林 強，李洪偉，郭開今，周 冰，李東亞

·論 著·

咖啡酸苯乙酯通過Nrf-2 途徑抑制地塞米松誘導的成骨細胞凋亡

林 強1，李洪偉2，郭開今2，周 冰2，李東亞2

目的 探討Nrf-2途徑在咖啡酸苯乙酯(CAPE)抑制地塞米松(DEX)誘導成骨細胞凋亡中的作用。 方法 用細胞貼壁法培養(yǎng)小鼠顱頂前骨細胞(MC3T3-E1)，采用10 μmol/L DEX建立細胞損傷模型，以不同濃度CAPE(0.05、0.25、1 μmol/L)預處理細胞2 h后加入地塞米松共孵育24 h；細胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8)檢測細胞增殖活性；依據(jù)CCK-8檢測結果確定藥物濃度后將實驗分為對照組、咖啡酸苯乙酯組(CAPE組)、地塞米松組(DEX組)，咖啡酸苯乙酯+地塞米松組(CAPE+DEX組)；DCFH-DA熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species， ROS)水平；Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-3酶活性，Western blot法檢測Nrf-2 途徑相關蛋白Nrf-2和血紅素氧合酶1(heme oxygenase，HO-1)蛋白表達水平；流式細胞儀檢測細胞凋亡率。 結果 10 μmol/L DEX作用下細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，損傷作用明顯。與對照組相比，DEX組內(nèi)細胞存活率顯著下降(P<0.01)，而細胞內(nèi) ROS水平、細胞凋亡率及Caspase-3酶活性顯著增加(P<0.01)；同時，Nrf-2途徑相關蛋白 Nrf-2及HO-1表達量減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與DEX組相比，CAPE+DEX組細胞存活率顯著上升(P<0.01)，Nrf-2途徑相關蛋白 Nrf-2及HO-1表達明顯增加(P<0.01)；此外，CAPE+DEX組細胞內(nèi) ROS 水平、細胞凋亡率及Caspase-3酶活顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 結論 咖啡酸苯乙酯可以通過Nrf-2途徑降低細胞內(nèi)ROS水平進而減輕地塞米松誘導的氧化應激所致細胞損傷及凋亡。

咖啡酸苯乙酯；地塞米松；成骨細胞；Nrf-2信號通路；細胞凋亡

糖皮質(zhì)激素在臨床上廣泛應用于抗炎、免疫調(diào)節(jié)等方面的治療。然而長期或大劑量應用糖皮質(zhì)激素帶來的糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid inducedoste oporosis，GIOP)成為治療過程中嚴重的并發(fā)癥之一[1-2]。近來的研究表明氧化應激在GIOP的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，局部的氧化應激可抑制成骨細胞活性并誘導其凋亡，然而其具體機制尚不明確[3-4]?；谝陨涎芯?，如何在發(fā)病早期減少成骨細胞的凋亡、控制局部氧化應激、改善骨細胞內(nèi)部微環(huán)境，從而增強骨組織的修復能力、阻止病情的進一步演變，成為治療激素性骨質(zhì)疏松癥的重要目標?？Х人岜揭阴?caffeic acid phenethyl ester, CAPE)作為蜂膠成分中天然的生物活性成分，具有抗炎癥、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等獨特的生理藥理作用[5]。亦有研究表明咖啡酸苯乙酯能有效調(diào)節(jié)局部組織細胞的氧化應激水平、減少組織損傷[6]。但在地塞米松誘導成骨細胞損傷過程中，咖啡酸苯乙酯是否通過抑制成骨細胞內(nèi)氧化應激而發(fā)揮對其保護作用，仍有待進一步研究。因此，本研究擬通過體外培養(yǎng)小鼠MC3T3-E1型顱頂前骨細胞，觀察咖啡酸苯乙酯對地塞米松作用下成骨細胞凋亡的抑制作用，并探討其作用機制，為咖啡酸苯乙酯應用于GIOP的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 MC3T3-El細胞株(購自中國科學院細胞庫，上海)；咖啡酸苯乙酯(上海紫一試劑廠)；地塞米松(美國Sigma)；α-MEM培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(杭州四季青)；細胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8)(日本同仁)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天)；兔抗小鼠Nrf-2抗體(美國CST)；兔抗小鼠血紅素氧合酶1(heme oxygenase，HO-1)抗體(美國Abcam)；堿性磷酸酶標記的山羊抗兔二抗(中杉金橋公司)；Tubulin-α rabbit Antibody(美國Bioworld)；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(江蘇碧云天)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基)；Caspase-3活性檢測試劑盒(江蘇碧云天)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus)酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo)；流式細胞儀(Beeton-Dickinson)；Western blot電泳儀(Bio-Rad)；熒光顯微鏡(日本Nikon)。

