宋藝君+蘇健+郭濤+王昌利

[摘要] 目的 建立微波法產(chǎn)地加工延胡索飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 對(duì)微波法產(chǎn)地加工的延胡索飲片進(jìn)行性狀、薄層鑒別，并對(duì)灰分、水分、浸出物進(jìn)行測(cè)定，采用HPLC法對(duì)原阿片堿、延胡索乙素進(jìn)行含量測(cè)定，采用分光光度法對(duì)總生物堿進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果 經(jīng)微波加工的延胡索飲片水分<15%，灰分<4%，浸出物>13%，符合《中國(guó)藥典》要求。薄層斑點(diǎn)清晰，分離度較好。延胡索乙素、原阿片堿、總生物堿含測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。結(jié)論 所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可為微波法產(chǎn)地加工延胡索飲片提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 延胡索；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；延胡索乙素；原阿片堿；總生物堿

[中圖分類號(hào)] R000 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）03（b）-0029-04

Study on quality standard of origin processing Corydalis yanhusuo by microwave method

SONG Yijun1 SU Jian1 GUO Tao2 WANG Changli1

1.School of Pharmacy， Shaanxi University of Chinese medicine， Xianyang 712046， China； 2. 451st Hospital of PLA， Xi'an 710054， China

[Abstract] Objective To establish the quality standard for origin processing Corydalis yanhusuo by microwave method. Methods The traits， TLC identification carried out， ash， moisture， extract measured， tetrahydropalmatine， protopine and total alkaloidswere measured by HPLC and UV spectrophotometry method respectively. Results The moisture of Corydalis decoction by microwave method is less than 15%， the ash is less than 4%， the extract is more than 13%， meeting the requirements of pharmacopoeia. The TLC spots were clear， good resolution. The determination method is accurate， reproducible. Conclusion Quality standards established could provide the basis for origin processing of Corydalis yanhusuo by the microwave method.

[Key words] Corydalis yanhusuo； quality standard； tetrahydropalmatine； protopine； total alkaloids

延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）的干燥塊莖，屬于“浙八味”之一。具有活血止痛、利氣的功能，臨床上常用于胸脅、脘腹作痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，胸痹心痛，跌撲腫痛等癥[1]。延胡索含有的化學(xué)成分以生物堿為主，包括延胡索甲素、乙素、丙素（原阿片堿）[2-3]。由于延胡索藥材質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，采收后，直接晾曬導(dǎo)致干燥時(shí)間較長(zhǎng)，易霉變，因此藥材在采收后應(yīng)對(duì)加工方法進(jìn)行改進(jìn)，前期的研究比較了不同產(chǎn)地加工方法的差異，優(yōu)選出微波法產(chǎn)地加工。為了控制產(chǎn)地微波加工法的飲片質(zhì)量，本文進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，以此為微波法加工延胡索飲片的質(zhì)量控制提供借鑒。

1 儀器與試藥

U3000高效液相分析儀（賽默飛世爾科技公司）；UV-2550紫外可見分光光度儀（島津公司）；WFH-201B紫外投射反射儀（上海精科實(shí)業(yè)股份公司）；G80D23CSL-G1格蘭仕微波爐（佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司）

延胡索乙素對(duì)照品（批號(hào)：110726-201516）、原阿片堿對(duì)照品（批號(hào)：110853-201404）、延胡索對(duì)照藥材（批號(hào)：120928-201208）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；高效液相用甲醇、乙腈為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

延胡索鮮藥材采自陜西省城固縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授鑒定為罌粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）的新鮮塊莖，除去泥沙雜質(zhì)、須根，洗凈后攤開瀝干水分。

微波法產(chǎn)地加工延胡索飲片：取10批次大小分開的延胡索（直徑范圍1.0～1.2 cm）各 500 g，依次采用功率60%的火力微波加熱10 min，取出，放冷，切片，干燥至水分低于15%。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

