楊襄蓉 魏春山 劉 嬋 張曉輝 羅奇智

胃癌中l(wèi)ncRNA BC002811表達與微血管密度和淋巴結轉移的關系及其臨床意義

楊襄蓉 魏春山 劉 嬋 張曉輝 羅奇智

目的 探討lncRNA(long non-coding RNA，長鏈非編碼RNA)BC002811在胃癌中的表達與微血管密度和淋巴結轉移及胃癌發(fā)生發(fā)展及預后的關系。方法 納入行胃癌手術切除患者的病例樣本共計48例，對這48例胃癌樣本采用qPCR檢測lncRNA BC002811的相對表達量及檢測微血管密度(MVD)參數(shù)，并與淋巴結轉移等預后情況進行相關性分析。結果 lncRNA BC002811相對表達量與患者的一般資料如年齡、性別以及腫瘤的特征如大小、發(fā)病的部位、侵襲深度、分期及分化程度、是否遠處轉移等并不存在相關性(P>0.05)；而淋巴受累方面，淋巴受累組的lncRNA BC002811相對表達量明顯上調(P<0.05)，而無淋巴受累組的相對表達量與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。lncRNA BC002811表達水平與MVD差異表達具有相關性。結論 lncRNA BC002811相對表達量水平與胃癌的淋巴結轉移及預后有一定的相關性，但還需進一步系統(tǒng)研究。

胃癌；預后；lncRNA BC002811；微血管密度；淋巴結轉移；相關性

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:706～709)

胃癌(gastric cancer) 是1種發(fā)生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，好發(fā)于中、老年人，發(fā)病高峰年齡在50～80歲，并呈逐年年輕化趨勢。在世界范圍內，胃癌發(fā)病率在全部惡性腫瘤中居第4位，死亡率高居第2位，并且每年新發(fā)病例超過100萬[1]。我國屬胃癌的高發(fā)地區(qū)，且多數(shù)患者患病后初次就診已經(jīng)伴有廣泛的淋巴結轉移或者遠端的轉移，失去根治手術的機會，因此，尋找新的生物學靶標用于胃癌的癌變監(jiān)測和干預成為胃癌防治迫切需要解決的問題[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、肝癌、膽管癌、胃癌等多種腫瘤中l(wèi)ncRNA在調控腫瘤血管的生成中具有重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)1種新型的lncRNA BC002811在胃癌組織以及4種胃癌細胞中均呈明顯的表達上調，其作為促癌基因發(fā)揮腫瘤生長調控作用[4-5]。本研究收集胃癌患者lncRNA BC002811的表達情況、淋巴結轉移及MVD參數(shù)資料，通過分析lncRNA BC002811與微血管新生及模式的演變規(guī)律，進一步探討lncRNA BC002811相對表達量水平與胃癌發(fā)展與預后之間的關系。

1 材料與方法

1.1 病例的收集

納入我院普外科2012年1月至2015年1月行胃癌手術切除的48例患者病例樣本，通過病理診斷均確診為原發(fā)性胃癌，納入研究的所有患者均為初診的患者，且在術前未進行任何放療、化療及分子靶向治療等。48例中男性25例，女性23例，年齡43～76歲，平均年齡為(62.35±10.54)歲。在術中取材之后，腫瘤的位置以病理組織報告為標準，將樣本立即放置入液氮罐中保存，轉入-80 ℃冰箱長期保存，在實驗前取出，提取胃癌組織的RNA，同時進行病理學的監(jiān)測，對胃癌組織的病理學進行分型，腫瘤的浸潤程度按照國際抗癌聯(lián)盟標準分類[4]，淋巴分化以及轉移采用的國際WHO的診斷標準[5]進行分析判斷，對所有手術治療的患者從出院到死亡進行隨訪觀察，隨訪的時間以每月1次。同時納入健康人群23例作為對照組，所有受試者簽訂知情同意書。

1.2 實驗試劑和儀器

試劑：DEPC(美國Invitroge公司)，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(上海碧云天生物)，PCR試劑盒、TaqMan RNA試劑盒(美國Sigma)，TaqMix(東盛生物公司)，RNA提取試劑盒(美國Santa Cruz公司)，異丙醇、乙醇、氯仿(上海碩盟生物)。

儀器：紫外分光光度儀(德國BiofugeStratos)，-80 ℃～4 ℃冰箱(日本松下)，PCR儀(澳大利亞Rotor-gene)，高速冷凍離心機(Beckman Coulter 公司)。

