張智敏，夏伯候，周萬(wàn)猛，廖燕林，彭 粲，江豪杰，林麗美，羅 堃，李亞梅

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208； 2.湖南金昌生物技術(shù)有限公司，湖南 衡陽(yáng) 421300)

微波輔助提取茶籽多糖的工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

張智敏1，夏伯候1，周萬(wàn)猛2，廖燕林1，彭 粲1，江豪杰1，林麗美1，羅 堃1，李亞梅1

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208； 2.湖南金昌生物技術(shù)有限公司，湖南 衡陽(yáng) 421300)

采用微波輔助提取油茶籽粕中的茶籽多糖。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化茶籽多糖提取條件。并對(duì)茶籽多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，茶籽多糖最佳提取工藝條件為：微波功率800 W，微波時(shí)間6.5 min，料液比1∶60，提取時(shí)間2 h，提取溫度100℃。在最佳工藝條件下，茶籽多糖得率為(7.61±0.5)%。茶籽多糖對(duì)羥自由基、DPPH自由基和亞硝酸鹽都呈現(xiàn)出一定的清除能力，但清除超氧陰離子自由基能力和還原能力較弱。

茶籽多糖；微波輔助提??；抗氧化活性

油茶屬山茶科植物，是我國(guó)特有的木本食用油料樹種。然而，我國(guó)油茶籽利用率不高，油茶籽榨油后的油茶籽餅粕中含有大量的蛋白質(zhì)、茶皂素、粗纖維、多糖等，如能充分利用，必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。茶籽多糖是油茶籽中一種重要的生物大分子，具有抗血栓、降血糖、抑制UK562(人體白血病細(xì)胞)增長(zhǎng)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用，此外還可能有修復(fù)糖代謝紊亂的功能[1]。國(guó)內(nèi)外對(duì)茶籽多糖的理化性質(zhì)、分離純化方法和生理活性的研究報(bào)道較為全面。

茶籽多糖的提取方法主要有水提法[2]、酸堿提取法[3]、有機(jī)溶劑提取法[4]、超臨界CO2萃取法[5]、酶法[6]、超聲波輔助提取法[7]和微波輔助提取法[8]。陳桂冰等[9]以油茶籽粕為原料，提取條件為料液比1∶10、提取溫度70℃、提取時(shí)間3 h，茶籽多糖得率為30.31%，是已有的研究成果中得率較高的。研究[10]表明，茶籽多糖熱穩(wěn)定性差，高溫、過(guò)酸或偏堿的條件均會(huì)使其部分降解。而微波的熱效應(yīng)可以穿透到介質(zhì)內(nèi)部，迅速破壞細(xì)胞壁，使提取物快速分離出來(lái)[11]。因此，本課題采取微波輔助法提取茶籽多糖，以期提高油茶籽的利用率，推動(dòng)油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

油茶籽粕：湖南金昌生物技術(shù)有限公司提供。

考馬斯亮藍(lán)G250(進(jìn)口分裝)、牛血清白蛋白，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、濃硫酸、濃鹽酸、苯酚、丙酮、石油醚、抗壞血酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、DPPH、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、Tris、鄰苯三酚、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、咔唑、磷酸、鹽酸羥胺等，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

CP114電子天平，美國(guó)奧豪斯；G80F23DC微波爐，格蘭仕；STARTER3 pH計(jì)，美國(guó)奧豪斯；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；is5傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)熱電；721721分光光度計(jì)，上海舜宇。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶籽多糖的提取

將油茶籽粕粉碎過(guò)40目篩后，準(zhǔn)確稱取油茶籽粕粉末2 g，加95%乙醇80℃回流至冷凝管的下端滴出的乙醇不含油脂，除去單糖、低聚糖及脂類等醇溶性物質(zhì)，趁熱抽濾。濾渣烘干后加入一定體積的蒸餾水，靜置潤(rùn)濕0.5 h。在固定微波功率下處理一定時(shí)間后，回流提取一定時(shí)間，提取2次，合并提取液。將提取液減壓濃縮至原來(lái)的1/3，用Sevage法[12]脫蛋白質(zhì)，離心(3 000 r/min，15 min)取上清液，向上清液中加入無(wú)水乙醇調(diào)至70%乙醇，4℃靜置24 h，離心(4 800 r/min，15 min)，沉淀物依次用無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚反復(fù)洗滌3次，于40℃下干燥得茶籽多糖。

1.2.2 多糖得率的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[9]，以葡萄糖為參照，在490 nm 處測(cè)定吸光度，并代入下式計(jì)算多糖得率。

