鄧鳳君+肖凌+楊吟宇+文向華

[摘要] 目的 研究茶多酚（TP）對(duì)過氧化氫（H2O2）損傷大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)的影響。 方法 PC12細(xì)胞用TP及H2O2處理（TP終濃度5、10、20 μmol/L，H2O2終濃度500 μmol/L），以噻唑藍(lán)（MTT）法觀察細(xì)胞活力，試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的水平。 結(jié)果 500 μmol/L H2O2作用PC12細(xì)胞2 h，細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷，細(xì)胞活力下降（P < 0.01）；細(xì)胞破碎后上清液中SOD、GSH-Px的活性下降，MDA的水平增高（P < 0.01或P < 0.05）；5、10、20 μmol/L TP預(yù)處理可降低受損PC12細(xì)胞MDA的水平，增加SOD、GSH-Px的活性（P < 0.01）。 結(jié)論 TP能提高受損PC12細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)的作用。

[關(guān)鍵詞] 茶多酚；PC12細(xì)胞；過氧化氫；抗氧化酶系統(tǒng)

[中圖分類號(hào)] R421 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）03（a）-0020-04

Effects of tea polyphenols on antioxidant enzyme system in PC12 cells damaged by hydrogen peroxide

DENG Fengjun1 XIAO Ling1 YANG Yinyu1 WEN Xianghua2

1.Department of Pharmacy， Yiyang Medical College， Hu'nan Province， Yiyang 413000， China； 2.General Office， Stomatological Hospital Affiliated to Yiyang Medical College， Hu'nan Province， Yiyang 413000， China

[Abstract] Objective To explore the effects of tea polyphenols （TP） on antioxidase system in pheochromocytoma PC12 cells of rats damaged by hydrogen peroxide （H2O2）. Methods PC12 cells was treated with TP and H2O2 （the final concentration of TP was 5， 10， 20 μmol/L， the final concentration of H2O2 was 500 μmol/L）. The cell viability was detected by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay. The activity of antioxidase system superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA） and glutathion peroxidase （GSH-Px） in PC12 cells was measured by the kits. Results PC12 cells were treated with 500 μmol/L H2O2 for 2 h， which were damaged obviously and the celluar viability was decreased （P < 0.01）； besides， after disruption of cells， the activity of supernatant GSH-Px and SOD was reduced， and the MDA was increased （P < 0.01 or P < 0.05）； while 5， 10， 20 μmol/L of TP pretreatment could decrease the level of MDA and improve the activity of SOD and GSH-Px in the PC12 cells （P < 0.01）. Conclusion TP can enhance the activity of antioxidase system in induced-injury PC12 cells.

