● 高厚明 陳建平 石巧玲

小兒安神補腦顆粒對氧化損傷細胞的保護作用及其抗氧化應激損傷機制※

● 高厚明*陳建平 石巧玲

目的：本研究旨在探討體外實驗中小兒安神補腦顆粒在6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導的PC12細胞氧化損傷中的保護作用及其作用機制。方法：采用6-OHDA損傷PC12細胞制備PC12細胞氧化損傷模型。加入小兒安神補腦顆粒觀察各組細胞生長情況。結果：小兒安神補腦顆粒能抑制6-OHDA誘導的細胞凋亡，顯著增加細胞超氧化物歧化酶(SOD)和(GSH-Px)的活性，顯著減少細胞中的丙二醛(MDA)的含量，同時顯著提高PC12細胞核因子E2相關因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化還原酶-1(NQO-1)的mRNA表達。結論：小兒安神補腦顆粒對6-OHDA誘導的PC12細胞氧化損傷具有包含作用，其機制可能與其促進Nrf2基因表達，進而提高抗氧化蛋白表達水平，減輕氧化應激損傷有關。

小兒安神補腦顆粒 氧化應激 Nrf2 抗氧化蛋白

小兒多發(fā)性抽動癥是一種兒童行為障礙性疾病。臨床以多發(fā)性抽動、爆發(fā)性發(fā)聲及猥褻語言、模仿言語伴奇癖生活方式為特征，呈復雜的、慢性神經(jīng)精神疾病的表現(xiàn)[1]。小兒多發(fā)性抽動癥是一種復雜的慢性現(xiàn)代病，因其病因及發(fā)病機制尚未明確，故治療尚未有突破性進展。目前西醫(yī)治療該病主要采用神經(jīng)阻滯劑如氟哌啶醇治療，但其有效率僅為50%～70%左右。

中醫(yī)認為，小兒多發(fā)性抽動癥的主要病因為肝風內動，風痰上蒙，阻滯清竅，心神不寧，治療以祛風化痰、補腦安神為原則。小兒安神補腦顆粒是課題組成員結合臨床體會，針對本病病機研制而成的中藥醫(yī)院制劑。臨床研究表明，小兒安神補腦顆粒是治療小兒多發(fā)性抽動癥的有效藥物，與對照組氟哌啶醇比較有顯著差異，遠期效果也優(yōu)于氟哌啶醇，復發(fā)率明顯低于氟哌啶醇，克服了目前小兒多發(fā)性抽動癥西藥治療的缺陷[2]。但目前該制劑相關的作用機制尚未明確，因而限制了其進一步的應用。在神經(jīng)系統(tǒng)性疾病中，通常伴隨腦內氧化應激損傷、神經(jīng)再生障礙和神經(jīng)營養(yǎng)因子缺失等，小兒安神補腦顆粒是否能通過改善神經(jīng)系統(tǒng)性疾病中常見的病理狀態(tài)而達到治療小兒多發(fā)性抽動癥還未見報道。因此，本研究擬通過建立PC12細胞的氧化應激細胞模型，評價小兒安神補腦顆粒的抗氧化應激作用，并評價小兒安神補腦顆粒是否通過Nrf2-ARE信號通路改善細胞防御體系。

1 材料

1.1 藥物和試劑 小兒安神補腦顆粒藥物組成：石菖蒲、遠志、益智仁、膽南星、陳皮、半夏、羌活、石決明、礞石等。主要功效：滌痰止驚，補腦安神。取小兒安神補腦顆粒用蒸餾水完全溶解，將上清液調整為含生藥50mg·mL-1，調pH值為7.4，高壓滅菌后放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。SOD、GSH-Px和MDA試劑盒購買自南京建成生物工程研究所。Nrf2、HO-1、NQO-1及內參GAPDH引物均由由上海生工生物技術服務有限公司合成。

