安改麗 李 旭 馮 璐 黃尚科 白 俊 趙新漢

Apatinib聯(lián)合5-Fu協(xié)同抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的體外研究

安改麗 李 旭 馮 璐 黃尚科 白 俊 趙新漢

目的 探討阿帕替尼(Apatinib)聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-Fu)對(duì)乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞的抑制作用。方法 采用人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，首先采用MTT法及應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度apatinib作用后對(duì)其細(xì)胞增殖和周期的影響，其次將MCF-7細(xì)胞分為4組，即對(duì)照組、Apatinib單藥組、5-Fu單藥組、Apanitib+5-Fu聯(lián)合組。對(duì)各組細(xì)胞給予相應(yīng)藥物處理，48 h后分別應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組藥物對(duì) MCF-7 細(xì)胞株凋亡的作用。結(jié)果 Apatinib單藥對(duì)MCF-7細(xì)胞有增殖抑制作用，且存在時(shí)間劑量依賴關(guān)系，而對(duì)其細(xì)胞周期影響不大。與對(duì)照組相比，Apatinib聯(lián)合5-Fu作用后有協(xié)同誘導(dǎo)凋亡作用，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Apatinib組誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率為12.05%，5-Fu組為25.76%。與單藥組比，Apatinib+5-Fu聯(lián)合組凋亡率升高更為明顯，達(dá)34.90%(P< 0.05)。結(jié)論 Apatinib和5-Fu的聯(lián)合應(yīng)用在體外協(xié)同抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞并誘導(dǎo)凋亡，使抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)。

阿帕替尼;；5-氟尿嘧啶；MCF-7；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:702～705)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的生活質(zhì)量和身心健康。在我國(guó)，乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，尤其是在農(nóng)村地區(qū)，乳腺癌的致死率極高[1]。乳腺癌分子靶向治療是指針對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的癌基因表達(dá)產(chǎn)物和信號(hào)通路進(jìn)行治療。腫瘤新生血管生成在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用，因此抗腫瘤血管生成已成為腫瘤治療的1個(gè)重要的靶點(diǎn)，也是近年來(lái)抗腫瘤治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。甲磺酸阿帕替尼片是口服小分子酪氨酸激酶抑制劑，靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)，發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用。臨床前研究及臨床試驗(yàn)均證實(shí)其對(duì)多種小鼠腫瘤模型的腫瘤生長(zhǎng)以及對(duì)多種實(shí)體瘤均有抑制作用[2]。從腫瘤的發(fā)生、血管新生等多方面入手來(lái)抑制腫瘤，可以提高抗腫瘤效果。靶向治療與化療聯(lián)合的生物化療模式成為乳腺癌治療的新焦點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)旨在研究新型抗腫瘤血管生成藥物apatinib與經(jīng)典化療藥物5-Fu聯(lián)合對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響，為其臨床聯(lián)合用藥提供體外實(shí)驗(yàn)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))；阿帕替尼(Apatinib)(江蘇恒瑞公司)；5-Fu(江蘇倍達(dá)醫(yī)藥科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；噻唑蘭(MTT)(美國(guó)sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)sigma公司)；Annexin V-APC/7-AAD雙染凋亡試劑盒(深圳晶美生物公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；Genios 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)TECAN公司)；FACScan 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；電泳和轉(zhuǎn)膜裝置(美國(guó)BIO-RAD 公司)；Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描儀(美國(guó)LI-COR公司產(chǎn)品)；倒置顯微鏡(DXM1200)(日本Nikon 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其貼壁生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物稀釋方法 將Apatinib藥物用100 % DMSO溶解配置成母液，保存于-20 ℃條件下。實(shí)驗(yàn)用時(shí)稀釋，使DMSO溶液終濃度<0.5%，不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

1.2.3 藥物干預(yù)分組 共分為4組，根據(jù)文獻(xiàn)資料回顧及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別設(shè)：空白對(duì)照組、apatinib單藥組、5-FU單藥組、apatinib+5-FU聯(lián)合組4組。檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率時(shí)apatinib濃度為：2.5、5、10、20、40 μmol/L，檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)apatinib濃度為：0、2、4、8 μmol/L，檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)apatinib單藥組濃度為5 μmol/L，5-FU單藥組濃度為2 μg/mL，聯(lián)合組中藥物所加的濃度與單藥組相同，對(duì)照組不加任何藥物做參考。