[Key words] Tea polyphenols； PC12 cells； H2O2； Antioxidase system

茶多酚（TP）為綠茶的主要活性成分，有顯著的抗氧化作用，作用于與自由基有關(guān)的酶，抑制氧化酶系，如抑制氧化酶黃嘌呤氧化酶系（XO）、細(xì)胞色素P2450環(huán)氧酶等，同時(shí)TP通過直接作用于自由基，再生或保護(hù)體內(nèi)高效抗氧化劑、絡(luò)合誘導(dǎo)氧化的過渡金屬離子，能高效清除自由基，產(chǎn)生顯著的抗氧化、抗炎等作用[1-3]。本研究用PC12細(xì)胞株作為體外實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)細(xì)胞，H2O2為誘導(dǎo)損傷劑，造成受損神經(jīng)細(xì)胞體外損傷模型，從TP對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的影響等方面研究了TP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞體外損傷模型的作用。通過本研究，希望為TP用于神經(jīng)組織損傷性疾病提供切實(shí)可信的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司，USA），噻唑藍(lán)（MTT，Sigma-Aldrich，USA），二甲基亞砜（DMSO，UNI-CHEM公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物公司）；TP（98%，江西綠康公司），過氧化氫（H2O2，汕頭光華化學(xué)廠），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成）。752型紫外分光光度計(jì)（上海第二分析儀器廠），酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-RAD，USA），超聲波清洗器（中國華南超聲波設(shè)備廠），離心機(jī)（TGL-16aR，上海安亭科學(xué)儀器廠），倒置相差顯微鏡（XDS-1B，Olympus，日本）。PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)溶液配制 TP：精確稱取適量，用無血清的DMEM溶解成一定濃度的母液，過濾除菌，用無血清的DMEM稀釋成終濃度為5、10、20 μmol/L的三種濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。H2O2：量取適量后過濾除菌，4℃避光貯存，用前用無血清的DMEM配置成所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 PC12細(xì)胞2×105/mL孵育在50 mL培養(yǎng)瓶中，DMEM高糖培養(yǎng)基（含100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、10%胎牛血清），置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育，每24小時(shí)換培養(yǎng)液1次，每48小時(shí)約80%滿瓶時(shí)傳代[4-6]。取對(duì)數(shù)生長期PC12細(xì)胞，以每孔2×105/mL分別接種在96孔板（MTT實(shí)驗(yàn)）或6孔板中（SOD、MDA、GSH-Px測定實(shí)驗(yàn)），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h內(nèi)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合后，用DMEM孵育細(xì)胞24 h（含體積分?jǐn)?shù)0.01% FBS），同步化細(xì)胞。TP（終濃度分別為5、10、20 μmol/L）預(yù)孵育細(xì)胞1 h，再加入H2O2（終濃度500 μmol/L）共同培養(yǎng)2 h。

1.2.2 建立損傷PC12細(xì)胞模型 用MTT實(shí)驗(yàn)確立PC12細(xì)胞損傷模型[7]。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種在96孔板（每孔2×105/mL），如上“1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理”所述接種孵育與同步化?？瞻讓?duì)照組加入等量的培養(yǎng)液使H2O2終濃度為0 μmol/L，其余各組分別加入H2O2（終濃度為100～600 μmol/L）孵育2 h，所有組別均設(shè)6個(gè)平行孔。棄培養(yǎng)液，加終濃度1 g/L MTT 液，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加DMSO 150 μL，平板震蕩儀輕微震蕩5 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度值。細(xì)胞存活率按公式計(jì)算：細(xì)胞存活率=A570 nm（處理組）/A570 nm（對(duì)照組）×100%。

1.2.3 測定受損PC12細(xì)胞SOD水平 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種在6孔板上（每孔2×105/mL），如上“1.2.1”所述接種孵育與同步化。分為5組，空白對(duì)照組（加等量的培養(yǎng)液）、H2O2組（即模型組，僅加終濃度500 μmol/L H2O2）以及3種不同濃度的TP組（加入TP使終濃度為5、10、20 μmol/L，預(yù)孵育1 h，再加終濃度500 μmol/L H2O2共同孵育2 h），5組各設(shè)3個(gè)平行孔。棄培養(yǎng)液，0.125%胰蛋白酶使細(xì)胞脫壁，每孔細(xì)胞數(shù)為（1～5）×106，1500 r/min（離心力151×g，離心半徑6 cm），離心5 min，收集細(xì)胞至0.5 mL裂解緩沖液（0.1 mol/L PBS中含0.5% Triton X-100，pH 7.0），用超聲粉碎儀破碎細(xì)胞，直到顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞已破碎，1200 r/min（離心力97×g，離心半徑6 cm）4℃離心20 min，取細(xì)胞破碎后上清，按照試劑盒說明進(jìn)行測試。

1.2.4 測定受損PC12細(xì)胞MDA水平 按照“1.2.3”法收集細(xì)胞破碎后的上清液，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行測試。

1.2.5 受損PC12細(xì)胞GSH-Px活性的測定 按照“1.2.3”法收集細(xì)胞破碎后的上清液，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行測試。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS 16.0軟件完成，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)分析采用One-way ANOVA分析，各組之間多重比較采用LSD或Dunnett多重比較法，采用LSD多重比較法分析SOD和MDA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Dunnett T3多重比較法分析GSH-Px實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響