1.2 細胞株 PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 PC12細胞的培養(yǎng) PC12細胞置于DMEM高糖型培養(yǎng)基進行培養(yǎng)(培養(yǎng)基含1% L-谷氨酰胺，1%青鏈霉素，10%胎牛血清)，低分化PC12細胞半貼壁，3天換液1次。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長其可進行傳代，0.05%的胰酶消化液消化細胞1-2min，加入等量含血清的培養(yǎng)基終止消化，收取含細胞的培養(yǎng)液于15mL離心管以1500 r·min-1離心5min，棄盡含胰酶的培養(yǎng)液，細胞以1∶3-1∶5比例進行傳代。以細胞密度在(1-2)×105/mL左右接種于的常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)24小時后換液，待細胞狀態(tài)較好，進入對數(shù)生長期開始后續(xù)實驗。

2.2 分組 實驗分為(1)正常對照組。(2)6-OHDA應激組：給予終濃度為120 μmol·L-1的6-OHDA，作用24 h。(3)6-OHDA+小兒安神補腦顆粒實驗組：分別給予終濃度為0.1、0.4、1.6、6.4mg·L-1的小兒安神補腦顆粒提取液，24h后給予終濃度為120 μmol·L-1的6-OHDA，作用24h。

2.3 MTT實驗 按上述實驗分組作用24h后，每孔加入濃度為5mg·mL-1的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸去上清液，每孔加入100 μL的二甲基亞砜，37℃孵育1h后，酶標儀測定570nm處的吸光值。

2.4 SOD和MDA檢測 收集細胞后制成細胞懸液，3000 r·min-1離心10 min，移去上清，PBS清洗后用含EDTA和TtitonX-100的PBS緩沖液進行裂解，3000 r·min-1離心15min，收集上清液，按照SOD和MDA試劑盒說明書進行測定。

2.5 RT-PCR檢測 采用Trizol試劑裂解細胞。吸取裂解液于1.5mL離心管中，室溫放置5-10min。接著加入0.2mL三氯甲烷，劇烈震蕩15s，室溫放置3min。之后12000r·min-1離心10min。吸取上清水相轉移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20min。12000 r·min-1離心10min，棄上清。底部出現(xiàn)的白色沉淀即RNA。加入1mL 75% 乙醇洗滌沉淀。12000 r·min-1離心3min，棄上清。室溫干燥5-10min。加入30-50μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA后將溶液置于-80℃保存。按照熒光定量試劑盒測定Nrf2、HO-1、NQO-1及內參GAPDH表達量。

3 結果

3.1 小兒安神補腦顆粒對6-OHDA誘導PC12細胞增殖的影響 6-OHDA應激組細胞存活率顯著低于正常組(P<0.01)。0.4 mg·L-1、1.6 mg·L-1、6.4 mg·L-1小兒安神補腦顆粒提取液處理后，細胞存活率較6-OHDA應激組顯著提高(P<0.05；P<0.01；P<0.01)。見表1。

表1 小兒安神補腦顆粒對PC12細胞增殖的影響±s，n=8)

注：與正常組比較，##P<0.01；與6-OHDA應激組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 小兒安神補腦顆粒對6-OHDA誘導PC12細胞SOD、GSH-Px和MDA的影響 6-OHDA應激組細胞SOD和GSH-Px活性較正常組顯著降低(P<0.01；P<0.01)，MDA釋放較正常組顯著增加(P<0.01)。0.4 mg·L-1、1.6 mg·L-1、6.4 mg·L-1小兒安神補腦顆粒提取液處理后，SOD和GSH-Px活性較6-OHDA應激組顯著提高(P<0.05或P<0.01)，MDA釋放較6-OHDA應激組顯著降低(P<0.05；P<0.01；P<0.01)。見表2。

表2 小兒安神補腦顆粒對PC12細胞SOD、GSH-Px和MDA活性的影響

注：與正常組比較，##P<0.01；與6-OHDA應激組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 小兒安神補腦顆粒對6-OHDA誘導PC12細胞Nrf2、HO-1和NQO-1的影響 6-OHDA應激組細胞Nrf2、HO-1和NQO-1表達較正常組顯著降低(P<0.05；P<0.05；P<0.05)。小兒安神補腦顆粒提取液處理后，Nrf2、HO-1和NQO-1表達較6-OHDA應激組顯著提高(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 小兒安神補腦顆粒對PC12細胞Nrf2、HO-1和NQO-1表達的影響

