培繼代培養(yǎng)與生根移栽的研究[J].河北林果研究,2008,23(2):211-213.

[10]王中軒,魏遲,廉玉芹,等.中國原產(chǎn)4種野生百合的核型分析[J].園藝學報,2013,40(11):2207-2212.

[11]龍雅宜,張金政,張?zhí)m年.百合—球根花卉之王[M].北京:金盾出版社,1999.

[12]Villalobos VM,Engelmann F.Ex situ conservation of p lantgerm?plasm using biotechnology[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,1995,11(4):375-382.

[13]傅伊倩.幾種野生百合離體保存技術(shù)的研究[D].北京:北京林業(yè)大學,2012.

[14]Arzate-Fernandez A M,Nakazaki T,Okumoto Y,et al.Efficient callus induction and plant regeneration from filamentswith anther in lily(Lilium longiflorum Thunb.)[J].Plant Cell Reports,1997, 16(12):836-840.

[15]齊春敏,王奎玲,劉慶超,等.青島百合組織培養(yǎng)研究[J].中國農(nóng)學通報,2008,24(4):85-88.

[16]葛蓓孛.細葉百合組織培養(yǎng)及多倍體誘導(dǎo)研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學,2010.

[17]段超.幾種百合組織培養(yǎng)及多倍體育種技術(shù)的研究[D].北京:北京林業(yè)大學,2009.

[18]王冬梅,黃學林.細胞分裂素類物質(zhì)在植物組織培養(yǎng)中的作用機制[J].植物生理學通訊,1996,32(5):373-377.

[19]儲成才,李大衛(wèi).不同培養(yǎng)條件對朱頂紅形態(tài)發(fā)生的影響[J].信陽師范學院學報:自然科學學版,1991,4(1):85-89.

[20]Pan Y Z,Zhao JP,Zeng X M,etal.Study on tissue culture and rapid propagation of wild Lilium lancifolium[J].Medicinal Plant, 2011,2(7):69-71.

Study on culture in vitro of scales in Lilium m artagon var.pilosiusculum/

WANG Yanan,XUE Li,LEIJiajun
(School of Horticulture,Shenyang Agricu ltural University,Shenyang 110866,China)

To deve lop a suitable app roach for the rapid propagation o f Lilium martagon var. pilosiusculum by tissue culture,scales were tried as the exp lants in this paper.The results showed that the bestdisinfectionmethod to the bulb scale exp lants was 70%ethanol for 30 s,followed by 0.1%HgCl2for 15 m in.The suitablemedium for induction was MS+1mg·L-16-BA+1mg·L-1NAA.The induction rate scale was ranked with the orders of inner layer＞m iddle layer＞outer layer andm iddle part＞basalpart＞upperpart.MS+ 0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA was the optimal subculture medium w ith 3.46 multip lication coefficient. The suitab le rootingmedium was 1/2 MS+0.2m g·L-1NAA+0.2mg·L-1IBAw ith a rooting rate o f100%.

Lilium martagon var.pilosiusculum;tissue culture;scale

S682.2+9

A

1005-9369（2017）04-0030-06

時間2017-4-24 6:19:44[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170424.0619.006.html

2017-01-03

遼寧省教育廳基金項目（202053092）

王雅楠（1992-），女，碩士研究生，研究方向為觀賞植物遺傳育種。E-mail:yanansunnyy@163.com

*通訊作者：雷家軍，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為觀賞植物遺傳育種。E-mail:jiajunleisy@163.com