張國(guó)順 黃曉陽(yáng) 李守民

外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD19+水平與喉癌患者預(yù)后的相關(guān)性

張國(guó)順 黃曉陽(yáng) 李守民

目的 探討喉癌患者免疫水平的變化與病情進(jìn)展的關(guān)系。方法 選取56例喉癌患者，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同分組的喉癌患者外周血淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的表達(dá)水平。結(jié)果 手術(shù)后患者CD19+顯著性下降(P<0.05)，而NK細(xì)胞顯著上升(P<0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者NK細(xì)胞上升，CD4+下降，二者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；病理分期中Ⅲ～Ⅳ期的患者比Ⅰ～Ⅱ期表現(xiàn)出CD19+顯著性下降(P<0.05)，CD4+則顯著上升(P<0.05)。在術(shù)后隨訪18個(gè)月中，有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者比無(wú)轉(zhuǎn)移且無(wú)復(fù)發(fā)患者CD4+下降，而NK細(xì)胞和CD19+上升，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 喉癌患者免疫狀態(tài)和病情之間有一定的聯(lián)系。

喉癌；細(xì)胞免疫；NK細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:735～737)

喉癌(laryngeal cancer)是耳鼻咽喉頭頸外科中常見的惡性腫瘤。近年來(lái)，在我國(guó)北方其新發(fā)病例數(shù)和死亡人數(shù)逐年增加，發(fā)病率和死亡率亦居高不下[1]。癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)和死亡的主要原因，同時(shí)也是影響喉癌患者預(yù)后的主要因素。研究顯示[2]，細(xì)胞免疫在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，它通過(guò)功能不同的T細(xì)胞亞群完成免疫調(diào)控。CD8+淋巴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)在抗腫瘤免疫中起主要作用。CD4+細(xì)胞在細(xì)胞免疫和體液免疫起協(xié)助作用，CD3+僅存在于T細(xì)胞表面，故用作外周血所有成熟的T淋巴細(xì)胞的標(biāo)記，CD19+則用作標(biāo)記B淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞(natural killer cell)亦在細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用。故本研究采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)56例喉癌患者術(shù)前和術(shù)后的外周淋巴細(xì)胞(CD8+、CD3+、CD4+、CD19+)以及自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，從而探討細(xì)胞免疫狀態(tài)與病情的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2012年6月至2014年6月在我院就診的喉癌患者共56例，其中男性47例，女性9例，年齡42～79歲，平均59.2歲；所有患者經(jīng)手術(shù)后病理切片證實(shí)均為鱗狀細(xì)胞癌，按國(guó)際喉鱗狀細(xì)胞癌TMN分期法可分為：Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期40例；根據(jù)術(shù)后病理是否有淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移分為有淋巴轉(zhuǎn)移47例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 COULTERRQ-PREP自動(dòng)溶血儀、EPICS XL/XL-MCL流式細(xì)胞儀，均為美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品。

1.2.2 試劑 鼠抗人單克隆抗體：CD8/CD45/CD4/CD3、CD45/CD19/CD(16±56)/CD45，肝素。所有試劑均為美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品。

1.3 方法

喉癌患者均于術(shù)前及術(shù)后清晨空腹時(shí)，用真空采血管抽取外周血2.0 ml，肝素抗凝。取100 μl抗凝全血后分別加入CD8/CD45/CD4/CD3、CD45/CD19/CD(16±56)/CD45熒光標(biāo)記的單克隆抗體2 μl，混勻。室溫暗處反應(yīng)30 min后加入細(xì)胞裂解液2.0 ml，待溶血后洗滌，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞，CD19+、CD8+、CD4+及CD3+，根據(jù)二維雙參數(shù)點(diǎn)圖，先設(shè)“門框”于CD45細(xì)胞，對(duì)熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分析，計(jì)算以下細(xì)胞表達(dá)百分比：CD8+、CD4+、CD3+、CD3+/CD16+CD15+、CD3+/CD19+以及CD4+/CD8+比值；術(shù)后隨訪18個(gè)月，觀察統(tǒng)計(jì)患者是否有轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，隨訪率為100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 喉癌患者手術(shù)前后淋巴細(xì)胞表達(dá)水平的比較

