梁江洪　李鳳珍　龍朝陽(yáng)　鐘麗雁　柏春暉　梁艷　蔣桂江　王苑儷

[摘要]目的：以膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型為基礎(chǔ)，附加模擬的風(fēng)、寒、濕、熱環(huán)境，建立符合壯醫(yī)病因理論的動(dòng)物模型。方法：將40只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)證組與陰證組每組各10只，除空白外均采用弗氏不完全佐劑和牛II型膠原蛋白誘導(dǎo)大鼠CAI模型，陽(yáng)證組在每天附加風(fēng)、濕、熱刺激持續(xù)lh，條件控制：風(fēng)速5m/s，相對(duì)濕度90%，溫度（37±1）℃；陰證組每天附加風(fēng)、寒、濕刺激持續(xù)1h，條件控制：風(fēng)速5m/s，相對(duì)濕度90%，溫度（8±1）℃。比較各組大鼠關(guān)節(jié)炎-體長(zhǎng)溫度差值、計(jì)算關(guān)節(jié)炎癥積分以及ELISA只測(cè)定TNF-a、IL-1B水平的差異結(jié)果：陰證組關(guān)節(jié)-體表溫度差值、炎癥指數(shù)方面均低于陽(yáng)證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陰證組大鼠血清TNF-d、IL-1B水平均低于陽(yáng)證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：通過(guò)風(fēng)、寒、濕刺激的CIA大鼠可做為陰證模型的參考，通過(guò)風(fēng)、濕、熱刺激的CIA大鼠可做為陽(yáng)證模型的參考。同時(shí)也存在造模復(fù)雜化、大鼠死亡率增的缺點(diǎn)，有待進(jìn)一步完善。

[關(guān)鍵詞]動(dòng)物模型；滾克；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；陽(yáng)證與陰證；壯醫(yī)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是臨床常見(jiàn)的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，主要的病理表現(xiàn)為滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成并造成軟骨和骨質(zhì)破壞。目前常用CIA模型來(lái)研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，但該模型的發(fā)生機(jī)制目前尚無(wú)定論，可以肯定：免疫系統(tǒng)對(duì)CⅡ的高度敏感性是該模型建立的主要原因，細(xì)胞和體液免疫均參與了病理過(guò)程。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在壯醫(yī)的病名為滾克，緣由風(fēng)、寒、濕、熱毒侵襲人體，阻滯三道兩路而致病，臨床辨證分為陽(yáng)證、陰證。本研究嘗試以CIA模型為基礎(chǔ)，附加模擬的風(fēng)、寒、濕、熱環(huán)境，建立符合壯醫(yī)病因理論的動(dòng)物模型，為后續(xù)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供參考。

1.材料和造模

1.1實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)雌性Wistar大鼠（生產(chǎn)許可證：SCXK2014-0002），體重（110±20）g，購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。牛Ⅱ型膠原蛋白（批號(hào)：150230）、弗氏不完全佐劑（批號(hào)：150207）、IL-1B（批號(hào)：1006-63）、TNF-a試劑盒（批號(hào)：1100-86）購(gòu)于北京博蕾德生物科技有限公司。

1.2造模箱制作 參考文獻(xiàn)自制造模箱，以自行改裝的空調(diào)系統(tǒng)控制箱內(nèi)溫度，以超聲霧化器霧化滅菌水控制箱內(nèi)濕度，以鼓風(fēng)機(jī)提供風(fēng)源。

1.3CIA大鼠造模方法 在無(wú)菌條件下，用0.1moL/L冰醋酸充分溶解牛II型膠原蛋白，制成濃度為4mg/L溶液，再按1：1體積與弗氏不完全佐劑混合、震蕩并充分乳化，制成CⅡ乳劑，保存于4℃冰箱備用。試驗(yàn)時(shí)每只大鼠CII乳劑0.25mL于頸、背、尾部分多點(diǎn)皮內(nèi)注射致炎（初次免疫），于7d后按上述方法再次免疫。

2.實(shí)驗(yàn)分組及方法

40只大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)選30只按上述方法造模，造模成功后再隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)證組、陰證組，每組10只；余下10只未造模大鼠為空白組。均于室溫（恒溫（20±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%）下正常喂養(yǎng)。陽(yáng)證組在首次接受膠原蛋白注射開(kāi)始同時(shí)每天給予風(fēng)、濕、熱刺激持續(xù)1h，條件控制：風(fēng)速5m/s，相對(duì)濕度90%，溫度（37±1）℃；陰證組在首次接受膠原蛋白注射開(kāi)始同時(shí)每天給予風(fēng)、寒、濕刺激持續(xù)1h，條件控制：風(fēng)速5m/s，相對(duì)濕度90%，溫度（8±1）℃。

