劉寶軍 裴 斐 李繼華 吳艷麗 王 靜 崔永鵬

Snail、N-Cadherin、MMP-9在轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤中的表達(dá)及其相關(guān)性研究

劉寶軍 裴 斐 李繼華 吳艷麗 王 靜 崔永鵬

目的 研究Snail、N-Cadherin、MMP-9在轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤中的表達(dá)及其相關(guān)性。方法 選取轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤標(biāo)本70例為研究組，患者術(shù)前均未行放化療或生物治療。另選取70例正常組織(脊柱腫瘤病灶旁正常組織)標(biāo)本為正常組。采用S-P免疫組織化學(xué)染色方法，對(duì)標(biāo)本中Snail、N-Cadherin、MMP-9表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并分析其相關(guān)性。結(jié)果 Snail、N-Cadherin、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率研究組依次為75.71%、70.00%、90.00%。Snail表達(dá)與N-Cadherin及MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)；N-Cadherin表達(dá)與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論 Snail、N-Cadherin、MMP-9表達(dá)水平在轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤中均升高，呈正相關(guān)性，與轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤密切相關(guān)，可為臨床治療提供參考。

Snail；N-Cadherin；MMP-9；轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤；陽(yáng)性表達(dá)率

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:731～734)

脊柱腫瘤是指主要多發(fā)于脊柱骨骼部位，其附屬組織存在轉(zhuǎn)移性或原發(fā)性腫瘤及瘤樣病變，脊柱腫瘤發(fā)病率為全身骨腫瘤發(fā)病率的5%，轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤占全身骨轉(zhuǎn)移腫瘤比例50%左右[1]。因轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤臨床解剖位置相對(duì)較特殊，腫瘤的生長(zhǎng)具有侵襲性會(huì)對(duì)椎體、椎旁組織、附件等直接造成破壞，脊柱穩(wěn)定性喪失多累及神經(jīng)根、骨髓等主要結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致患者出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙、癱瘓甚至死亡，對(duì)患者生存質(zhì)量及生命安全造成威脅[2]。近年來(lái)臨床相關(guān)研究表示[3]，Snail、N-Cadherin、MMP-9可能與轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)聯(lián)，均可為臨床轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤防治提供新思路新方法。本研究主要對(duì)Snail、N-Cadherin及MMP-9的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)3者相關(guān)性進(jìn)行分析，旨在為臨床治療轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤提供有參考價(jià)值的分子生物學(xué)指標(biāo)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選取我院2010年9月至2015年6月轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤標(biāo)本70例為研究組，另選70例脊柱腫瘤病灶旁正常組織標(biāo)本為對(duì)照組，本研究所選轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤原發(fā)病均為胃癌，分別對(duì)患者臨床資料及病理分型分期、侵襲轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行分析。

1.2 主要試劑與儀器

本研究所用鼠抗人N-Cadherin單克隆抗體、兔抗人Snail單克隆抗體、兔抗人MMP-9單克隆抗體、DAB顯色劑及檸檬酸鹽緩沖粉劑，均選購(gòu)于北京中杉金橋生物科技有限公司。中性樹膠由北京中山生物科技有限公司提供。包埋模具及防脫玻片選自武漢博士德生物制品有限公司。脫色搖床TS-2000A由海門市其林貝爾儀器有限公司提供，OLYMPUS BX51正置熒光顯微鏡選購(gòu)于日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 HE染色 使用二甲苯常規(guī)脫蠟，切片借助梯度酒精清洗至水化；將切片采用蘇木精染色，浸泡時(shí)間為10～15 min，之后水洗；采用1%鹽酸酒精進(jìn)行分化，時(shí)間為2～5 s，水洗及飽和碳酸鋰藍(lán)化數(shù)秒，之后借助流水進(jìn)行沖洗，水洗時(shí)間控制在15～30 min；借助1%醇溶性伊紅浸染，時(shí)間5～15 s，后行常規(guī)脫水、透明并封片。

1.3.2 免疫組化方法 采用SP免疫組化染色方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：①切片置于60 ℃條件下2 h，借助二甲苯脫蠟并使用酒精梯度水化；②抗原修復(fù)；③切片上均滴一滴3%過(guò)氧化氫溶液，室內(nèi)孵育10 min，PBS沖洗，每次5 min，共3次；④切片滴加動(dòng)物血清(非免疫性)防治溫室進(jìn)行孵育，時(shí)間10 min，無(wú)需沖洗；⑤滴加一抗室溫孵育1 h，PBS沖洗同時(shí)；⑥滴加二抗室溫孵育10 min，PBS沖洗；⑦滴加鏈霉素-生物素-過(guò)氧化酶，室溫孵育10 min，PBS沖洗；⑧滴加DAB溶液顯色，控制顯色時(shí)間，借助顯微鏡隨時(shí)觀察；⑨水沖洗后實(shí)施復(fù)染并使用中性樹膠封固，借助顯微鏡觀察；⑩以PBS溶液為一抗進(jìn)行陰性對(duì)照，正常組組織為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果觀察及判定方法