呈不規(guī)則圓形厚片。外表皮黃色或黃褐色，有不規(guī)則細(xì)皺紋。切面黃色，角質(zhì)樣，具蠟樣光澤。氣微，味苦。

2.2 水分、灰分和浸出物

按照《中國(guó)藥典》2015年版四部水分測(cè)定法[4]（通則0832第二法）、灰分測(cè)定法（通則2302）、 水溶性浸出物、醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法（通則2201） 對(duì)10批次的延胡索飲片樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表1。

2.3 薄層鑒別

2.3.1 延胡索乙素 取延胡索粉末1 g，用50 mL甲醇溶解，超聲處理20 min，濾過，蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，調(diào)至堿性（濃氨試液），以10 mL乙醚萃取2次，萃取液合并，揮干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取對(duì)照藥材延胡索1 g，以相同的方法制成對(duì)照藥材溶液。取對(duì)照品延胡索乙素適量，加甲醇制成0.48 mg/mL的對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取上述三種溶液10 μL，依次點(diǎn)于同一個(gè)用氫氧化鈉溶液（1%）制備的硅膠G板上，以丙酮-甲苯（2∶9）為展開劑進(jìn)行展開，取出，晾干，于碘缸中顯色，在紫外光燈365 nm下檢視[1]139。供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖1（封四）。

2.3.2 原阿片堿 取本品粉末4 g，置磨口錐形瓶，加三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（5∶1∶0.8）混合溶液20 mL，超聲處理30 min，濾過，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取對(duì)照品原阿片堿適量，用三氯甲烷溶解，制成2 mg/mL的對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取上述兩種溶液10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二乙胺-乙酸乙酯（16∶1∶3）為展開劑，預(yù)飽和30 min后展開，取出，晾干后噴以稀碘化鉍鉀溶液[1]279。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)。見圖2。

2.4延胡索乙素含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Hypurity C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH值至6.0）（55∶45），流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL[1]140。色譜圖見圖3所示。

2.4.2對(duì)照品溶液制備 取經(jīng)105℃干燥至恒重的對(duì)照品延胡索乙素適量，以甲醇溶解，制成123.6 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4.3供試品溶液制備 取本品粉末0.5 g，精密稱定，加入濃氨試液-甲醇（1︰20）混合溶液50 mL，稱定，放置1 h后回流1 h，放冷，再稱定，對(duì)減失部分予以補(bǔ)足，搖勻，濾過。取續(xù)濾液25 mL，蒸干，加甲醇溶解定容至5 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4線性關(guān)系考察 取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣2、4、6、8、10、20 μL，以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X，μg）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=7.3352X+0.4544， r=0.9999（n=6），結(jié)果表明，延胡索乙素在進(jìn)樣量0.2472～2.4720 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5精密度試驗(yàn) 取同一個(gè)供試品溶液，連續(xù)6次進(jìn)樣，依法測(cè)定，結(jié)果延胡索乙素峰面積的RSD為1.86%，表明本方法精密度良好。

2.4.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.4.3”制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，計(jì)算延胡索乙素含量，結(jié)果平均含量為3.35 mg/g，RSD為2.05%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣一次，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，結(jié)果峰面積RSD為2.21%，表明12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.8加樣回收率試驗(yàn) 取6份3.35 mg/g的樣品，依次加入定量對(duì)照品延胡索乙素，制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.47%，RSD=2.03%，表明本方法回收率較好。見表2。

2.5原阿片堿含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Hypurity C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-三乙胺醋酸溶液（每1000 mL 水中加入冰醋酸 30 mL，三乙胺 8 mL）（18∶82），流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：289 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL[1]279-280。色譜圖見圖4所示。

2.5.2對(duì)照品溶液制備 取經(jīng)105℃干燥至恒重的對(duì)照品原阿片堿適量，以甲醇溶解，得到219.2 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.5.3供試品溶液制備 按照“2.4.3”項(xiàng)下方法制備。

