陳 翔，周開緒，楊興友，向 杰，何正川，劉 麗，張艷敏，程新勝*

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不同栽培措施對白肋煙TSNAs及其前體物的影響

陳 翔1,2，周開緒3，楊興友3，向 杰3，何正川4，劉 麗1，張艷敏1，程新勝1*

（1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，合肥 230052；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，合肥 230036；3.四川省煙草公司達州分公司，四川達州 635000；4.四川省宣漢縣煙草公司，四川宣漢 636150）

為揭示不同栽培措施對白肋煙煙草特有亞硝胺（TSNAs）及其前體物的影響，采用正交試驗研究了施氮量（210、255和300 kg/hm2）、打頂時間（扣心打頂、現(xiàn)蕾打頂和初花打頂）和BSM劑量（0.1、0.3 μmol/L和清水涂抹）3因素組合對上部煙葉TSNAs、生物堿和硝酸鹽含量的影響。結(jié)果表明，施氮量是影響TSNAs及其前體物生物堿、硝酸鹽含量的主要因素，施氮量210 kg/hm2的上部煙葉中TSNAs及其前體物含量均較低。打頂時間對上部葉TSNAs含量影響差異極顯著，現(xiàn)蕾打頂TSNAs含量極顯著低于扣心和初花打頂。打頂后涂抹BSM，煙葉中生物堿、硝酸鹽和TSNAs的含量均較低。綜合認為，在本試驗條件下，施氮量210 kg/hm2+現(xiàn)蕾打頂+0.3 μmol/L BSM制劑的組合可有效降低上部煙葉TSNAs含量。

白肋煙；施氮量；打頂時間；BSM；TSNAs

白肋煙（Burley tobacco）屬淺色晾煙，因其獨特的煙葉結(jié)構(gòu)、物理性能和特殊的香味，被廣泛用于混合型卷煙生產(chǎn)中[1]。煙草特有亞硝胺（tobacco-specific N-nitrosamines, TSNAs）是煙草生物堿與亞硝基反應(yīng)生成的存在于煙葉及煙氣中的亞硝胺類化合物[2]，其中N-亞硝基降煙堿（NNN）與4-（N-甲基亞硝基胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）被國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）認定為I類致癌物[3]。近年來，研究人員為尋求有效降低TSNAs含量的方法，從品種的選育、田間栽培措施以及調(diào)制等方面進行了深入的研究，如Conkling[4]報道利用遺傳工程技術(shù)培育低煙堿品種，其煙葉加工成的煙草制品中TSNAs和煙堿含量均較低；宮長榮等[5]研究發(fā)現(xiàn)，煙葉中TSNAs含量隨著施氮量的增加而增加，適當(dāng)?shù)目刂剖┑坑兄赥SNAs含量的降低；韓錦峰等[6]研究發(fā)現(xiàn)，打頂時間對TSNAs前體物生物堿、硝酸鹽含量有較大的影響，適時打頂可以使TSNAs前體物的含量處于較低水平。大量研究表明，眾多栽培措施均可不同程度的影響生物堿、硝酸鹽含量，繼而影響TSNAs的形成和積累，尤其是施氮量和打頂時間[5-10]。本研究根據(jù)四川達州白肋煙生產(chǎn)實際情況，通過正交試驗將幾種對TSNAs有較大影響的技術(shù)因素進行耦合，探討不同栽培措施組合對白肋煙上部葉TSNAs及其前體物的影響，為達州地區(qū)優(yōu)質(zhì)低害白肋煙生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和材料

試驗于2014年在四川省達州市宣漢縣東林鄉(xiāng)進行（31.27°N，107.7°E，海拔545 m），當(dāng)?shù)貙賮啛釒駶櫦撅L(fēng)氣候，年均氣溫14.7 ℃，多年平均降雨量1199 mm，試驗地約0.3 hm2，供試品種為達白1號，土壤類型為棕壤土，基本理化性狀為pH 6.50，有機質(zhì)12.69 g/kg，堿解氮135.0 mg/kg，速效磷95 mg/kg，速效鉀110.0 mg/kg。試驗中所用仿生型信號分子（Bionics Signal Molecule，BSM）是本試驗室根據(jù)昆蟲口腔分泌物抑制煙草創(chuàng)傷脅迫相關(guān)機制而研制[11-13]，是一種羥基苯甲酸類衍生物，含量5%的水溶性粉狀物質(zhì)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用正交L9(34)設(shè)計，三因素分別是施氮量（A）、打頂時間（B）、BSM劑量（C）。試驗設(shè)9個處理組合（表1），隨機區(qū)組排列，重復(fù)3次，計27個小區(qū)，每小區(qū)120株煙。