1.2.3 茶籽多糖的體外抗氧化活性及清除亞硝酸鹽能力測(cè)定

采用周曉薇等[13]的方法，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，在536 nm下測(cè)定清除羥自由基能力；采用Williams等[14]的方法，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，在517 nm下測(cè)定清除DPPH自由基能力；采用文獻(xiàn)[15]的方法，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，在700 nm下測(cè)定還原能力；采用文獻(xiàn)[16]的方法，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，在325 nm下測(cè)定清除超氧陰離子自由基能力；采用文獻(xiàn)[17]的方法，以NaNO2為標(biāo)準(zhǔn)，在538 nm下測(cè)定清除亞硝酸鹽能力。

1.2.4 光譜性質(zhì)分析

紫外掃描分析：將樣品配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的溶液，采用紫外-可見分光光度計(jì)在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描分析[18]。

紅外掃描分析：取干燥樣品1 mg，采用美國(guó)熱電is5傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描分析[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

微波功率、微波時(shí)間、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)茶籽多糖得率的影響分別如圖1～圖5所示。

注：料液比1∶40，微波時(shí)間5 min，提取溫度80℃，提取時(shí)間1.5 h。

圖1 微波功率對(duì)茶籽多糖得率的影響

注：料液比1∶40，微波功率320 W，提取溫度80℃，提取時(shí)間1.5 h。

圖2 微波時(shí)間對(duì)茶籽多糖得率的影響

注：微波功率320 W，微波時(shí)間5 min，提取溫度80℃，提取時(shí)間1.5 h。

圖3 料液比對(duì)茶籽多糖得率的影響

注：料液比1∶40，微波功率320 W，微波時(shí)間5 min，提取溫度80℃。

圖4 提取時(shí)間對(duì)茶籽多糖得率的影響

注：料液比1∶40，微波功率320 W，微波時(shí)間5 min，提取時(shí)間1.5 h。

圖5 提取溫度對(duì)茶籽多糖得率的影響

由圖1可知，當(dāng)微波功率低于480 W時(shí)，茶籽多糖得率隨著微波功率的升高而緩慢下降；當(dāng)微波功率為640 W時(shí)，茶籽多糖得率突然增至高峰。綜合考慮能耗及經(jīng)濟(jì)效益，選擇微波功率為640 W左右為宜。

由圖2可知，微波時(shí)間對(duì)茶籽多糖得率的影響較小，當(dāng)微波時(shí)間超過(guò)6.5 min時(shí)，茶籽多糖得率稍有下降。因此，選擇微波時(shí)間為6.5 min左右為宜。

由圖3可知，當(dāng)料液比低于1∶60時(shí)，茶籽多糖得率隨著料液比的升高而增加；當(dāng)料液比高于1∶60時(shí)多糖得率開始降低。因此，選擇料液比為1∶60左右為宜。

由圖4可知，提取時(shí)間在1.5 h時(shí)，茶籽多糖得率顯著高于其他提取時(shí)間的。因此，選擇提取時(shí)間為1.5 h左右為宜。

由圖5可知，前期茶籽多糖得率受提取溫度影響較小，在80℃后提取溫度對(duì)茶籽多糖得率的影響較大，茶籽多糖得率隨提取溫度的升高快速升高。這是由于細(xì)胞壁在熱水中更易被破壞，從而使更多的水溶多糖從中萃取出來(lái)。Klaus等[20]從裂褶菌中提取水溶性多糖，也得到相似的結(jié)論。因此，選擇提取溫度為90℃左右為宜。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定微波時(shí)間為 6.5 min，選取微波功率(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)和提取溫度(D)為因素，以茶籽多糖得率為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確定茶籽多糖提取的最佳工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表1可知，各因素對(duì)茶籽多糖得率的影響大小為D(提取溫度)>B(料液比)>A(微波功率)>C(提取時(shí)間)，其中提取溫度對(duì)茶籽多糖得率的影響最大，料液比及微波功率次之，而提取時(shí)間對(duì)茶籽多糖得率影響較小。茶籽多糖最佳提取工藝組合為A3B2C3D3，即微波功率800 W，料液比1∶60，提取時(shí)間2 h，提取溫度100℃。

按最佳工藝條件設(shè)計(jì)3組平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到茶籽多糖的平均得率為(7.61±0.5)%，高于正交實(shí)驗(yàn)表中各實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

2.3 茶籽多糖的體外抗氧化活性

2.3.1 清除羥自由基能力(見圖6)

羥自由基在活性氧自由基中的活性最強(qiáng)。它能誘導(dǎo)周圍的核酸、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等生物大分子產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，從而引發(fā)癌癥、衰老等疾病。由圖6可知，羥自由基的清除效果與茶籽多糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系。當(dāng)茶籽多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，羥自由基的清除率達(dá)到23.23%。但與VC相比，其羥自由基清除能力很弱。