空白對(duì)照組（即0 μmol/L組）細(xì)胞形態(tài)完整體積飽滿，而損傷組細(xì)胞間隙增大，體積明顯縮小，表面變光滑，突起消失，出現(xiàn)不同程度損傷，損傷程度以600 μmol/L最嚴(yán)重，見圖1。數(shù)據(jù)分析也顯示，PC12細(xì)胞被H2O2孵育2 h，細(xì)胞活力下降，與空白對(duì)照組比較，100～300 μmol/L劑量H2O2能降低細(xì)胞活力，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），400～600 μmol/L劑量H2O2能降低細(xì)胞活力，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），見表1。本研究采用了500 μmol/L劑量作為誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷劑量。

2.2 TP對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的影響

H2O2損傷PC12細(xì)胞后，顯著抑制了細(xì)胞的SOD、GSH-Px活性，升高了MDA水平，H2O2組與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。TP預(yù)孵育1 h，TP三個(gè)濃度組細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性上升，MDA水平下降，與H2O2組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），見表2。說明TP能顯著提高受損細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-Px水平，有效拮抗H2O2導(dǎo)致的受損細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)水平的降低。

3 討論

茶作為藥用已有千年歷史，其藥用價(jià)值已經(jīng)得到全世界廣泛認(rèn)同。目前已經(jīng)開發(fā)出了具有藥用價(jià)值的牙膏與洗發(fā)水等產(chǎn)品。茶中具有藥用價(jià)值的活性成分主要是TP。它是新型高效天然的抗氧化劑，能有效清除體內(nèi)自由基，具有護(hù)膚、護(hù)發(fā)、防癌、提高免疫力、抗衰老、降血脂等一系列優(yōu)異功能[8]。尤其因其具有顯著抗氧化作用，TP拮抗氧自由基介導(dǎo)的疾病是目前醫(yī)學(xué)研究的活躍領(lǐng)域，而且TP能透過血腦屏障，緩解脂質(zhì)過氧化狀態(tài)[9]，因此我們假定它也許是治療神經(jīng)細(xì)胞損傷的備選藥物。

本研究采用500 μmol/L H2O2作為外源性活性氧族（ROS）造成PC12細(xì)胞損傷，通過預(yù)孵TP，探索TP對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的影響。PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化的細(xì)胞株，普遍被用來研究多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病等[10-12]。H2O2能夠穿透并且損傷生物膜、線粒體，亦是最主要、最穩(wěn)定的ROS家族成員，因而H2O2常常作為毒性物質(zhì)來模擬氧化應(yīng)激體外模型[13-16]。因而，本研究通過PC12細(xì)胞被H2O2誘導(dǎo)損傷，造成神經(jīng)損傷體外模型，來評(píng)價(jià)TP對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)的影響。

正常組織在氧化代謝過程中會(huì)有少量的自由基產(chǎn)生，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)存在一系列有效的抗氧化防御系統(tǒng)，用以減少自由基在有氧代謝過程中對(duì)細(xì)胞的損害，維持氧自由基的代謝平衡，其中包括清除ROS的SOD、GSH-Px等[17-18]。機(jī)體清除氧自由基能力愈強(qiáng)，SOD與GSH-Px活性愈高，而MDA為自由基作用于膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，其水平反映了細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2孵育PC12細(xì)胞2 h，能降低細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性，升高M(jìn)DA水平。而給予TP處理后，受損細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性升高，MDA水平下降。此結(jié)果說明TP能提高受損PC12細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的作用。

綜上所述，通過對(duì)受損P12細(xì)胞氧化酶系統(tǒng)影響的實(shí)驗(yàn)，顯示TP能提高受損P12細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)活性，結(jié)合本課題的其他研究結(jié)果[20]，揭示TP對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，其可能的機(jī)制之一是TP能提高受損PC12細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)活性。但TP抑制H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的分子信號(hào)等機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

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