王倩，陽琰，陳其榮，張晗，高琳，廖鑫，王茜

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，貴州 遵義 563003）

內(nèi)脂素對2型糖尿病kkay小鼠骨骼肌組織PI3K和GLUT-4的影響*

王倩，陽琰，陳其榮，張晗，高琳，廖鑫，王茜

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，貴州 遵義 563003）

目的 觀察內(nèi)脂素（visfatin）對kkay糖尿病小鼠骨骼肌組織磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT-4）的影響。方法C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為普通飼料喂養(yǎng)組（CON）、高脂飼料喂養(yǎng)組（HFD），kkay小鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組（DM）和visfatin治療組（V）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和W estern blot方法測定各組小鼠骨骼肌中PI3K和GLUT-4的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果V組腹腔注射visfatin后的血糖較注射前下降（P=0.013），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DM組PI3K、GLUT-4的mRNA及蛋白表達(dá)量較CON組、HFD組降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；V組PI3K、GLUT-4的mRNA及蛋白表達(dá)量較DM組增加（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論內(nèi)脂素可上調(diào)骨骼肌組織PI3K和GLUT-4的表達(dá)。

內(nèi)脂素；kkay小鼠；骨骼?。籔I3K；GLUT-4

糖尿病是以高血糖為特征的一組疾病，主要病理生理機(jī)制為胰島素抵抗和（或）胰島素分泌不足，其中2型糖尿病的主要病理機(jī)制是胰島素抵抗。內(nèi)脂素（visfatin）具有模擬胰島素降糖作用，可改善胰島素抵抗，但其降血糖的機(jī)制并不明確，部分研究結(jié)果并不一致。正常生理狀態(tài)下，骨骼肌作為胰島素作用的主要靶器官之一，葡萄糖在骨骼肌中的轉(zhuǎn)運(yùn)受損是導(dǎo)致外周胰島素抵抗的重要原因。本實(shí)驗(yàn)選用自發(fā)型2型糖尿病動物模型kkay小鼠為研究對象，通過觀察visfatin對kkay糖尿病小鼠骨骼肌組織磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase isoforms，PI3K）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transport protein-4，GLUT-4）的影響，以期為糖尿病發(fā)病機(jī)制及治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動物：SPF級8周齡雄性kkay小鼠，體重30 g左右，SPF級8周齡雄性C57BL/6J小鼠，體重20 g左右，均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，許可證編號：SCXK（京）2009-0004；kkay小鼠全價(jià)高脂飼料（購自中國醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動物研究所，組成：78.8%基礎(chǔ)飼料，10%蛋黃粉，10%豬油，1%膽固醇，0.2%膽鹽）；飼養(yǎng)于室溫20～24℃，濕度40%～60%的環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)材料：小鼠胰島素測定試劑盒（美國R&D system公司），強(qiáng)生穩(wěn)步倍加型血糖儀（測定血糖），內(nèi)脂素重組蛋白購于以色列PROSPEC公司，GLUT-4抗體購于美國Abcam公司，PI3K抗體購于美國Cell signaling公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）儀為美國Bio-Rad公司。

1.2 模型的復(fù)制及分組

C57BL/6J小鼠用隨機(jī)數(shù)字法分為普通飼料喂養(yǎng)組（normal diet group，CON）和高脂飼料喂養(yǎng)組（high-fat diet group，HFD），kkay小鼠以高脂飼料喂養(yǎng)，每周定時(shí)測定1次空腹血糖，直至連續(xù)2次空腹血糖≥13.9mmol/L為糖尿病成模，成模后的小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)21周后又隨機(jī)分為糖尿病模型組（diabeitc group，DM） 和 visfatin治療組（visfatin treatment group，V），V組連續(xù)3 d腹腔注射visfatin重組蛋白（6μg/kg，0.05ml/10g）。DM組、CON組及HFD組均注射等量磷酸鹽緩沖液（PBS）。