3.觀察和指標(biāo)

3.1關(guān)節(jié)-體表溫度差值 各組大鼠以最腫脹關(guān)節(jié)體表溫度與腹部體表溫度差值進(jìn)行比較。體表溫度測(cè)量方法，于室溫下，相同時(shí)間點(diǎn)用非接觸式紅外測(cè)溫儀在相同的距離內(nèi)測(cè)量。

3.2關(guān)節(jié)炎癥積分 采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分法評(píng)定，評(píng)定依據(jù)為關(guān)節(jié)紅腫程度和范圍以及關(guān)節(jié)腫大和變形情況。0分：無(wú)關(guān)節(jié)炎；1分：有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹；2分：關(guān)節(jié)部位中度腫脹；3分：關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹；4分：關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹且不能負(fù)重。每個(gè)肢體最高積分為4分，每只鼠最高積分為16分。

3.3血清TNF-a、IL-1B含量 于第1次膠原蛋白注射后的第22天，水合氯醛麻醉各組大鼠，腹主動(dòng)脈采血，分離血清待測(cè)，未測(cè)的血清放入-4℃低溫冰箱保存。IL-1B、TNF-a均采用ELISA法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0軟件處理，計(jì)量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組問(wèn)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5.結(jié)果

5.1關(guān)節(jié)表面-體表溫差 關(guān)節(jié)表面-體表溫差（簡(jiǎn)稱差值）比較，空白組大鼠膝關(guān)節(jié)表面溫度均低于體表溫度，與模型組比較，差值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。陰證組差值小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明陰證組關(guān)節(jié)表面溫差低于模型組；陽(yáng)證組差值與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明陽(yáng)證組關(guān)節(jié)表面溫差與模型組相當(dāng)；陰證組差值與陽(yáng)證組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明陰證組關(guān)節(jié)表面溫差低于陽(yáng)證組。見(jiàn)表1。

5.2關(guān)節(jié)炎癥指數(shù) 空白組炎癥指數(shù)為0，與模型組比較，炎癥指數(shù)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)證組關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），陰證組關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)小于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明陰證組關(guān)節(jié)炎癥程度低于模型組。與陽(yáng)證組比較，陰證組關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)小于陽(yáng)證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明陰證組關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)小于陽(yáng)證組。見(jiàn)表1。

5.3炎癥因子 與空白組比較，模型組TNF-a、IL-1B值均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，陽(yáng)證組TNF-a、IL-1B統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），陰證組TNF-a、IL-1B值小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明陰證組TNF-a、IL-1B水平低于模型組。與陽(yáng)證組比較，陰證組TNF-a、IL-1B值小于陽(yáng)證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明陰證組TNF-a、IL-1B水平明顯低于陽(yáng)證組。見(jiàn)表2。

6.結(jié)論

本研究結(jié)果表明，陰證組關(guān)節(jié)一體表溫度差值、炎癥指數(shù)方面均低于陽(yáng)證組（P<0.05），陰證組大鼠血清TNF-a、IL-1B水平均低于陽(yáng)證組（P<0.05）。表明在比較成熟的CIA模型基礎(chǔ)上，附加風(fēng)、寒、濕、熱等外界刺激，會(huì)對(duì)模型大鼠產(chǎn)生影響：通過(guò)風(fēng)、寒、濕刺激的模型大鼠可做為陰證模型的參考；通過(guò)風(fēng)、濕、熱刺激的模型大鼠可做為陽(yáng)證模型的參考。同時(shí)，結(jié)果表明，陽(yáng)證組與模型組在表溫度差值、炎癥指數(shù)、血清TNF-0L和IL-1B水平方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可說(shuō)明CIA急性期多表現(xiàn)為陽(yáng)證。本研究探索在CIA模型基礎(chǔ)上建立壯醫(yī)滾克病因?qū)W說(shuō)中的陰、陽(yáng)兩證模型取得初步成效，同時(shí)也存在造模復(fù)雜化、大鼠死亡率增高的缺點(diǎn)，有待進(jìn)一步完善。