蔡文濤(1.湖北大學(xué)中藥生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430062；2.湖北省生物資源綠色協(xié)同創(chuàng)新中心(湖北大學(xué))，湖北 武漢，430062；3.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢，430062)

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MTT法和CCK-8法檢測(cè)中藥抗病毒活性成分細(xì)胞毒性的比較

蔡文濤
(1.湖北大學(xué)中藥生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430062；2.湖北省生物資源綠色協(xié)同創(chuàng)新中心(湖北大學(xué))，湖北 武漢，430062；3.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢，430062)

0 引言

中藥是大自然賜予人類的無價(jià)瑰寶，對(duì)人類防治疾病，強(qiáng)身健體具有寶貴的利用價(jià)值. 從中藥中發(fā)掘天然抗病毒活性成分，是開發(fā)抗病毒藥物的重要途徑.穿心蓮為爵床科植物穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees的干燥地上部分，是傳統(tǒng)中藥材之一.其主要藥效成分是二萜內(nèi)酯類化合物，如穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯.現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，穿心蓮具有消炎解熱、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、免疫刺激、保肝利膽等功效.在抗病毒作用方面，穿心蓮表現(xiàn)出對(duì)丙肝病毒(HCV)[1]、人類免疫缺陷病毒(HIV)[2]、流感病毒(IV)[3]等均具有一定抑制效果.進(jìn)行穿心蓮中抗病毒成分的篩選將為后續(xù)深入研究其抗病毒的作用及機(jī)制提供科學(xué)依據(jù).開展中藥成分抗病毒活性篩選及研究，需要進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，而且首先要進(jìn)行中藥成分的毒性研究. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通常選擇動(dòng)物作為模型，由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)、成本高，難以開展大量中藥成分的毒性檢測(cè)及抗病毒活性篩選. 實(shí)際情況下，常先進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，選擇細(xì)胞模型，進(jìn)行中藥成分毒性的測(cè)定及其抗病毒活性的初篩.

檢測(cè)藥物在細(xì)胞上的毒性，通常采用的方法是測(cè)定藥物加入后細(xì)胞的存活與增殖情況. 其中，比較經(jīng)典的方法有四甲基偶氮唑鹽(MTT)法[4-5]. 自1983年Mosmann建立MTT比色法以來，由于其簡單、經(jīng)濟(jì)、無放射性污染等特點(diǎn)，MTT法已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域測(cè)定細(xì)胞生長及增殖情況的常用方法. 但是由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè). 這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者的健康也有損害. 為了克服MTT法檢測(cè)的不足之處，近些年又陸續(xù)出現(xiàn)一些新的檢測(cè)方法，如MTS[6]，WST-1[7]，XTT[8]，Cell Counting Kit(CCK-8)法[9]等. 其中CCK-8法是應(yīng)用得相對(duì)比較廣泛的方法之一[10-11]. CCK-8法是用于測(cè)定細(xì)胞增殖或毒性實(shí)驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的一種高靈敏度、無放射性的比色檢測(cè)法. CCK-8試劑被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成的橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，可直接進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)誤差比較小.

本文中將MTT法和CCK-8法同時(shí)應(yīng)用于檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等具有潛在抗病毒作用的中藥成分的細(xì)胞毒性研究中. 實(shí)驗(yàn)中選擇的是A549人肺腺癌細(xì)胞株. 從實(shí)驗(yàn)的測(cè)定條件、結(jié)果的重復(fù)性及準(zhǔn)確性等方面，比較兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 A549細(xì)胞(購于美國菌種保藏中心)用加100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素溶液的含10% 胎牛血清(FBS，購于GIBCO公司)的F12培養(yǎng)基(HyClone公司)培養(yǎng).

1.1.2 藥品 脫水穿心蓮內(nèi)酯(14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide)和穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)均購于中國藥品檢驗(yàn)所，純度>99.99%. 藥品用二甲亞砜(DMSO，購于美國Sigma公司)配制為濃度為20 mg/mL的儲(chǔ)備液，臨用前用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成所需濃度.

1.1.3 試劑及試劑盒 MTT(購于美國Sigma公司)溶解(超聲促溶)于20 mL滅菌的 PBS溶液中，經(jīng)0.22 μm孔徑濾器過濾除菌后，4 ℃避光保存?zhèn)溆?CCK-8試劑盒購于Dojindo Molecular Technologies公司.

1.1.4 儀器 超凈工作臺(tái)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)，HEAR Cell CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，Bio-Rad多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，Olympus IX 70倒置顯微鏡(日本Tokyo公司).

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理 MTT法是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性黃色可溶性 MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能. DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測(cè)定其吸光度值(Optical density,OD值).

CCK-8法是利用含有WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性、能溶解于組織培養(yǎng)基中的橙黃色甲瓚染料. 用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測(cè)定其OD值.