2.5.4線性關(guān)系考察 取“2.5.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至10 mL，同法再稀釋10倍，得到對(duì)照品溶液濃度為2.19 μg/mL，分別進(jìn)樣10、20、30、40、50 μL，以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X，μg）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y =230.39X +0.0096， r=0.9994（n=5），結(jié)果表明，原阿片堿在進(jìn)樣量0.0219～0.1095 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5.5精密度試驗(yàn) 取濃度為219.2 μg/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)6次進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果峰面積的RSD為1.46%，表明本方法精密度良好。

2.5.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.5.3”制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，計(jì)算原阿片堿含量，結(jié)果平均含量為0.86 mg/g，RSD為2.10%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，2 h進(jìn)樣一次，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，結(jié)果峰面積RSD為2.01%，表明12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 取0.86 mg/g的樣品6份，依次加入適量原阿片堿對(duì)照品，制成供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為98.07%，RSD為2.25%，表明本方法回收率較好。見表3。

2.6 總生物堿含量測(cè)定[5]

2.6.1 供試品溶液制備 取0.5 g延胡索粉末，精密稱定，加水回流2次（100 mL，80 mL），每次30 min。過濾，合并濾液，離心，減壓濃縮至50 mL，加氨水調(diào)至pH10以上，移入分液漏斗，用氯仿萃取2次（50 mL，50 mL）合并萃取液，加蒸餾水洗滌，棄去水層，氯仿液合并，濃縮并定容至10 mL。

2.6.2 對(duì)照品溶液制備 取適量延胡索乙素對(duì)照品，用乙醇溶解定容于50 mL容量瓶，得到48 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.6.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取上述所得樣品1 mL于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，用乙醇溶解定容至10 mL。以乙醇作為空白溶液，分別把上述對(duì)照品溶液和樣品溶液在紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，對(duì)照品溶液在280 nm處有最大吸收，樣品溶液在273 nm處有最大吸收。最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm， 并在280 nm處測(cè)量樣品的吸光度。

2.6.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1.0、2.0、 3.0、4.0、5.0 mL，置于5 mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度，從而得到濃度為9.6、19.2、28.8、38.4、48.0 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，以乙醇作為空白對(duì)照，在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)（C），吸光度為縱坐標(biāo)（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A = 0.0199C+0.0393，r=0.9992， 表明對(duì)照品濃度在9.6～48.0 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.6.5 精密度試驗(yàn) 取濃度為48 μg/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)6次測(cè)定，結(jié)果總生物堿吸光度的RSD為1.85%。

2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)151102）樣品，按“2.6.1”制成供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算總生物堿含量，結(jié)果總生物堿的平均含量為5.49 mg/g，RSD為1.97%。

2.6.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣一次，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果吸光度RSD為2.07%，表明12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.8加樣回收率試驗(yàn) 取5.49 mg/g的樣品6份，依次加入適量對(duì)照品，制成供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為98.74%，RSD為2.64%，結(jié)果見表4所示。

2.7 樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)樣品0.5 g，精密稱定，分別按照“2.4.3”、“2.6.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，依法測(cè)定延胡索乙素、原阿片堿和總生物堿的含量，結(jié)果見表5。

3 討論

在總生物堿的含量測(cè)定預(yù)試過程中，先采用酸堿滴定法[6]，存在終點(diǎn)顏色變化不明顯的現(xiàn)象，無(wú)法正確判斷終點(diǎn)，最終選擇采用分光光度法[7]測(cè)定總生物堿含量。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]，延胡索主要成分為生物堿，包括水溶性和脂溶性，因而在微波產(chǎn)地加工的延胡索飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，進(jìn)行了水溶性和醇溶性浸出物的測(cè)定。在鑒別和含量測(cè)定中，2015年版《中國(guó)藥典》延胡索飲片只有單一薄層色譜定性及延胡索乙素定量，不能完全反映延胡索飲片的質(zhì)量和功效特點(diǎn)，因此，本試驗(yàn)增加了原阿片堿的定性和定量研究，且增加了總生物堿的含量測(cè)定，這對(duì)于延胡索飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)更為有效，可以作為內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)用于產(chǎn)地加工延胡索飲片的質(zhì)量控制，也為修訂和完善延胡索飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

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