每個(gè)切片均隨機(jī)選取高倍視野(400倍)5個(gè)，各視野分別觀察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其中陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)，即為待測(cè)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞平均表達(dá)率。

Snail陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核呈棕黃色；MMP-9以胞質(zhì)、胞膜呈棕黃色或黃色為陽(yáng)性表達(dá)；N-Cadherin表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)近細(xì)胞膜部位、細(xì)胞膜棕黃色判定為陽(yáng)性細(xì)胞；根據(jù)染色深淺計(jì)分，無(wú)染色為0分、弱染色為1分，強(qiáng)染色為2分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率進(jìn)行評(píng)估，1%～25%為陰性，26%～100%為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Snail、N-Cadherin、MMP-9在兩組所得數(shù)據(jù)等計(jì)數(shù)資料均用率(%)描述，采用χ2進(jìn)行檢驗(yàn)；借助Spear man分析組間相關(guān)性；組間兩兩進(jìn)行對(duì)比，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Snail、N-Cadherin、MMP-9在正常及轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤組織中的表達(dá)

細(xì)胞核或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為Snail免疫組化陽(yáng)性表達(dá)。Snail陽(yáng)性表達(dá)率，研究組高于正常組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組組織中Snail表達(dá)情況/例

細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)近細(xì)胞膜部位出現(xiàn)棕黃色為N-Cadherin免疫組化陽(yáng)性表達(dá)。研究組N-Cadherin表達(dá)率明顯高于正常組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組組織中N-Cadherin表達(dá)情況/例

以胞質(zhì)、胞膜呈黃色或棕黃色為MMP-9陽(yáng)性表達(dá)。兩組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率相比，研究組高于正常組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組組織中MMP-9表達(dá)情況/例

2.2 轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤中Snail、N-Cadherin、MMP-9表達(dá)相關(guān)性

70例轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤標(biāo)本中，N-Cadherin陽(yáng)性表達(dá)49例，其中43例與Snail共同表達(dá)為陽(yáng)性，比率為87.76%。Snail表達(dá)與N-Cadherin表達(dá)呈正相關(guān)，γ=0.732，見表4。

70例轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤標(biāo)本中，MMP-9陽(yáng)性表達(dá)共63例，其中49例與Snail共同表達(dá)為陽(yáng)性，比率為77.78%。Snail表達(dá)與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)，γ=0.674，見表5。

表4 轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤中Snail、N-Cadherin表達(dá)的關(guān)系/例

表5 轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤中Snail、MMP-9表達(dá)的關(guān)系/例

70例轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤標(biāo)本中，MMP-9陽(yáng)性表達(dá)共63例，其中46例與N-Cadherin共同表達(dá)為陽(yáng)性，比率為73.02%。N-Cadherin表達(dá)與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)，γ=0.657，見表6。

表6 轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤中N-Cadherin、MMP-9表達(dá)的關(guān)系/例

3 討論

轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤可直接對(duì)患者脊椎骨質(zhì)造成侵襲，破壞脊柱生物力學(xué)穩(wěn)定性，具有極大危害性，該病癥致殘率及致死率均較高[4]。相關(guān)研究表明[5]，胃癌引發(fā)轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤患者術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較高，會(huì)為患者造成極大痛苦，且二次手術(shù)治療難度大[6]。相關(guān)研究認(rèn)為[7]，對(duì)轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤患者Snail、N-Cadherin、MMP-9表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析，可為臨床疾病診療提供新的依據(jù)。

Snail蛋白是Snail家族中被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)蛋白，其抑制活性主要由氨基端區(qū)域結(jié)構(gòu)與指結(jié)構(gòu)決定，Snail蛋白表達(dá)升高會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲起進(jìn)一步促進(jìn)作用[8]。國(guó)外學(xué)者實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)[9]，Snail蛋白表達(dá)作用在淋巴結(jié)狀況及乳腺癌組織分級(jí)中關(guān)系密切。目前越老越多研究結(jié)果顯示[10]，Snail蛋白表達(dá)強(qiáng)度可展示出腫瘤侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，Snail免疫組化陽(yáng)性表達(dá)為胞漿、細(xì)胞核顯示棕黃色，研究組Snail陽(yáng)性表達(dá)高于正常組差異顯著。