表1 正交試驗表

1.3 田間管理和取樣方法

煙苗于2014年4月25日移栽，移栽密度1200株/667m2，行距×株距為1.2 m×0.5 m，所有肥料在移栽前一次性做基肥施用，肥料配比(N):(P2O5):(K2O)=10:10:28，其他栽培技術(shù)按當(dāng)?shù)匕桌邿熒a(chǎn)技術(shù)規(guī)范進行。BSM在煙葉打頂時使用，即在打頂后1~2 h內(nèi)將不同濃度BSM水溶物用毛筆涂抹到主莖頂端傷口斷面處。各小區(qū)煙葉分別采收，并掛牌標(biāo)記，調(diào)制方法同一般大田。調(diào)制結(jié)束后，取上部葉（第16~18片葉）為供試樣品，用于煙葉化學(xué)成分測定。

1.4 測定方法

按照YQ/T 29—2013采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測定TSNAs含量；按照YC/T 383—2010 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定生物堿含量；NO3–-N和NO2–-N含量利用紫外-可見分光光度計用比色法進行測定[14]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同栽培措施對TSNAs含量的影響

經(jīng)方差分析和多重比較可知（表2），施氮量對亞硝基假木賊堿（NAB）和NNK含量影響極顯著，對亞硝基新煙草堿（NAT）、NNN、TSNAs總量影響顯著，A1（施氮量210 kg/hm2）、A2（施氮量255 kg/hm2）的4種TSNAs及其總量（極）顯著低于A3（施氮量300 kg/hm2），且A1的4種TSNAs及其總量均最低。打頂時間對NNN、NAT、NAB、NNK和TSNAs總量影響差異極顯著，B2（現(xiàn)蕾打頂）的4種TSNAs及其總量（極）顯著低于B1（扣心打頂）、B3（初花打頂），尤其是NNN、NNK和TSNAs總量最低，優(yōu)于B1和B3。BSM同樣對4種TSNAs及其總量影響差異極顯著，C2的4種TSNAs及其總量最低，表現(xiàn)最佳。據(jù)此組合A1B2C2應(yīng)是最優(yōu)組合，各TSNAs組分及其總量均最低，尤其是NNN和NNK。

表2 不同處理組合TSNAs含量

注：不同大小寫字母表示各處理在0.01和0.05水平差異顯著，下同。

2.2 不同栽培措施組合對生物堿含量的影響

從表3可以看出，施氮量對4種生物堿及其總量的影響達（極）顯著水平，且是影響降煙堿、煙堿、總生物堿含量的主要因素，A1（施氮量210 kg/hm2）的降煙堿、煙堿、總生物堿含量最低且極顯著低于A2和A3。打頂時間對新煙草堿含量影響極顯著，B2（現(xiàn)蕾打頂）的降煙堿含量最低且其他生物堿含量適宜。BSM對降煙堿含量影響極顯著，對煙堿和總生物堿含量影響顯著，C2的降煙堿含量顯著低于C1和C3，由于降煙堿對煙葉吸味的負作用大且是NNN重要的前體物[15]，對煙葉品質(zhì)和安全性具有重要影響，白肋煙生產(chǎn)上要求其含量越低越好，據(jù)此組合A1B2C2的降煙堿含量最低且生物堿組成比例適宜。