在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，兩種方法中生成的甲瓚量均與活細(xì)胞數(shù)量成正比. 測(cè)定的OD值越大，表明活細(xì)胞數(shù)越多. 通過OD值的測(cè)定，可以準(zhǔn)確反映實(shí)驗(yàn)板各孔中活細(xì)胞的相對(duì)量. 加入藥物作用的孔中活細(xì)胞數(shù)量與加入溶劑處理的孔中活細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較，可以間接衡量藥物的細(xì)胞毒性情況.

在MTT法中，接下來向每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)和80 μL無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液. 每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解. 用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm的吸光度(OD)值. 實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT和DMSO)和空白對(duì)照(無細(xì)胞、加培養(yǎng)基、MTT和DMSO).

在CCK-8法中，接下來向每孔加入10 μL CCK-8試劑和90 μL無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 min. 用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm的OD值. 實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液和CCK-8)和空白對(duì)照(無細(xì)胞、加培養(yǎng)基和CCK-8).

利用公式計(jì)算細(xì)胞存活率：Cell viability /%=(OD樣品-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白) ×100，并利用改良寇式法計(jì)算CC50(The median cytotoxic concentration，中位濃度即對(duì)50%的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性時(shí)對(duì)應(yīng)的藥物濃度).

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件及改良寇式方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理及統(tǒng)計(jì)分析. 所得結(jié)果用平均值(x)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示，采用Student’st-test進(jìn)行兩組均數(shù)比較.

2 結(jié)果與分析

表1 不同濃度化合物對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

用Student’s t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析.*, **, ***分別表示與空白對(duì)照比較p<0.05,p<0.01,p<0.001;#,##,###分別表示與相同濃度MTT法測(cè)定結(jié)果比較p<0.05,p<0.01,p<0.001.

圖1 MTT法和CCK-8法檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯毒性時(shí)A549細(xì)胞形

圖2 MTT法和CCK-8法檢測(cè)脫水穿心蓮內(nèi)酯毒性時(shí)A549細(xì)胞形

2.3 兩種不同方法檢測(cè)的精密度比較 分別用MTT法和CCK-8法檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯作用于A549細(xì)胞的存活率，計(jì)算得到CC50.用3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的CC50結(jié)果計(jì)算變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)，比較兩種方法的精密度，結(jié)果見表2.用MTT法檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯的CC50時(shí)，3次結(jié)果的CV為9.44%，而相應(yīng)地用CCK-8法檢測(cè)時(shí)，CV為2.51%.這說明用CCK-8法檢測(cè)CC50的離散程度較小，方法的精密度較MTT法更高.同樣，可以比較用MTT法和CCK-8法檢測(cè)脫水穿心蓮內(nèi)酯CC50的CV，前者為7.51%，后者為1.52%，也說明CCK-8法檢測(cè)CC50的精密度較MTT法更高.

表2 兩種方法測(cè)定的CC50值的CV比較

2.4 兩種不同方法檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的毒性比較 由表3可知，用MTT法和CCK-8法檢測(cè)得到的穿心蓮內(nèi)酯的CC50分別為22.51和12.17 μg/mL，結(jié)果之間存在一定差異；另外，應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件擬合y(OD值)與化合物的濃度x(μg/mL)的關(guān)系得到非線性的回歸方程，擬合優(yōu)度的判定系數(shù)(RNew)分別為：0.989 1和0.992 8.另外，表1中CCK-8法測(cè)定得到的不同濃度下細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)比對(duì)應(yīng)濃度下MTT法測(cè)定得到數(shù)據(jù)的SD小.綜上，說明CCK-8法測(cè)定的誤差小，該方法的準(zhǔn)確度相對(duì)MTT法更高.

用MTT法和CCK-8法檢測(cè)得到的脫水穿心蓮內(nèi)酯的CC50分別為21.40和19.84 μg/mL，結(jié)果之間比較接近；另外，應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件擬合y(OD值)與化合物的濃度x(μg/mL)的關(guān)系得到非線性的回歸方程，擬合優(yōu)度的判定系數(shù)(RNew)分別為：0.987 8和0.997 1.同上進(jìn)行細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)的SD值的比較，也可得出CCK-8法測(cè)定的準(zhǔn)確度更高的結(jié)論.

表3 兩種方法檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯毒性的比較

用 Student’st-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析.**和ns分別表示與MTT法測(cè)定結(jié)果比較有極顯著性差異(p<0.01)和無顯著性差異.

3 討論

目前，已有報(bào)道認(rèn)為CCK-8法是相對(duì)MTT法更為簡便、快捷且應(yīng)用成熟的細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)的方法.如侯春梅等在懸浮細(xì)胞的增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CCK-8法重復(fù)性好、靈敏度高，明顯優(yōu)于MTT法[12].在應(yīng)用MTT和CCK-8法檢測(cè)5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑在WiDr、SW620和HT-29等3種癌細(xì)胞株中的抗增殖研究中也發(fā)現(xiàn)CCK-8法是更靈敏的檢測(cè)方法[13].

綜合本文中的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)CCK-8法相對(duì)MTT法而言，精密度和準(zhǔn)確度均更高，操作更為簡便和快速，對(duì)實(shí)驗(yàn)者和環(huán)境危害低，值得在細(xì)胞增殖和藥物毒性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)中推廣應(yīng)用.