圖6 茶籽多糖對(duì)羥自由基的清除能力

2.3.2 清除DPPH自由基能力(見圖7)

圖7 茶籽多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

DPPH是一種合成的較為穩(wěn)定的自由基。由圖7可知，隨著茶籽多糖質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基清除能力增強(qiáng)。當(dāng)茶籽多糖質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時(shí)，DPPH自由基的清除率達(dá)到72.09%。但與VC相比，其DPPH自由基清除能力較弱。

2.3.3 還原能力(見圖8)

圖8 茶籽多糖的還原能力

由圖8可知，隨著茶籽多糖質(zhì)量濃度的增加，其還原能力無(wú)明顯變化。當(dāng)VC質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，其吸光值為3.99，而茶籽多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，吸光值僅為0.854。這說(shuō)明茶籽多糖幾乎沒有還原能力。

2.3.4 清除超氧陰離子自由基能力(見圖9)

由圖9可知，隨著茶籽多糖質(zhì)量濃度的增加，超氧陰離子自由基的清除能力稍有增強(qiáng)。當(dāng)茶籽多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，超氧陰離子自由基清除率僅為32.80%。由此可見，茶籽多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力較弱。

圖9 茶籽多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

2.4 清除亞硝酸鹽能力(見圖10)

圖10 茶籽多糖對(duì)亞硝酸鹽的清除能力

由圖10可知，茶籽多糖對(duì)亞硝酸鹽有較好的清除能力，其清除效果與茶籽多糖的劑量呈正相關(guān)性，呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。當(dāng)茶籽多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1.6 mg/mL時(shí)，亞硝酸鹽的清除率為22.76%。

2.5 紫外掃描分析(見圖11)

圖11 紫外掃描圖譜

由圖11可知，茶籽多糖在190～200 nm間具有多糖的特征吸收峰[21]，在260 nm波長(zhǎng)處均沒有吸收峰，說(shuō)明不含核酸成分；在280 nm波長(zhǎng)處均略有吸收，說(shuō)明其中含有蛋白質(zhì)，這是因?yàn)镾evage法雖然對(duì)蛋白質(zhì)的清除率較高，但蛋白質(zhì)與多糖常形成糖蛋白復(fù)合物，使蛋白質(zhì)的清除較為困難。

2.6 紅外掃描分析(見圖12)

圖12 紅外掃描圖譜

3 結(jié) 論

采用微波輔助提取茶籽多糖，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到茶籽多糖的提取工藝條件為：微波功率800 W，微波時(shí)間6.5 min，料液比1∶60，提取時(shí)間2 h，提取溫度100℃。在優(yōu)化工藝條件下，茶籽多糖的平均得率為(7.61±0.5)%。

茶籽多糖對(duì)羥基自由基、DPPH自由基和亞硝酸鹽都呈現(xiàn)出一定的清除能力，但清除超氧陰離子自由基能力和還原能力較弱。

紫外掃描結(jié)果表明：茶籽多糖在260 nm處均沒有吸收峰，說(shuō)明多糖中不含核酸成分；在280 nm處都略有吸收，說(shuō)明其含有少量蛋白質(zhì)。紅外掃描結(jié)果表明：根據(jù)特征吸收峰可以初步判定為多糖，且含有蛋白質(zhì)和糖醛酸。

本研究?jī)H從體外化學(xué)實(shí)驗(yàn)法的角度考察了茶籽多糖對(duì)自由基的清除活性，未開展動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)，因此大量純化富集茶籽多糖，并結(jié)合多糖構(gòu)效關(guān)系以及動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)，全面充分驗(yàn)證茶籽多糖的抗氧化生理活性宜作為今后研究方向之一。

[1] WEI X L，MAO F F，CAI X，et al. Composition and bioactivity of polysaccharides from tea seeds obtained by water extraction[J]. Int J Biol Macromol，2011，49(4)：587-590.

[2] 盧金珍，孫金龍，任俊，等. 綠茶茶多糖提取工藝優(yōu)化研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012，28(7)：335-336，339.

[3] 陳小強(qiáng)，周瑛，葉陽(yáng)，等. 堿溶性茶多糖的提取及其分析[J]. 應(yīng)用化學(xué)，2008(12)：1496-1498.

[4] 謝愛澤，鄒登峰，章艷，等. 丙酮沉淀法提取金花茶多糖的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(25)：15268-15269.

[5] 陳明，熊琳媛，袁城. 茶葉中多糖提取技術(shù)進(jìn)展及超臨界萃取探討[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(8)：4770-4771.

[6] 李星科，彭星星，李素云，等. 酶法提取信陽(yáng)紅茶多糖的工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33(20)：168-170,175.