1.2.4 檢測(cè)項(xiàng)目及方法 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，計(jì)算細(xì)胞抑制率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞MCF-7(5 000個(gè)細(xì)胞/孔)接種于96孔板上，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，傾去培養(yǎng)基，將經(jīng)處理的不同濃度(2.5、5、10、20、40 μmol/L)的阿帕替尼分別加入孔內(nèi)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加100 μl。以與實(shí)驗(yàn)組中含有最大濃度DMSO的培養(yǎng)液為空白對(duì)照組，不含細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基為調(diào)零孔，分別于培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心吸去藥液及培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定OD值。細(xì)胞抑制率(%)=(1-試驗(yàn)孔平均OD值/對(duì)照孔平均OD值)×100%，根據(jù)上述結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，以2 mL/孔接種至6孔板內(nèi)，使細(xì)胞終濃度為2×105/ml，DMEM培養(yǎng)基孵育24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的apatinib(0,2,4,8 μmol/L)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，然后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后,收集各處理組細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，棄去上清，用預(yù)冷的70%乙醇固定，4 ℃保存，檢測(cè)前去除固定液，加入RNA酶工作液及碘化丙啶，4 ℃避光染色30 min，過(guò)300目濾網(wǎng)后上流式細(xì)胞儀，數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，分析得出細(xì)胞周期各時(shí)相比例，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，以2 mL/孔接種至6孔板內(nèi)，使細(xì)胞終濃度為2×105/ml，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基孵育24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入apatinib、5-FU單藥及兩藥聯(lián)合，對(duì)照組不加任何藥物作為參考，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，然后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后,以不含EDTA的胰酶消化各處理組細(xì)胞并收集，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，離心后棄去上清，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin V-APC和5 μl的7-AAD染液，混勻室溫避光放置15 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 apatinib對(duì)MCF-7細(xì)胞毒作用

MTT法檢測(cè)apatinib對(duì)MCF-7細(xì)胞毒作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的apatinib作用于MCF-7乳腺癌細(xì)胞24～72 h后，其生長(zhǎng)抑制率見(jiàn)表1，繪制生長(zhǎng)抑制曲線如圖1，提示阿帕替尼在體外對(duì)MCF-7細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，其抑制率隨濃度增加而升高，呈明顯的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。

2.2 apatinib不影響MCF-7的細(xì)胞周期分布

經(jīng)終濃度為0、2、4、8umol/L的apatinib處理的MCF-7細(xì)胞，其G0/G1期細(xì)胞比例分別為48.53%、46.35%、48.21%、49.33%，S期細(xì)胞比例分別為49.12%、52.57%、50.43%和50.45%，G2期細(xì)胞比例分別是2.35%、1.08%、1.36%、1.23%，可見(jiàn)，隨著apatinib濃度的增加，MCF-7細(xì)胞周期的分布并沒(méi)有受到影響，apatinib并不是細(xì)胞周期特異性藥物。

表1 apatinib對(duì)MCF-7的細(xì)胞毒作用

圖1 不同濃度apatinib對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果

MCF-7細(xì)胞分別經(jīng)處理48 h后，采用Annexin V-APC/7-AAD法經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組、apatinib單藥組、5-Fu單藥組，apatinib+5-Fu聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率分別為：7.73%、12.05%、25.76%、34.90%(圖2)；單藥處理組及聯(lián)合處理組與對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，細(xì)胞凋亡率均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 apatinib、5-Fu單藥及聯(lián)合對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響

3 討論

乳腺癌的靶向治療是指針對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展調(diào)控分子通路的靶點(diǎn)在細(xì)胞分子水平上設(shè)計(jì)的相應(yīng)藥