1.3 RNA提取及qPCR檢測

對48例胃癌組織采用RNA提取試劑盒進行RNA提取，采用TaqMan RNA試劑盒檢測lncRNA BC002811的相對表達量。采用RNU6作為內參進行校正。對lncRNA BC002811的表達水平采用二步法進行檢測，第一步是通過莖環(huán)引物來合成互補DNA，再通過RNA的逆轉錄系統(tǒng)對10 ng RNA進行逆轉了反應體系進行反應，在PCR管加入10 μl的逆轉錄緩沖液，總的RNA濃度調整到2 ng/μl，最后加入5 μl的逆轉錄引物，在冰上混勻之后反應5 min，行梯度變形反應，反應條件為94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min，依次遞減；第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反應體系，該體體系具體形式：Taqman RNA的特異性引物與2×的 PCR Taqman Universal混合液相互混合之后通過逆轉錄PCR反應，再加入5 μl cDNA到RNA的去酶的水當中，將體積擴增至20 μl，通過循環(huán)反應94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min遞減的擴張40個循環(huán)之后，對實驗結果進行分析，采用熒光實時定量反應，按照PCR操作說明，Ct的檢測值應當在20～32之外的需要進行第2次檢測。應用△Ct=CtlncRNA BC002811-CtRNU6的計算公式計算lncRNA BC002811的相對表達量。

1.4 MVD的檢測

資深病理專家對病理切片復核確認，利用相應的存檔組織蠟塊進行血管染色，標記微血管密度，記錄觀察微血管的生長模式。

1.5 統(tǒng)計學檢測

所有納入分析研究的數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0的統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫，將lncRNA BC002811表達水平分為2組，小于平均值為低表達組，大于平均值作為高表達組。lncRNA BC002811的表達水平高低與發(fā)病相關因素分析以逐步回歸法篩選有統(tǒng)計學意義的變量，對臨床病理因素之間的風險情況采用logistic回歸分析，組間比較用方差分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗，組間率的比較用卡方檢驗，兩兩比較采用LSD檢驗。應用Kruskal-wallis H檢驗進行多組間數(shù)據(jù)的比較。

2 結果

2.1 lncRNA BC002811的相對表達量與臨床病理特征之間的相關性

48例胃癌組織的lncRNA BC002811的相對表達量為1.462，95%CI為0.363～0.595。表達量低于平均值的有21例，高于平均值的有27例，lncRNA BC002811相對表達量與患者的一般資料如年齡、性別以及腫瘤的特征如大小、發(fā)病的部位、侵襲深度，分期及分化程度、是否遠處轉移等并不存在相關性(P>0.05)；而淋巴受累方面，淋巴受累組的lncRNA BC002811相對表達量明顯上調(P<0.05)，而無淋巴受累組的相對表達量與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，lncRNA BC002811相對表達量明顯上調與淋巴結受累轉移的風險有關，見表1。

2.2 lncRNA BC002811相對表達量的高低與淋巴結轉移風險之間的關系

采用logistic回歸分析lncRNA BC002811相對表達量的高低與淋巴結轉移風險之間的相關性，lncRNA BC002811相對表達量的上升會增加胃癌淋巴結轉移的風險性，通過調整風險其OR=5.21，95%CI為1.26～16.54，P=0.02，見表2。

表1 lncRNA BC002811的相對表達量與臨床病理特征之間的相關性±s)

表2 lncRNA BC002811相對表達量的高低與淋巴結轉移風險之間的關系

2.3 胃癌組織中l(wèi)ncRNA BC002811的mRNA表達水平與MVD的相關性

lncRNA BC002811 mRNA表達水平與MVD差異表達具有相關性(γs=4.86，P=0.01)，見表3。

表3 胃癌組織中l(wèi)ncRNA BC002811 mRNA的表達與MVD的關系

3 討論

近年來，盡管不斷有與胃癌相關的癌基因、抑癌基因以及相關腫瘤信號通路等被發(fā)現(xiàn)和證實，但其發(fā)病機制尚未完全清楚。目前，對胃癌相關分子及其調控、干預機制的研究是胃癌研究的熱點。胃癌早期癥狀多缺乏特異性，早期病例僅占胃癌手術病例的10%～20%，大約2/3的患者在確診時已經(jīng)處于中晚期或已出現(xiàn)淋巴結、血行轉移，其5年生存率僅為20%～30%[6-8]。胃鏡檢查是診斷胃癌的“金標準”，但胃鏡檢查過程中患者不適反應多，依從性差，限制了其作為胃癌篩查的應用。上消化道鋇餐透視、CT和磁共振等影像學檢查已廣泛應用于胃癌診斷，但早期胃癌和癌前病變的影像學表現(xiàn)常缺乏特異性，故影像學檢查在發(fā)現(xiàn)早期胃癌及微小病灶方面有一定的局限性[9]。而CEA、CA72-4和CA19-9等傳統(tǒng)的腫瘤標志物多在胃癌晚期才明顯升高，其診斷胃癌的陽性率較低，多在40%以下[10-11]。因此，尋找新的生物學靶標用于胃癌的癌變監(jiān)測和干預成為胃癌防治迫切需要解決的問題。