1.3 標(biāo)本采集

腹腔注射麻醉（10%水合氯醛）小鼠成功后眼球取血，3 000 r/min離心15min取上清液保存于-80℃冰箱用于測定胰島素。迅速分離小鼠右后側(cè)骨骼肌組織，生理鹽水清洗干凈后濾紙吸干水分，取約100mg置于1ml Trizol中-80℃冰箱凍存，用于RT-PCR；其余骨骼肌速凍后置入-80℃冰箱冷凍保存用于Western blot檢測。

1.4 RT-PCR法測定骨骼肌組織中PI3K、GLUT-4 m RNA的表達(dá)

按照氯仿-異丙醇-乙醇法提取骨骼肌總RNA，按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用10μl PCR反應(yīng)體系（正反向引物0.5μl+cDNA稀釋液2μl+0.1% DEPC水 2.5μl+SYBR Green Su permix熒光混合物5μl）；反應(yīng)條件：95.0℃×3min；95.0℃×10 s，60.0℃×45 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均設(shè)副孔，取CT平均值。β-actin：正向引物5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，反向引物5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'；PI3K正向引物5'-CCCATGGGACAACATTCCAA-3'，反向引物5'-CATGGCGACAAGCTCGGTA-3'；GLUT-4正向引物5'-TTCTTATTGCAGCGCCTGAGTC-3'，反向引物5'-CCAAGCACAGCTGAGAATACAGCTA-3'。

1.5 Western blot法測定骨骼肌組織PI3K和GLUT-4蛋白的表達(dá)

取小鼠骨骼肌組織約100mg于1.5ml EP管中，剪刀將組織塊剪碎后，加入1 ml裂解液 ，在冰上勻漿至乳糜狀，離心20 min，取上清即為蛋白液，將蛋白液分裝于小EP管中置入-80℃冰箱保存。按BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性（100℃，5min）后上樣電泳，電轉(zhuǎn)，封閉，加入PI3K、GLUT-4一抗孵育過夜。第2天洗膜后加入二抗搖床中孵育1 h，曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素方差分析用于多組間數(shù)據(jù)的比較，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠部分代謝指標(biāo)

DM組體重較CON組升高（P=0.002），較HFD組升高（P=0.002），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DM組血糖較CON組升高（P=0.010），較HFD組升高（P=0.007），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；V組血糖較DM組降低（P=0.027），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4 mRNA表達(dá)

DM組小鼠骨骼肌PI3K mRNA較CON組下降（P=0.043），較HFD組下降（P=0.045），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；V組小鼠骨骼肌PI3K mRNA較DM組上升（P=0.009），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DM組小鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA表達(dá)較CON組下降（P=0.014），較HFD組下降（P=0.012），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；V組GLUT-4 mRNA表達(dá)較DM組上升（P=0.004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 4組小鼠部分代謝指標(biāo)比較 （n=8，±s）

表1 4組小鼠部分代謝指標(biāo)比較 （n=8，±s）

注：1）與CON組比較，P＜0.05；2）與HFD組比較，P＜0.05；3）與DM組比較，P＜0.05；4）與注射visfatin（或PBS）前比較，P＜0.05

空腹胰島素/（μIU/L）CON組 24.4±0.80 7.78±1.15 9.33±2.39 5.18±0.59 HFD組 25.04±1.03 9.04±1.25 9.64±1.03 6.55±0.401）DM組 41.23±3.951）2） 21.18±4.93 20.86±3.621）2） 8.63±0.671）2）V組 38.73±4.59 19.90±2.403） 13.43±1.103）4） 7.71±1.28F值 32.88 24.16 21.81 17.39P值 0.25 0.14 0.11 0.16組別 體重/g 血糖（給visfatin或PBS前）/（mmol/L） 血糖（給visfatin或PBS后）/（mmol/L）

表2 4組小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4 m RNA表達(dá)比較（n=8±s）

表2 4組小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4 m RNA表達(dá)比較（n=8±s）

注：1）與CON組比較，P＜0.05；2）與HFD組比較，P＜0.05；3）與DM組比較，P＜0.05

GLUT-4/β-actin CON組 4.36±0.65 6.24±0.61 HFD組 3.94±0.29 6.16±0.64 DM組 3.41±0.181）2） 3.78±0.661）2）V組 4.23±0.253） 6.92±0.633）F值 4.77 18.60P值 0.27 0.90組別PI3K/β-actin