物，通過(guò)與調(diào)節(jié)分子或受體結(jié)合，抑制這些下游基因的活化或受體的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或凋亡。細(xì)胞凋亡失控是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的1個(gè)重要環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡是腫瘤細(xì)胞耐受各種抗腫瘤治療如放療、化療并影響預(yù)后的重要原因[3]。Apatinib是1種新型的小分子酪氨酸酶抑制劑，在小鼠腫瘤模型顯示了抗腫瘤活性，選擇性抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)磷酸化及抗血管新生[4]。在臨床前研究中，apatinib在胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肉瘤及非小細(xì)胞肺癌等多種移植瘤小鼠模型中均有明顯的抑瘤作用，且與奧沙利鉑、氟尿嘧啶、阿霉素及多西他賽聯(lián)合應(yīng)用在上述移植瘤鼠模型上有協(xié)同作用[5-6]。最近有文獻(xiàn)報(bào)道在實(shí)體瘤的體外研究中發(fā)現(xiàn)apatinib可以逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥，apatinib可以增加ABCB1底物長(zhǎng)春新堿、紫杉醇和阿霉素對(duì)ABCB1/P-gp高表達(dá)人乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/Adr的細(xì)胞毒性[7-8]。已經(jīng)完成及正在進(jìn)展的多項(xiàng)3期臨床試驗(yàn)中，apatinib治療晚期胃癌、非小細(xì)胞肺癌及肝癌均顯示有較好的疾病控制率及可耐受的不良反應(yīng)[9-10]。

近年的研究認(rèn)為由于細(xì)胞周期紊亂、周期失控引起細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，化療藥物可通過(guò)將腫瘤細(xì)胞停滯于G0/G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞分裂，發(fā)揮抗腫瘤活性，本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理后MCF-7細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度apatinib處理的各組細(xì)胞，其細(xì)胞周期各期比例并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此我們認(rèn)為apatinib對(duì)MCF-7細(xì)胞發(fā)揮抑制作用并不影響其細(xì)胞周期。

氟尿嘧啶類化療藥物在早期乳腺癌術(shù)后輔助治療、乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后姑息治療中占有重要地位。該藥是細(xì)胞周期特異性藥物，其主要作用是在體內(nèi)經(jīng)酶轉(zhuǎn)化為5-氟脫氧尿嘧啶核苷酸而具有抗腫瘤活性，5-FU通過(guò)抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成。本研究將apatinib與5-Fu聯(lián)合起來(lái)，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組細(xì)胞凋亡比例明顯高于apatinib單藥組及5-Fu單藥組，且3組用藥組與對(duì)照組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們的研究結(jié)果提示，apatinib和5-Fu聯(lián)合應(yīng)用在一定程度上使抗腫瘤活性增強(qiáng)，這為臨床上治療乳腺癌采用生物化學(xué)治療模式提供了一定的參考，后續(xù)我們將對(duì)其可能的抗腫瘤機(jī)制做進(jìn)一步的研究，為該方案的臨床應(yīng)用提供更加充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

A為對(duì)照組，B為apatinib組，C為5-Fu組，D為apatinib+5-Fu組

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(編輯：吳小紅)

Inhibitive Effects of Apatinib and 5-Fu on Breast Cancer Cell Line ECA109 in Vitro

ANGaili,LIXu，F(xiàn)ENGLu，etal.

ShaanxiProvincialPeople'sHospital,Xi'an,710068

Objective To investigate the inhibitive effects of Apatinib and 5-Fu on breast cancer cell line MCF-7 cells.Methods MCF-7 cells were treated with Apatinib at different concentrations and different times,cell growth inhibition was assessed by MTT,the cell cycle changes of the cells in response to apatinib treatment were observed by flow cytometry.MCF-7 cells were divided into 4 different groups:the control group,Apatinib group,5-Fu group and Apatinib + 5-Fu group.The cell apoptosis was detected by flow cytometry via Annexin V-APC/7-AAD double staining after 48 hours.Results Apatinib significantly inhibited the proliferation of MCF-7 cells in vitro,and the inhibition effects presented with time-and dose-dependent response,but produced no significant effect on the cell cycle.Apatinib+5-Fu treatment obviously increased the apoptotic rate of the MCF-7 cells,the difference has statistical significance compared with the control group(P<0.05).Conclusion Apatinib and 5-Fu can enhance the anti-tumor activity through inducing cell apoptosis.

Apatinib;5-Fluorouracil;MCF-7;Cell proliferation;Cell apoptosis

710068 陜西省人民醫(yī)院(安改麗，白 俊)；710061 陜西省腫瘤醫(yī)院(李 旭)；710061 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(安改麗，馮 璐，黃尚科，趙新漢)

趙新漢

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.002

R737.9

A

1001-5930(2017)05-0702-04

2016-05-24

2017-03-08)