腫瘤微血管新生是其浸潤和遠處轉移的前提條件[12]，目前評價腫瘤血管生成的標準是測定腫瘤微血管密度(MVD)。而腫瘤微血管存在多種不同的模式，勢必對腫瘤的進展及預后產生影響，但是有關微血管模式與腫瘤進展以及脈管內癌栓、局部腫瘤浸潤等高危因素以及預后的關系鮮見報道[13]。人類基因組轉錄大量的RNA分子，除了經(jīng)典的蛋白編碼基因的mRNA外，人們發(fā)現(xiàn)了很多短鏈非編碼RNA(microRNA和smallRNA，長度<200 bp)和長鏈非編碼 RNA(lncRNA，長度>200 bp)分子[14]。lncRNA是哺乳動物轉錄組的重要成分，但是其功能目前并不十分清楚[15]。最近研究發(fā)現(xiàn) lncRNA在細胞發(fā)育過程中起重要作用，其調節(jié)異常與人類疾病密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺特異性的lncRNA PCA3 可作為一種前列腺癌的早期診斷標志物，其比目前臨床上已廣泛使用的前列腺特異性抗原PSA具有更高的靈敏度和特異性[16]。因此，我們以通過lncRNA芯片篩選得到的具有潛在致癌活性的lncRNA BC002811作為切入點，研究其功能和調控機制，為胃癌的診斷和治療提供新的標志物和靶標，具有非常重要的理論和現(xiàn)實意義，同時也將為該病的診斷和治療帶來顯著的社會效益。

研究表明腫瘤細胞中l(wèi)ncRNA BC002811的水平上調，具有促進腫瘤生長的作用[17]。本研究通過分析lncRNA BC002811在胃癌中的表達與微血管密度和淋巴結轉移及胃癌發(fā)生發(fā)展及預后的關系，為胃癌的抗血管生成治療研究提供理論依據(jù)。結果顯示，lncRNA BC002811相對表達量與患者的一般資料如年齡、性別、以及腫瘤的特征如大小、發(fā)病的部位、侵襲深度，腫瘤的分期及分化程度、是否遠處轉移等并不存在相關性；而淋巴受累方面，淋巴受累組的lncRNA BC002811相對表達量明顯上調，lncRNA BC002811相對表達量明顯上調與淋巴結受累轉移的風險有關，同時發(fā)現(xiàn)lncRNA BC002811表達水平與MVD差異表達具有相關性，對早期胃癌的診斷具有一定的作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA BC002811在胃癌中表達上調與淋巴結轉移有著密切的相關性，提示lncRNA BC002811可能與胃癌的轉移侵襲等影響預后的因素有關，該分子差異性表達推測可能是胃癌早期的潛在靶點，但是本研究不足的是病例數(shù)還相對較少，lncRNA BC002811在胃癌中的作用機制和靶基因生物學預測和闡明有待于進一步研究。

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(編輯：甘 艷)

Relationship between Expression of lncRNA BC002811 and Microvessel Density and Lymph Node Metastasis in Gastric Cancer and Its Clinical Significance

YANGXiangrong,WEIChunshan,LIUChan,etal.

LonggangDistrictSecondPeople'sHospital,Shenzhen,518112

Objective To investigate the relationship between expression of lncRNA BC002811 and microvessel density,lymph node metastasis,development and prognosis in gastric cancer.Methods 48 cases of gastric cancer treated with surgical resection was selected,and qPCR was used to detect relative expression of lncRNA BC002811 (MVD)and microvessel density,and correlation analysis of lymph node metastasis and prognosis were conducted.Results lncRNA BC002811 relative expression amount and general information of patients such as age,gender,and tumor characteristics such as size,site of disease,depth of invasion,stage and tumor differentiation,metastasis had no correlation (P>0.05);and lymphatic involvement group lncRNA BC002811 relative expression levels significantly increased (P<0.05),relative expression of non lymph node involvement group and the normal group had no significant difference (P>0.05),lncRNA BC002811 expression and MVD differential expression were correlated.Conclusion lncRNA BC002811 relative expression levels and the amount of lymph node metastasis and prognosis of gastric cancer have a certain relevance,but need to be further studied.

Gastric cancer;Prognosis;lncRNA BC002811;Microvessel density;Lymph node metastasis;Correlation

深圳市科技研發(fā)資金(編號：JCYJ20150402092653980)

518112 深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院(楊襄蓉，劉 嬋，羅奇智)；518034 深圳市中醫(yī)院(魏春山)；518034 深圳市中醫(yī)院中醫(yī)藥研究所細胞分子學實驗室(張曉輝)

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.003

R735.2

A

1001-5930(2017)05-0706-04

2016-10-09

2017-03-27)