N-Cadherin多見于神經(jīng)中、外胚層組織中[11]。相關(guān)前列腺癌、乳腺癌研究[12]認(rèn)為，N-Cadherin蛋白表達(dá)反常會(huì)加快腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，可使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為浸潤(rùn)性惡性表型，其作用較直接切明顯，提示N-Cadherin蛋白與腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲密切相關(guān)，會(huì)對(duì)腫瘤患者預(yù)后造成直接影響。本研究結(jié)果顯示，研究組N-Cadherin表達(dá)高于正常組，表明轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤中N-Cadherin陽(yáng)性表明較多。

MMP-9基因約長(zhǎng)4.5kb，位于人體染色體20q12.1-q13.1部位，在金屬蛋白酶家族中加重中所占分子最大，其作用底物較多包括：多類型膠原、纖維粘連蛋白、彈性蛋白等[13]。MMP-9蛋白主要因巨噬細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞及惡性腫瘤細(xì)胞酶原形式分泌產(chǎn)物，主要功能為破壞細(xì)胞基底膜穩(wěn)定；對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅳ、Ⅴ型膠原進(jìn)行降解；協(xié)助腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)；促進(jìn)形成新生血管及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞再生，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)起擴(kuò)展作用[14]。相關(guān)研究表明[15]，MMP-9蛋白表達(dá)與多類型癌癥侵襲、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。與本研究結(jié)果相似，研究組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)高于正常組，表明MMP-9表達(dá)與轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，70例轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤標(biāo)本中，Snail陽(yáng)性表達(dá)53例，N-Cadherin陽(yáng)性表達(dá)49例，MMP-9陽(yáng)性表達(dá)63例。研究組Snail、N-Cadherin、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)均高于正常組。表明，Snail、N-Cadherin、MMP-9表達(dá)與轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤進(jìn)展存在一定關(guān)聯(lián)。43例(87.76%)Snail與N-Cadherin共同表達(dá)為陽(yáng)性，兩者陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)聯(lián)。63例(77.78%)MMP-9與Snail共同表達(dá)為陽(yáng)性，呈正相關(guān)聯(lián)?？勺C實(shí)，Snail表達(dá)輕度可對(duì)腫瘤侵襲能力進(jìn)行判斷，其表達(dá)程度高低可作為臨床判斷轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)的標(biāo)志物，并提示轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤對(duì)N-Cadherin表達(dá)的敏感性相對(duì)較高。MMP-9與N-Cadherin共同表達(dá)為陽(yáng)性例數(shù)為46例(73.02%)，呈正相關(guān)聯(lián)?？杀砻鱉MP-9表達(dá)程度越高對(duì)腫瘤生長(zhǎng)促進(jìn)作用越大，Snail、N-Cadherin、MMP-9 3者間關(guān)系均呈正相關(guān)聯(lián)，存在互相推動(dòng)增強(qiáng)的作用，可作為臨床診療轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤的分子生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，Snail、N-Cadherin、MMP-9表達(dá)與轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤關(guān)系密切，可作為評(píng)價(jià)腫瘤情況的指標(biāo)，但本研究不排除因操作者主觀意識(shí)造成的陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)誤差，可能對(duì)研究結(jié)果造成影響。

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(編輯：吳小紅)

Research on Expressions and Correlations of Snail,N-Cadherin and MMP-9 in Metastatic Spinal Tumors

LIUBaojun,PEIFei,LIJihua,etal.

KailuanGeneralHospital,Tangshan,063000

Objective To study the expression and correlation of Snail,N-cadherin and MMP-9 in metastatic spinal tumors.Methods 70 cases of metastatic spondyloma were selected as the study group.No patients were treated with chemotherapy or biotherapy before operation.Another 70 cases of normal tissue (normal tumor tissue adjacent to the tumor) specimens were the normal group.The expression of Snail,N-cadherin and MMP-9 in the samples were detected by S-P immunohistochemical staining,and the correlation was analyzed.Results The positive expression rates of Snail,N-Cadherin and MMP-9 were 75.71%,70.00% and 90.00% respectively.Snail expression was positively correlated with N-cadherin and MMP-9 expression;N-cadherin expression was positively correlated with MMP-9 expression.Conclusion The expression of Snail,N-Cadherin and MMP-9 is up-regulated in metastatic spondyloma,which is closely related to metastatic spine tumor and can provide reference for clinical treatment.

Snail;N-Cadherin;MMP-9;Metastatic spinal tumors;Positive-expression rate

063000 開灤總醫(yī)院(劉寶軍，裴 斐，李繼華，王 靜，崔永鵬)；063000 河北省唐山市路北區(qū)疾控中心(吳艷麗)

吳艷麗

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.011

R738.1

A

1001-5930(2017)05-0731-04

2016-07-06

2017-03-28)