相比于手術(shù)前，手術(shù)后NK細(xì)胞表達(dá)水平升高，CD19+細(xì)胞表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而其它指標(biāo)相比于術(shù)前無(wú)明顯改變(P>0.05)，見表1。

表1 喉癌患者手術(shù)前后淋巴細(xì)胞表達(dá)水平的比較±s)

2.2 有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者淋巴細(xì)胞表達(dá)水平的比較

與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者CD4+細(xì)胞表達(dá)水平下降，其NK細(xì)胞表達(dá)水平明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而其它指標(biāo)無(wú)明顯差異，P>0.05，見表2。

表2 喉癌患者有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移淋巴細(xì)胞表達(dá)水平 的比較

2.3 不同病理分期喉癌患者淋巴細(xì)胞表達(dá)水平比較

根據(jù)流式細(xì)胞儀結(jié)果可知，Ⅰ～Ⅱ期患者相比于Ⅲ～Ⅳ期喉癌患者CD19+細(xì)胞水平明顯增高及CD4+細(xì)胞水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其它指標(biāo)二者相比無(wú)明顯差異，P>0.05，見表3。

表3 不同分期喉癌患者淋巴細(xì)胞表達(dá)水平 的比較

2.4 是否轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的喉癌患者淋巴細(xì)胞表達(dá)比較

術(shù)后隨訪18個(gè)月，56例患者中有15例出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)現(xiàn)象。相比無(wú)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者，有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者中的CD19+、NK細(xì)胞均明顯增高，其CD4+細(xì)胞表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);而其它指標(biāo)相比于無(wú)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者組無(wú)顯著差異，P>0.05，見表4。

表4 有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移與無(wú)轉(zhuǎn)移且無(wú)復(fù)發(fā)的喉癌患者淋巴細(xì)胞 表達(dá)水平的比較±s)

3 討論

流式細(xì)胞儀通過(guò)分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的側(cè)向角散射、前向角散射和及光信號(hào)等參數(shù)，從而檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群的改變而動(dòng)態(tài)評(píng)估機(jī)體免疫功能，從而反映腫瘤細(xì)胞的活性。對(duì)腫瘤患者進(jìn)行機(jī)體免疫狀態(tài)的檢測(cè)具有便捷、快速、敏感且準(zhǔn)確的特點(diǎn)，故其在評(píng)價(jià)療效及判斷預(yù)后中具有重要價(jià)值[3]。

從免疫學(xué)角度分析，機(jī)體具有自我免疫監(jiān)視的功能，故可以及時(shí)清除癌變細(xì)胞，但腫瘤患者機(jī)體的腫瘤免疫逃逸作用及患者免疫監(jiān)視系統(tǒng)的失調(diào)，而導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在機(jī)體抗腫瘤免疫作用中，主要以T細(xì)胞、NK細(xì)胞和MΦ細(xì)胞的細(xì)胞免疫發(fā)揮重要作用[4-5]。有研究表明[6]，在喉癌患者中其外周血 CD8+淋巴細(xì)胞表達(dá)率明顯高于常人，比較不同病理分級(jí)患者，CD8+細(xì)胞亦有顯著性差異。再者，患者CD4+/CD8+比值顯著性低于常人。故本研究通過(guò)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化以了解機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)，從而判斷患者細(xì)胞免疫與預(yù)后之間的關(guān)系。

