宮 勛

(中國石油吉林油田勘探設(shè)計(jì)院 吉林松原 138000)

原油降解菌JL21的篩選與降解性能分析

宮 勛

(中國石油吉林油田勘探設(shè)計(jì)院 吉林松原 138000)

菌株JL21與Gordonia amicalis（序列號：KM113029）菌親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)99%，與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果一致。因此，菌株JL21在分類學(xué)地位上初步確定為友善戈登氏菌Gordonia amicalis JL21。隨著2015年新環(huán)保法的公布，石油污染的有效處理已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的重中之重。微生物處理技術(shù)作為既經(jīng)濟(jì)高效又環(huán)保的方法，受到國內(nèi)外研究人員的青睞。本文著重探討了石油降解菌的篩選與降解性能的測定。

原油；降解菌；表面活性劑

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 采樣地點(diǎn)及原油來源

分離、篩選、降解實(shí)驗(yàn)所用的原油及土壤樣品均來自中國石油天然氣股份有限公司吉林油田分公司。

1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）：Na2HPO4·2H2O 8.5 g、KH2PO4 3.0 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2 14.7 mg、CuSO4 0.4 mg、KI 1.0 mg、MnSO4·H2O 4.0 mg、ZnSO4·7H2O 4.0 mg、H3BO3 5.0 mg、Na 2MoO4·2H2O 1.6 mg、FeCl3·6H2O 2.0 mg，蒸餾水1 L。pH7.0-7.2、121 ℃滅菌20 min。

原油降解培養(yǎng)基：在MSM培養(yǎng)基中添加0.5%的滅菌原油。

油平板：將原油溶于石油醚（原油終濃度為10%）中，濾紙剪成直徑85 mm，置90 mm培養(yǎng)皿中，加2 mL 10%原油溶液，待石油醚揮發(fā)后，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，取出烘干備用。無機(jī)鹽培養(yǎng)基滅菌后傾倒平板，將濾紙緊貼在MSM平板上后即成油平板。

富集培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g、牛肉膏 5 g、NaCl 5 g、蒸餾水 1 L，pH 7. 0.

血液瓊脂培養(yǎng)基：脫纖維綿羊血 50 ml、血液營養(yǎng)瓊脂45 g、去離子水 1L。

藍(lán)色凝膠培養(yǎng)基：十六烷基三甲基溴化銨 5 g、血液營養(yǎng)瓊脂 45 g、次甲基藍(lán) 0.02 g、去離子水 1L。

1.3 方法

1.3.1 原油降解菌的富集與分離

在含50 mL原油降解培養(yǎng)基的搖瓶中，加入5 mL土壤懸液，在30 ℃下，搖床發(fā)酵7 d，取5 mL富集液接到相同的富集培養(yǎng)基中，再發(fā)酵7 d，如此連續(xù)富集培養(yǎng)3次。

取發(fā)酵液梯度稀釋106，107，108倍，涂布油平板上，取生長良好的菌株，進(jìn)行純化培養(yǎng)后接入搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)驗(yàn)證。最后將純化后的原油降解菌接種于血液瓊脂固體培養(yǎng)基和藍(lán)色凝膠固體培養(yǎng)基表面，對原油降解菌產(chǎn)表面活性劑的性能進(jìn)行定性分析。

取產(chǎn)生物表面活性劑的高效原油降解菌進(jìn)行以下的試驗(yàn)。

1.3.2 原油降解菌降解性能的測定

將已分離純化的原油降解菌株接種于富集培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下以180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，待菌株進(jìn)入對數(shù)后進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。分別取2.5 mL（OD600=0.5）對數(shù)生長期菌液，加入到裝有50 mL含油無機(jī)鹽培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中（原油初始濃度為2000 mg·L-1），于30 ℃，180 r·min-1搖床中培養(yǎng)15 d，采用GC-FID氣相色譜法測定原油的殘余濃度，每組設(shè)置3個平行。

1.3.3原油降解菌產(chǎn)表面活性劑特性分析

將已分離純化的原油降解菌株，以劃線方法接種于血液瓊脂培養(yǎng)基和藍(lán)色凝膠培養(yǎng)基表面，定性篩選生物表面活性劑產(chǎn)生菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 原油降解菌的富集篩選和降解性能的測定

以原油為唯一碳源，經(jīng)過21 d的富集篩選，得到一株原油降解菌JL21。并在原油初始濃度為2.0 g·L-1、30 ℃和150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)15 d，采用GC-FID氣相色譜法測定原油的殘余濃度，該菌原油降解率達(dá)到50%以上，如圖1和圖2所示。

圖1 接種降解菌株JL21 15d后原油的狀態(tài)

圖2 接種降解菌株JL21 15d后原油的氣相色譜分析

2.2 原油降解菌產(chǎn)表面活性劑特性分析

將已分離純化的原油降解菌株JL21，以劃線方法接種于血液瓊脂培養(yǎng)基和藍(lán)色凝膠培養(yǎng)基表面，定性篩選生物表面活性劑產(chǎn)生菌。結(jié)果如圖3所示，原油降解菌在血液瓊脂培養(yǎng)基上能產(chǎn)生明顯的溶血圈，表明該菌具有產(chǎn)生生物表面活性劑的能力。

圖3 原油降解菌JL21在血平板中的培養(yǎng)狀態(tài)

原油降解菌株藍(lán)色凝膠平板生長特征表明該菌能產(chǎn)生陰離子生物表面活性劑，可以將培養(yǎng)基中加入的帶正電荷的次甲基藍(lán)吸附在細(xì)胞表面，因而菌落呈現(xiàn)藍(lán)色（如圖4所示），同時也表明該菌產(chǎn)生陰離子生物表面活性劑的特性，具體產(chǎn)生的陰離子生物表面活性劑的類型還有待于進(jìn)一步的分析。

圖4 原油降解菌JL21在藍(lán)色凝膠平板中的培養(yǎng)狀態(tài)

3 結(jié)論

以吉林油田原油為唯一碳源，經(jīng)過21d的富集篩選，得到一株原油降解菌JL21。并在原油初始濃度為2.0 g·L-1、30℃和150r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)15 d，采用GC-FID氣相色譜法測定原油的殘余濃度，該菌原油降解率達(dá)到50%以上。

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