注：與正常組比較，#P<0.05；與6-OHDA應激組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

中醫(yī)將神經(jīng)系統(tǒng)疾病定義為“生理性腎虛”，補腎從古至今都被認為是防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要治法[3]。中醫(yī)理論認為“腎藏精，主骨生髓，髓通于腦，腦為髓?！?。因此腦髓是否充足和腎之盛衰具有緊密的聯(lián)系。腎旺盛則腦髓充足，腎衰虧虛則腦髓缺乏，從而導致神經(jīng)元產(chǎn)生病變，誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。我院根據(jù)中醫(yī)理論及多年臨床實踐，以補腎益腦、平抑肝陽、祛風化痰、鎮(zhèn)靜止驚為治制成以石菖蒲、遠志、益智仁、膽南星、陳皮、半夏為主的小兒安神補腦顆粒，對小兒多發(fā)性抽動癥療效良好。

氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導致蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物[4]。氧化應激是由自由基在體內產(chǎn)生的一種負面作用，并被認為是導致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個重要因素[5]。氧化應激情況下，SOD和GSH-Px等抗氧化物酶活性下降，導致眾多的氧自由基得不到及時清除，形成羥自由基，從而加重了氧化反應：羥自由基繼而引發(fā)花生四烯酸的過氧化，生成大量的MDA，引起細胞增殖的下降[6]。本研究中小兒安神補腦顆?？梢赞卓?-OHDA誘導PC12細胞抗氧化酶SOD、GSH-Px活性表達下降，降低MDA的釋放，維持PC12細胞的正常增殖，表明小兒安神補腦顆粒促進細胞增殖的作用可能與其增加抗氧化酶的活性，減少脂質的釋放相關。

越來越多的研究表明氧化應激在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機理和進展中發(fā)揮重要作用。因此，基于抗氧化應激的神經(jīng)保護治療是一種對神經(jīng)系統(tǒng)疾病常見的治療方案[7]。增強抗氧化可以賦予機體保護作用，可以降低神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病危險。其中，上調依賴于ARE信號通路的內源性保護系統(tǒng)是提高機體防御氧化應激的一個重要方法。

Nrf2是一種基本的亮氨酸拉鏈轉錄因子，這種因子可以驅動所涉及的各種基因的轉錄產(chǎn)物(羥基自由基或MDA，蛋白質等)以及氧自由基[8]。因此，轉錄激活Nrf2的細胞可能參與保護應激所致的氧化損傷。此外，Nrf2是HO-1蛋白的和ARE通路激活的重要調節(jié)因子[9]。在正常生理環(huán)境下，Nrf2綁定到Keap1上[10]。當氧化應激時增加時，Nrf2從Keap1處釋放并迅速移位到核，它與ARE結合導致抗氧化基因的轉錄的增加，激活諸如HO-1和NQO-1的抗氧化蛋白[11]。本實驗中小兒安神補腦顆粒對6-OHDA誘導PC12細胞Nrf2、HO-1和NQO-1表達下降的缺陷表現(xiàn)出拮抗作用，表明其作用機制可能與小兒安神補腦顆粒促進Nrf2基因表達，進而提高抗氧化蛋白表達水平，減輕氧化應激損傷有關。

總而言之，我們的研究結果表明小兒安神補腦顆粒對6-OHDA誘導的PC12細胞發(fā)揮抗氧化應激作用與Nrf2-ARE信號通路的激活相關，這可能有助于延伸小兒安神補腦顆粒對氧化應激相關的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的使用。

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廣東省深圳市科技研發(fā)資金(No.JCYJ 20150401163247216)

高厚明，男，副主任中藥師。主要研究方向：中藥鑒定、中藥制劑、中藥炮制等。

廣東省深圳市中醫(yī)院(518033)