本研究通過(guò)對(duì)喉癌患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者外周血CD4+細(xì)胞表達(dá)水平比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者下降(P<0.05)；在不同病理分期中同樣也觀察到，病理分期Ⅲ～Ⅳ期喉癌患者的CD4+水平低于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；此現(xiàn)象在術(shù)后18個(gè)月內(nèi)有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者也顯著低于無(wú)轉(zhuǎn)移且無(wú)復(fù)發(fā)患者(P<0.05)，且比較文獻(xiàn)，喉癌患者的CD8+細(xì)胞表達(dá)水平均高于健康常人，故可知，CD4+/CD8+比值高于健康常人。此外可觀察到Ⅲ～Ⅳ期CD19+顯著性低于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，故可推測(cè)，因癌癥的發(fā)生，患者的免疫功能抑制加重，細(xì)胞免疫受破壞同時(shí)體液免疫也呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)。細(xì)胞免疫受到抑制，隨之其對(duì)癌細(xì)胞的清除能力也隨之降低，從而也導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。

自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)又稱大顆粒淋巴細(xì)胞(large granular lymphocytes，LGL)，是參與機(jī)體天然免疫的主要細(xì)胞，具有抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)等功能[7]。NK細(xì)胞表面表達(dá)的抑制性殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(inhibitory killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)和活化性受體NKG2D是調(diào)節(jié)NK細(xì)胞殺傷活性的主要受體。NK細(xì)胞表面的活化性受體(KIR)與腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，從而激活NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用取決于這兩種受體識(shí)別相應(yīng)配體后的綜合作用結(jié)果[8]。NK 細(xì)胞不依賴抗體和補(bǔ)體，同時(shí)也不受主要組織相容復(fù)合物的限制，它通過(guò)分泌IL-2、GM-CSF、IFN-α和IFN-γ等細(xì)胞因子從而直接殺傷腫瘤細(xì)胞，成為腫瘤免疫的第一道防線。

本研究通過(guò)對(duì)喉癌患者自然殺傷細(xì)胞的檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)，相比于手術(shù)前，手術(shù)后喉癌患者的NK細(xì)胞顯著性增高(P<0.05)，同樣，對(duì)于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其NK細(xì)胞表達(dá)亦顯著性增高(P<0.05)，在術(shù)后隨訪18個(gè)月中，發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的喉癌患者的NK細(xì)胞表達(dá)也顯著性增高(P<0.05)，這些表明NK 細(xì)胞與腫瘤的進(jìn)展之間具有一定關(guān)系。

機(jī)體的免疫機(jī)制會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞做出應(yīng)對(duì)，同時(shí)腫瘤對(duì)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能產(chǎn)生影響，可知腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫功能的強(qiáng)弱間具有一定的內(nèi)在聯(lián)系。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)NK細(xì)胞，CD19+、CD8+、CD4+及CD3+監(jiān)測(cè)，可有效地觀察喉癌患者某一階段的免疫功能的變化，對(duì)于喉癌患者的治療和預(yù)后情況具有一定的臨床意義。

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(編輯：甘 艷)

Relationship between the Levels of Peripheral Blood CD3+,CD4+,CD8+,CD19+and Prognosis of Laryngeal Cancer

ZHANGGuoshun，HUANGXiaoyang，LIShoumin.

AnyangDistrictHospital,Anyang，455000

Objective To study the relationship between the changes of immunity lever and progression of disease in patients with laryngeal cancer.Methods The levels of peripheral blood lymphocytes and the level of natural killer cell(NK) in the 56 patients were determined by Flow cytometry.Results The level of CD19+decreased while the level of NK cell increased in 56 patients after surgery(P<0.05).Compared to the patients without lymph node metastasis,the patients with lymph node metastasis had a increase in the level of NK cell and a decrease in the level of CD4+.Compare to the patients with stageⅠ～Ⅱ,the patients with stage Ⅲ～Ⅳ had a increase in the level of CD4+and a decrease in the level of CD19+(P<0.05).After 18 months follow-up,the recurrent or metastatic patients had increases in the level of NK cell and the level of CD19+while had a decrese in CD4+,compared to the patients who didn’t have any recurrence or metastasis(P<0.05).Conclusion There is a certain relationship between the changes of immunity lever and progression of disease in patients with laryngeal cancer.

Laryngeal cancer;Cellular immunity;Natural killer cell;Flow cytometry

455000 河南省安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.012

R739.65

A

1001-5930(2017)05-0735-03

2016-11-09

2017-03-23)