2.3 小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4蛋白表達(dá)

圖1 4組小鼠骨骼肌組織PI3K蛋白的表達(dá)

如圖1、2所示，DM組小鼠骨骼肌組織PI3K蛋白表達(dá)較CON組降低（P=0.007），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；V組PI3K蛋白較DM組增高（P=0.013），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DM組GLUT-4蛋白表達(dá)量較CON組降低（P=0.004），較HFD組降低（P=0.009），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；V組GLUT-4蛋白表達(dá)量較DM組增高（P=0.004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 4組小鼠骨骼肌組織GLUT-4蛋白的表達(dá)

3 討論

Visfatin自被發(fā)現(xiàn)以來，大量的研究致力于vis fatin與糖尿病的關(guān)系及其調(diào)控血糖的機(jī)制，該研究有望為糖尿病的治療提供新的策略。研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，糖尿病人群血漿中的visfatin濃度均明顯升高[1-4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，visfatin濃度的升高也能使血漿葡萄糖水平呈劑量依賴性的降低[1-2，5-6]。該研究均表明Visfatin與血糖有著密切的關(guān)系。Visfatin主要在脂肪組織中表達(dá)，在肌肉、肝臟、活化的淋巴細(xì)胞、下丘腦等也有表達(dá)[7]。KRZYSIK-WALKER等發(fā)現(xiàn)，骨骼肌是小雞體內(nèi)visfatin的主要來源，visfatin可能影響骨骼肌的生長和代謝[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程中，骨骼肌的代謝障礙起著重要的作用[9]。因此，研究visfatin在骨骼肌中的代謝可能成為緩解胰島素抵抗的突破點(diǎn)。Visfatin有多種生理功能[10]，有研究表明，visfatin有類胰島素樣作用，通過與胰島素受體結(jié)合促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞對葡萄糖的攝取，抑制肝細(xì)胞葡萄糖的釋放，從而達(dá)到降低血糖的作用[7，11]。研究表明，visfatin與胰島素受體結(jié)合導(dǎo)致受體磷酸化、反向信號分子活化，visfatin與胰島素非競爭性的與胰島素受體結(jié)合，表明visfatin和胰島素分別結(jié)合在胰島素受體的不同部位[12]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腹腔注射小鼠visfatin重組蛋白3 d后，血糖較注射visfatin前降低，表明visfatin降低血糖，可能visfatin與胰島素降糖機(jī)制有所不同，值得筆者深入研究。本研究中HFD組空腹胰島素較CON組升高，說明高脂飲食刺激，HFD組分泌較多的胰島素，HFD組空腹胰島素代償性分泌增多的結(jié)果，使得HFD組小鼠的血糖維持動態(tài)平衡。與CON組、HFD組比較，DM組血糖及空腹胰島素升高，同時(shí)DM組小鼠PI3K、GLUT-4 mRNA及蛋白表達(dá)均降低；糖尿病小鼠注射visfatin之后血糖下降，而空腹胰島素反而下降，考慮visfatin降低血糖的機(jī)制并非是直接由胰島素所起作用，可能visfatin具有類胰島素作用。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，visfatin在骨骼肌中的表達(dá)水平與骨骼肌糖脂代謝狀態(tài)有關(guān)，visfatin可能通過PI3K信號傳導(dǎo)通路參與骨骼肌糖脂代謝的調(diào)節(jié)。因葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴GLUT-4在膜內(nèi)外的轉(zhuǎn)移，而GLUT-4的表達(dá)受其正向基因PI3K的調(diào)控。綜合DM組和V組的上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者推測visfatin可能是通過增加PI3K和GLUT-4的基因表達(dá)而起到降低血糖水平、改善胰島素抵抗的作用。

總之，visfatin可上調(diào) kkay小鼠骨骼肌組織PI3K、GLUT-4 mRNA及蛋白表達(dá)，從而影響血糖代謝。本研究有望為visfatin與糖尿病關(guān)系提供理論證據(jù)，而visfatin在糖脂代謝中的具體機(jī)制尚需在細(xì)胞水平及人體臨床研究中進(jìn)一步闡明。

[1]LAYLA K A.Visfatin levels in iraqi controlled diabetic patients and uncontrolled diabetic with cardiomyopathy[J].Journal of Natural Sciences Research,2015,5:39-41.