1.2 細胞培養(yǎng) MC3T3-El細胞培養(yǎng)于含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%的CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中孵育。隔日換液，待細胞長滿90%后，再經(jīng)不含EDTA的0.25%胰蛋白酶37 ℃常規(guī)消化，加入3 mL α-MEM培養(yǎng)基，反復吹打成單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞密度，傳代培養(yǎng)。實驗分組及處理：①空白對照組：正常培養(yǎng)，無特殊處理；②咖啡酸苯乙酯組(CAPE組)：細胞長滿約70%左右，置于含CAPE(0.05、0.25、1、4 μmol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；③地塞米松組(DEX組)：細胞長滿約70%左右,置于含10μmol/L DEX培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；④咖啡酸苯乙酯+地塞米松組(CAPE+DEX組)：細胞以CAPE預處理2 h后加入10 μmol/L DEX培養(yǎng)基中共孵育24 h。

1.3 細胞存活率測定 采用細胞增殖/毒性檢測法(CCK-8)[7]。將細胞以5×103個/孔接種于96孔板中培養(yǎng)。按前述分組處理細胞24 h后吸棄上清液，每孔加入含10%CCK-8的培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1.5 h；取含10%CCK-8的培養(yǎng)基100 μL加入沒有細胞含藥物孔作為陰性對照。用酶標儀測定在450 nm的吸光度(OD)值。

存活率(%)= (實驗組OD值-陰性對照組OD值)/

(對照組OD值-陰性對照組OD值)

×100%

1.4 細胞凋亡檢測 采用Annexin V- FITC/ PI 法檢測[8]。取對數(shù)生長期的MC3T3-El細胞，接種于100 mm 培養(yǎng)板中。在含10%FBS的α-MEM 培養(yǎng)基中，按前述分組處理細胞24 h后用不含EDTA胰酶消化后收集細胞，PBS洗滌細胞二次，2000 rpm離心5 min后收集5×105個/mL細胞，加入500 μL的緩沖液懸浮細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL的碘化丙啶(propidium iodide)混勻，室溫、避光4 ℃ 孵育作用15 min后，用FACS Calibur型流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 Caspase-3活性檢測 應用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-3酶活性。參照Liu等[9]實驗方法，細胞以1×106個/孔接種于6孔板培養(yǎng)，按前述分組處理細胞24 h后PBS洗滌細胞二次(離心,2000 r/min，5 min)收集細胞。在收集的沉淀細胞中加入50 μL冷裂解緩沖液(lysis buffer)。冰上裂解30 min，其間渦旋振蕩3～4次，每次10 s，吸取上清用Braford法測定蛋白濃度。吸取50 μL的細胞裂解上清，加入2×反應緩沖液(reaction buffer)，加入50 μL Caspase-3底物并于37 ℃避光孵育4 h。酶標儀在X=405 nm定其吸光值。

1.6 細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平檢測 應用熒光探針二氯二氫熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)檢測細胞內(nèi)ROS水平[10]。取對數(shù)生長期的MC3T3-El細胞，接種于100 mm培養(yǎng)皿中。在含10% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基中，按前述分組處理細胞24 h后。用不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)基洗滌3次后，加入DCFH-DA工作液(100 μM的DCFH- DA)，37 ℃孵育30 min后，用不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)基洗滌3次后，熒光顯微鏡下觀察各組細胞內(nèi)熒光強度并在400倍視野下隨機選擇3個視野進行拍照。Image-Pro-Plus圖像分析軟件分析平均熒光強度。