表3 不同處理組合生物堿含量

2.3 不同栽培措施組合對NO3–-N和NO2–-N含量的影響

由表4可知，施氮量對NO3–-N和NO2–-N含量影響極顯著，A1（施氮量210 kg/hm2）的NO3–-N和NO2–-N含量最低且極顯著低于A2和A3。打頂時間對NO3–-N含量影響極顯著，B2（現(xiàn)蕾打頂）的NO3–-N和NO2–-N含量最低。BSM對NO3–-N和NO2–-N含量影響同樣極顯著，大小均依次為C2＜C1＜C3，C2時二者含量（極）顯著低于C1和C3。因此NO3–-N和NO2–-N含量最低的組合是A1B2C2，這與降低TSNAs含量的最優(yōu)組合具有一致性。

表4 不同處理組合NO3–-N和NO2–-N含量

2.4 白肋煙TSNAs與生物堿、硝酸鹽含量的相關(guān)性

由相關(guān)性分析可知（表5），達州地區(qū)白肋煙上部葉NNN、NAT、TSNAs總量與煙堿、總生物堿、NO3–-N極顯著正相關(guān)，與降煙堿、NO2–-N顯著正相關(guān)；NAB、NNK與降煙堿、煙堿、總生物堿、NO3–-N均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，NNK與NO2–-N呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。NNN和NNK對人體毒性大且具有較強的致癌性[3]，一直是TSNAs降害研究的焦點，通過本試驗的相關(guān)性分析可知，NNN、NNK、TSNAs總量與降煙堿、硝酸鹽呈正相關(guān)關(guān)系，這與前人的研究結(jié)果相一致[15]，因此通過田間農(nóng)藝措施降低TSNAs的前體物生物堿和硝酸鹽含量，繼而抑制后期TSNAs的形成和積累，對降低TSNAs含量尤其是NNN和NNK含量具有重要意義。

表5 生物堿、硝酸鹽與TSNAs的相關(guān)系數(shù)

注：*表示在0.05水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)；**在0.01水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)。

3 討 論

田間栽培技術(shù)中，氮肥用量對白肋煙產(chǎn)量及品質(zhì)的影響比其他任何養(yǎng)分都大[1]，同時也是影響TSNAs、生物堿、硝酸鹽含量的主要因素[5,7-8,16]。本研究結(jié)果表明，施氮量對白肋煙上部葉的4種TSNAs及其總量、4種生物堿及其總量、NO3–-N和NO2–-N含量的影響差異達到（極）顯著水平，施氮量210 kg/hm2的TSNAs含量最低，且TSNAs及其前體物含量隨著施氮量的增加而增加，這與已報道的結(jié)果相一致[7]。因為氮元素是構(gòu)成煙草生物堿、NO3–-N和NO2–-N的必需元素，所以控制施氮量可以有效降低TSNAs前體物的形成和積累，進而減少煙葉在后期調(diào)制、復(fù)烤、醇化等過程中TSNAs的形成[17-18]。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，目前達州白肋煙區(qū)田間實際施氮量普遍較高，試驗中所用的氮肥最高用量就是該地區(qū)多數(shù)煙農(nóng)的實際用量。因此在達州煙區(qū)控制氮肥用量，不僅是降低白肋煙上部葉TSNAs含量的需要，也是提高煙葉品質(zhì)的需要。

打頂改變了煙株生長和物質(zhì)代謝的中心，并促使煙株體內(nèi)養(yǎng)分重新調(diào)整與分配，是調(diào)控?zé)熤隊I養(yǎng)和煙葉品質(zhì)的重要栽培措施，尤其對煙株上部煙葉的質(zhì)量形成具有較大的影響[1]。同時打頂促進了煙株根系的生長發(fā)育和對養(yǎng)分的吸收利用，進而對煙堿等次生代謝產(chǎn)物的合成與積累產(chǎn)生較大的刺激作用，不同時期打頂對煙株體內(nèi)煙堿含量的積累影響不同[6]，因此打頂造成的含量變化必將反映到TSNAs的含量上來，適時打頂TSNAs的前體物生物堿和硝酸鹽的含量均較低[9-10]。本研究結(jié)果表明，打頂時間對上部煙葉的4種TSNAs及其總量的影響差異極顯著，現(xiàn)蕾期打頂TSNAs各組分及其前體物生物堿和硝酸鹽的含量均較低。因此適時打頂也是白肋煙田間生產(chǎn)實踐中降低TSNAs含量和提高煙葉安全性的重要措施。