[2]ESTEGHAMATI A,ALAMDARI A,ZANDIEH A,et al.Serum visfatin is associated with type 2 diabetes mellitus independent of insulin resistance and obesity[J].Diabetes Res Clin PR,2011,91: 154-158.

[3]JEANNETTE M,MOLLY H,CYNTHIA SC,et al.Adipokine gene expression in peripheral blood of adult and juvenile dermatomyositis patients and their relation to clinical parameters and disease activity measures[J].J Neuroinflamm,2015,12:29.

[4]楊再剛,趙艷艷,岳欣閣,等.糖尿病患者血漿visfatin水平變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2013,53(31):31-32.

[5]HAIDER D G,SCHALLER G,KAPIOTIS S,et al.The release of the adipocytokine visfatin is regulated by glucose and insulin[J]. Diabetologia,2008,49:1909-1914.

[6]CHEN M P,CHUNG FM,CHANG DM,et al.Elevated plasma level of visfatin/pre-B cell colony-enhancing factor in patients with type 2 diabetes mellitus[J].J Clin Endocrinol Metab,2006, 91(1):295-299.

[7]FUKUHARA A,MATSUDA M,NISHIZAWA M,et al.Visfatin: a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin[J].Science,2005,307:426-430.

[8]KRZYSIK-WALKER S M,OCN-GROVE O M,MADDINENI S R,et al.Is visfatin an adipokine or myokine?Evidence for greater visfatin expression in skeletal muscle than visceral fat in chickens[J].Endocrinology,2008,149(4):1543-1550.

[9]DEFRONZO R A,TRIPATHY D.Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes[J].Diabetes Care, 2009,32(2):S157-163.

[10]PRAGUE M R,SMITKA K,MARES OVáD.Adipose tissue as an endocrine organ:an update on pro-inflmmatory and anti-inflmmatory microenvironment[J].Prague Medical Report,2015, 116(2):87-111.

[11]SESHI JK,VIDAL-PUIG A.visfatin:the missing link between intra-abdominal obesity and diabetes[J]Trends Mol Med,2005, 11:344-347.

[12]ADEGHATEE.Visfatin:structure,function and relation to diabetes mellitus and other dysfunctions[J].Curr Med Chem,2008, 15:1851-1862.

（張蕾 編輯）

Influence of visfatin on PI3K and GLUT-4 in skeletalmuscle of diabetic kkay m ice*

Qian Wang,Yan Yang,Qi-rong Chen,Han Zhang,Lin Gao,Xin Liao,Qian Wang
(Department of Endocrinology,the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College, Zunyi,Guizhou 563003,China)

ObjectiveTo observe the influence of visfatin on glucose transporter 4(GLUT-4)and phosphatidylinositol 3-kinase isoform(PI3K)in skeletal muscle of kkay mice.MethodsC57BL/6Jmice were random ly divided into normal diet group (group CON)and high-fat diet group (group HFD);kkay mice were divided into diabetic group (group DM)and visfatin treatmentgroup(group V).PI3K and GLUT-4mRNA and protein expressions in the skeletal muscle were measured by qRT-PCR and Western blot.ResultsIn the group V,blood glucose significantly decreased after intraperitoneal injection of visfatin(P=0.013).PI3K and GLUT-4mRNA and protein expressions of skeletalmuscle were significantly lower in the group DM than in the groups CON and HFD (P＜0.05).PI3K and GLUT-4 mRNA and protein expressions of skeletal muscle were significantly higher in the group V than in the group DM(P＜0.05).ConclusionsVisfatin increases the expressions of PI3K and GLUT-4 in skeletalmuscle.

visfatin;kkaymice;skeletalmuscle;PI3K;GLUT-4

R 589.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.001

1005-8982（2017）07-0001-04

2016-07-20

國家自然科學(xué)基金（No：81660142）

高琳，E-mail：lgzymc@sina.com，Tel：13595286671