1.7 Western blot法檢測Nrf-2 途徑相關蛋白 將細胞以1×106個/孔接種于6孔板培養(yǎng)，按前述分組處理細胞24 h后分別提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度，將各組配平成相同濃度后，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，進行孵育抗體，以NBT/BCIP堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色，結果掃描[10]。

2 結 果

2.1 細胞損傷模型的建立 不同濃度DEX(0.01、0.1、1、10 μmol/L)作用24 h后，細胞的存活率分別為(93.468±20.211)%、(90.562±15.301)%、(73.188±17.309)%、(58.361±10.208)%，細胞存活率較對照組下降(6.532±20.886)%、(9.438±17.382)%、(26.813±17.371)%、(41.638±19.708)%。與對照組比較，10 μmol/L DEX處理后的MC3T3-El細胞存活率明顯下降(P<0.01)，見圖1。倒置相差顯微鏡下對照組內(nèi)MC3T3-E1細胞貼壁生長，呈“鋪路石”樣排列，見圖2a；加入10 μmol/L DEX后，貼壁MC3T3-E1細胞減少，細胞回縮、變亮變圓，細胞間連接結構減少，細胞間隙增大，部分細胞結團、脫落，溶解為黑色點狀物，細胞出現(xiàn)不同程度的形態(tài)學損傷，見圖2b。因此，選用10 μmol/L DEX建立細胞損傷模型。

1:對照組；2-5分別為：0.01、0.1、1、10 μmol/L地塞米松濃度 與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 不同濃度地塞米松處理MC3T3-E1細胞24 h后細胞存活率

a:對照組；b：地塞米松組 圖示加入10 μmol/L地塞米松后，細胞出現(xiàn)不同程度的形態(tài)學損傷

圖2 10 μmol/L地塞米松對MC3T3-El細胞形態(tài)的影響(×100)

2.2 CCK-8檢測結果 不同濃度CAPE(0.05、0.25、1、4 μmol/L)作用24 h后，細胞的存活率分別為(91.715±8.399)%、(91.757±6.445)%、(88.273±8.420)%、(76.248±6.420)%，較對照組下降(8.328±10.527)%、(8.286±9.740)%、(11.770±8.420)%、(23.794±8.022)%。CAPE濃度在0～1 μmol/L對MC3T3-E1細胞增殖無明顯影響(P>0.05)，見圖3。因此，應用不同濃度的CAPE(0、0.05、0.25、1 μmol/L)預處理細胞2 h后與10 μmol/L DEX共同作用24 h后，細胞存活率分別為(30.985±4.775)%、(56.816±7.047)%、(67.068±3.702)%、(62.600±4.909)%，細胞存活率較DEX組分別增加(25.831±11.664)%、(36.083±4.170)%、(31.615±7.560)%。0.25 μmol/L CAPE細胞存活率較DEX組顯著增加(P<0.01)，且1 μmol/L濃度CAPE對于損傷后細胞存活率無進一步改善作用，因此后續(xù)實驗選用CAPE的濃度為0.25 μmol/L，見圖4。

1：對照組；2-5分別為：0.05、0.25、1、4 μmol/L咖啡酸苯乙酯濃度 與對照組比較，*P<0.01

圖3 不同濃度咖啡酸苯乙酯處理MC3T3-E1細胞24 h后細胞存活率

1：對照組；2：DEX組(10 μmol/L DEX);3-5分別為:0.05、0.25、1 μmol/L CAPE處理2 h后與10 μmol/L DEX作用組 與對照組比較，#P<0.01；與DEX組比較,*P<0.01

圖4 不同濃度CAPE處理對DEX(10 μmol/L)作用下細胞存活率的影響

2.3 流式細胞儀檢測結果 Annexin V和PI染色結果顯示，與對照組相比，DEX組(10 μmol/L)細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，而CAPE+DEX組較DEX組細胞凋亡率顯著下降(P<0.01)。見圖5、圖6。

2.4 不同處理組MC3T3-E1細胞內(nèi)ROS水平 10 μmol/L DEX作用24 h后，在熒光顯微鏡下觀察DEX組細胞內(nèi)ROS平均熒光強度較對照組顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；加入0.25 μmol/L CAPE預處理細胞2 h后與DEX共同孵育24 h，熒光顯微鏡下觀察到細胞內(nèi)ROS平均熒光強度較DEX組顯著減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖7。