田間生產(chǎn)中打頂會給煙草造成機械損傷，進而激發(fā)煙株的防御性反應(yīng)，在這一過程中創(chuàng)傷信號的積累和傳遞起著關(guān)鍵性作用[19]。BSM是本實驗室根據(jù)食煙性昆蟲口腔分泌物研制的一種仿生型信號分子[11-12]，前期相關(guān)研究表明，BSM可以在信號傳導(dǎo)的上游抑制煙草打頂造成的創(chuàng)傷所引發(fā)的氧化脅迫[13]，影響煙草植株對氮素的吸收、積累與代謝，繼而降低了生物堿和硝酸鹽在煙株體內(nèi)的形成與積累，最終降低煙葉中TSNAs含量[14,20-21]。本研究結(jié)果也表明，打頂后應(yīng)用BSM，上部煙葉的TSNAs及其前體物生物堿、硝酸鹽含量均較低。

4 結(jié) 論

本研究表明，在白肋煙生產(chǎn)中基于田間實際情況合理施用氮肥是降低TSNAs含量的重要措施；在適時打頂、結(jié)合應(yīng)用BSM對降低TSNAs含量也是十分有效的。綜合考慮，在四川達州白肋煙產(chǎn)區(qū)目前生產(chǎn)條件下，采用施氮量210 kg/hm2+現(xiàn)蕾打頂+0.3 μmol/L BSM這一栽培技術(shù)組合，可有效降低上部煙葉TSNAs含量，有利于卷煙工業(yè)對白肋煙的可持續(xù)利用。

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Effects of Different Cultivation Measures on TSNAs and their Precursors in Burley Tobacco

CHEN Xiang1,2, ZHOU Kaixu3, YANG Xingyou3, XIANG Jie3, HE Zhengchuan4, LIU Li1, ZHANG Yanmin1, CHENG Xinsheng1*

(1. Research Center of Tobacco and Health, University of Science and Technology of China , Hefei 230052, China; 2. College of Agronomy, Anhui Agriculture University, Hefei 230036, China; 3.Dazhou Tobacco Research Institute of Sichuan, Sichuan Dazhou 635000, China; 4. Xuanhan Tobacco Company, Xuanhan, Sichuan 636150, China)

To reveal the effects of different cultivation measures on TSNAs and their precursors in burley tobacco, an orthogonal experiment was conducted with different nitrogen application rates (210, 255 and 300 kg/ha), topping time (topping at buttoning stage, topping at budding stage and topping at initial flower stage) and BSM doses (0.1, 0.3 and 0.0 μmol/L). Contents of TSNAs, alkaloids and nitrate nitrogen were analyzed. The results showed that nitrogen application rate was the main influencing factor of the contents of TSNAs, alkaloids, nitrate-nitrogen and nitrite-nitrogen. Contents of TSNAs and their precursors of upper burley leaves were lower at 210 kg/ha nitrogen fertilizer. Topping time had an extremely significant effect on TSNA contents of upper leaves. When topping at budding stage TSNA contents were significantly lower than that of topping at buttoning stage and topping at initial flower stage. The contents of TSNAs, alkaloids, nitrate-nitrogen and nitrite-nitrogen with BSM treatment after topping were lower. At the conditions of this experiment, the optimal combination to reduce TSNAs is 210 kg/ha nitrogen application rate, topping at budding stage and 0.3 μmol/L BSM.

burley tobacco; nitrogen application rate; topping time; BSM; TSNAs

S572.062

1007-5119（2017）02-0014-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.02.003

四川省煙草公司項目“基于前體物控制的降低白肋煙TSNAs關(guān)鍵技術(shù)研究與集成”（201304）；中國煙草總公司重大專項“利用仿生型信號分子降低白肋煙葉TSNAs關(guān)鍵技術(shù)研究”（JH-04）

陳 翔（1990-），男，在讀博士研究生，研究方向為煙草栽培生理與減害技術(shù)研究。E-mail：1012791799@qq.com

，E-mail：xscheng@ustc.edu.cn

2016-06-14

2016-12-29