[1] Lee J C, Tseng C K, Young K C, et al. Andrographolide exerts anti-hepatitis C virus activity by up-regulating haeme oxygenase-1 via the p38 MAPK/Nrf2 pathway in human hepatoma cells[J]. Brit J Pharmacol, 2014, 171(1): 237-252.

[2] Calabrese C, Berman S H, Babish J G, et al. A phase I trial of Andrographolide in HIV positive patients and normal volunteers[J]. Phytother Res, 2000, 14, 5: 333-335.

[3] Cai W T, Li Y T, Chen S R, et al. 14-Deoxy-11,12-dehydroandrographolide exerts anti-influenza A virus activity and inhibits replication of H5N1 virus by restraining nuclear export of viral ribonucleoprotein complexes[J]. Antiviral Res, 2015, 118:82-92.

[4] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods, 1983, 65: 55-63.

[5] Twentyman P R, Imscombe M. A study of some variables in a tetrazolium dye(MTT) bassed assay for cell growth and chemosensitxity[J]. BRJ Cancer, 1987, 56(3): 279-285.

[6] Tian Z, An N, Zhou B, et al. Cytotoxic diarylheptanoid induces cell cycle arrest and apoptosis via increasing ATF3 and stabilizing p53 in SH-SY5Y cells[J]. Cancer Chemoth Pharm, 2009, 63(6): 1131-1139.

[7] Chicca A, Pellati F, Adinolfi B, et al. Cytotoxic activity of polyacetylenes and polyenes isolated from roots of Echinacea pallida[J]. Brit J Pharmacol, 2008, 153(5): 879-885.

[8] Huang H S, Chiou J F, Chiu H F, et al. Synthesis of symmetrical 1,5-bis-thio-substituted anthraquinones for cytotoxicity in cultured tumor cells and lipid peroxidation[J]. Chem Pharm Bull, 2002, 55(11): 1491-1494.

[9] Huang H Y, Liu J J, Xi R R, et al. An investigation of hormesis of trichloroethylene in L-02 liver cells by differential proteomic analysis[J]. Mol Biol Rep, 2009, 36(8): 2119-2129.

[10] Zhang L S W, Baumer W, Monteiro-Riviere N A. Cellular uptake mechanisms and toxicity of quantum dots in dendritic cells[J]. Nanomedicine, 2011, 6(5): 777-791.

[11] Guan S, Ge D, Liu T Q, et al. Protocatechuic acid promotes cell proliferation and reduces basal apoptosis in cultured neural stem cells[J]. Toxicol In Vitro, 2009, 23(2): 201-208.

[12] 侯春梅, 李新穎, 葉偉亮, 等. MTT法和CCK-8法檢測(cè)懸浮細(xì)胞增殖的比較[J]. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊, 2009, 33(4): 400-402.

[13] Failli A, Legitimo A, Orsini G, et al. Antiproliferative effects of 5-fluorouracil and oxaliplatin in colon cancer cell lines: comparison of three different cytotoxicity assays[J]. J Biol Reg Homeos Ag, 2013, 27(1)：275-284.

[14] Guo Z J, Xiong H, Xin L, Jun Q Q, et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity[J]. RSC Advances, 2015, 5(66):53240-53244.

(責(zé)任編輯 游俊)

The comparision of MTT and CCK-8 by detecting cytotoxicity ofantiviral active components in traditional Chinese medicine

CAI Wentao

(1.Hubei Province Key Laboratory of Biotechnology of Chinese Traditional Medicine(Hubei University), Wuhan 430062, China；2.Hubei Collaborative Innovation Centre for Green Transformation of Bio-Resources(Hubei University), Wuhan 430062, China；3.College of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, China)

To investigate the cytotoxicity in vitro is the first step of screening the antiviral active of traditional Chinese medicine(TCM). In our study, MTT and CCK-8 were used to test the cytotoxicity of two promising antiviral components in a TCM namedAndrographispaniculata, andrographolide and 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide in human lung epithelial A549 cell line. Cell viabilities from the two methods were identical that non-toxic concentrations of andrographolide and 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide were 0—5 μg/mL and 0—10 μg/mL, respectively. Coefficient of variation(CV) ofCC50of andrographolide and 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide by MTT were both higher than that by CCK-8, which suggested that precision of CCK-8 was higher than MTT. Determination coefficients of goodness of fit in regression equation and standard deviation of cell viability indicated that accuracy of CCK-8 was also higher than MTT. Furthermore, CCK-8 was easier and faster in manipulation and less dangerous to experimenter and environment, which was worthy applying in the test of cellular proliferation and toxicity of medicine.Key words：MTT; CCK-8; cytotoxicity; antiviral component

2016-12-18

湖北大學(xué)自然科學(xué)基金(170041)資助

蔡文濤(1980-)，女，講師， E-mail: yetar@163.com

1000-2375(2017)03-0305-06

R966

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2017.03.016