[7] 許子競(jìng)，廖敏富，陳海燕，等. 金花茶葉多糖超聲波輔助提取工藝優(yōu)化和含量測(cè)定[J]. 食品科學(xué)，2010，31(4)：53-58.

[8] 陳義勇，竇祥龍，黃友如，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波同輔助提取茶多糖工藝[J]. 食品科學(xué)，2012，33(4)：100-103.

[9] 陳桂冰，孫培冬，季曉彤，等. 茶籽多糖的提取及脫蛋白工藝研究[J]. 中國(guó)油脂，2016，41(8)：74-77.

[10] 崔宏春，余繼忠，黃海濤，等. 茶多糖的提取及分離純化研究進(jìn)展[J]. 茶葉，2011，37(2)：67-71.

[11] 吳世榮. 黃酮類化合物的提取分離及定量構(gòu)效關(guān)系研究[D]. 重慶：重慶大學(xué)，2005.

[12] 張麗美. 茶粕多糖提純工藝、結(jié)構(gòu)初探及體外抗氧化研究[D]. 南昌：南昌大學(xué)，2013.

[13] 周曉薇，王靜，段浩，等. 鐵棍山藥蛋白質(zhì)的分離純化及體外抗氧化活性[J]. 食品科學(xué)，2011，32(9)：31-35.

[14] WILLIAMS W B，CUVELIER M E，BERSER C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J]. Lebensmittel Wissenseaft Technol，1995，28(1)：25-30.

[15] LI X M，LI X L，ZHOU A G. Evaluation of antioxidant activity of the polysaccharides extracted fromLyciumbarbarumfruits in vitro[J]. Eur Polym J，2007，43(2)：488-497.

[16] GE Y，DUAN Y F，F(xiàn)ANG G Z，et al. Polysaccharides from fruit calyx ofPhysalisalkekengivar. francheti：isolation，purification，structural features and antioxidant activities[J]. Carbohydr Polym，2009，77：188-193.

[17] 李粉玲，蔡漢權(quán)，陳利生. 金絲草多糖的抗氧化性及還原能力的研究[J]. 有機(jī)化學(xué)研究，2015，3(1)：16-24.

[18] ZHAO M M，YANG N，YANG B，et al. Structural characterization of water-soluble polysaccharides fromOpuntiamonacanthacladodes in relation to their anti-glycated activities[J]. Food Chem，2007，105：1480-1486.

[19] PARIKH A，MADAMWAR D. Partial characterization of extracellular polysaccharide from cyanobacteria[J]. Bioresour Technol，2006，97：1822-1827.

[20] KLAUS A，KOZARSKI M，JAKOVIJEVIC D，et al. Antio-xidant activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commume[J]. LWT-Food Sci Technol，2011，44:2005-2011.

[21] 陶俊. 油茶籽多糖分離純化及降脂機(jī)理的研究[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

Microwave-assisted extraction and antioxidant activity in vitro of oil-tea camellia seed polysaccharides

ZHANG Zhimin1， XIA Bohou1， ZHOU Wanmeng2， LIAO Yanlin1， PENG Can1， JIANG Haojie1， LIN Limei1， LUO Kun1， LI Yamei1

(1. College of Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. Hunan Jinchang Biotechnology Co.， Ltd.， Hengyang 421300， Hunan， China)

The microwave-assisted technology was applied to extract polysaccharides from oil-tea camellia seed meal．According to single factor experiment， the extraction conditions of oil-tea camellia seed polysaccharides were optimized by orthogonal experiment. And the in vitro antioxidant activity of oil-tea camellia seed polysaccharides was studied. The results showed that the optimal extraction conditions of oil-tea camellia seed polysaccharides were obtained as follows：microwave power 800 W， microwave time 6.5 min， ratio of material to liquid 1∶60， extraction time 2 h， extraction temperature 100℃. Under these conditions， the yield of oil-tea camellia seed polysaccharides was (7.61±0.5)%. The oil-tea camellia seed polysaccharides had certain scavenging activity on hydroxyl free radical， DPPH free radical and nitrites， nevertheless， its scavenging ability on superoxide anion free radical and reducing ability were weak.

oil-tea camellia seed polysaccharides； microwave-assisted extraction； antioxidant activity

2016-06-29；

2016-11-25

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥技能大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練中心創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(201502)；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(16C1223)；湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)青年教師科研基金項(xiàng)目(99820001-194)

張智敏(1986)，女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事油茶籽綜合開發(fā)利用研究工作(E-mail)cslgdxzzm@163.com。

夏伯候，講師，博士(E-mail)xiabohou@163.com。

TS229；R151

A

1003-7969(2017)04-0131-05