圖5 0.25 μmol/L CAPE對10 μmol/L DEX誘導MC3T3-E1細胞凋亡的影響

與對照組比較，*P<0.01；與DEX組比較，#P<0.01

圖6 各組MC3T3-E1細胞凋亡率

2.5 不同處理組MC3T3-E1細胞中相關蛋白表達 CAPE組與對照組的Nrf-2、HO-1表達未見明顯差異，加入10 μmol/L DEX后Nrf-2、HO-1表達明顯減少(P<0.01)；0.25 μmol/L CAPE預處理2 h后與DEX共同孵育24 h，Nrf-2及HO-1蛋白表達量較DEX組增加(P<0.01)，見圖8。

2.6 不同處理組MC3T3-E1細胞內(nèi)Caspase-3酶活性 DEX作用24 h后Caspase-3酶活性顯著增強，加入0.25 μmol/L CAPE預處理2 h后與DEX共同孵育24 h，Caspase-3酶活性較DEX組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖9。

a：熒光顯微鏡下各組MC3T3-E1細胞中ROS熒光強度(熒光顯微鏡 ×400)；b：與對照組比較，*P<0.01；與DEX組比較，#P<0.01圖7 各組MC3T3-E1細胞內(nèi)ROS水平

a:Western blot 檢測；b：Nrf-2及HO-1蛋白的相對表達量與對照組比較，*P<0.01；與DEX組比較，#P<0.01圖8 各組MC3T3-E1細胞中Nrf-2及HO-1表達(Western blot)

與對照組比較，*P<0.01；與DEX組比較，#P<0.01

圖9 各組MC3T3-E1細胞中Caspase-3酶活力

3 討 論

近年來，隨著對GIOP研究的深入，細胞凋亡、氧化應激、骨膠原代謝異常等均在其中發(fā)揮著一定的作用，但尚無完整理論來闡述這一過程[11]。目前的觀點認為糖皮質(zhì)激素的直接作用在發(fā)病初始發(fā)揮著關鍵作用。大量研究表明糖皮質(zhì)激素不僅抑制骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞方向分化，還可誘導成骨細胞凋亡引起骨修復功能障礙、骨強度下降，最終致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[12]。在本實驗研究中CCK-8結果顯示MC3T3-E1細胞活性隨著DEX濃度增加而降低且呈濃度依賴性；此外，流式細胞凋亡檢測結果顯示在10 μmol/L DEX培養(yǎng)24 h后,與對照組相比細胞凋亡率顯著增加。

Caspase家族作為細胞凋亡過程中的參與者與介導者，發(fā)揮著重要的作用，其中又以Caspase-3最為重要，在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能[13]。正常情況下，Caspase-3以無活性的酶原形式存在于胞質(zhì)中，在凋亡的早期階段被活化為由兩個大亞基(17 kD)和兩個小亞基(12 kD)組成的復合物，其中17 kD的活化片段被認為是凋亡程序的執(zhí)行蛋白，裂解相應的底物，最終導致細胞凋亡，因此，活化的Caspase-3片段被認為是凋亡發(fā)生的標志[14]。本實驗中MC3T3-E1細胞在加入地塞米松后Caspase-3酶活性增加且細胞凋亡率升高，表明地塞米松可以通過激活Caspase-3啟動其介導的細胞凋亡過程從而促進成骨細胞凋亡。應用CAPE后，DEX上調(diào)的MC3T3-E1細胞凋亡率及Caspase-3活性顯著下降，表明CAPE可減輕地塞米松誘導的MC3T3-E1細胞損傷及細胞凋亡。

ROS是生物體內(nèi)有氧代謝產(chǎn)生的含氧自由基，主要包括超氧陰離子(O2-)、羥基(OH-)和過氧化氫(H2O2)等[15]。正常情況下，ROS有助于維持機體的正常生理功能，然而過量的ROS可作為第2信使，促進線粒體Ca2+內(nèi)流、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開放、Caspase的激活，導致細胞凋亡。此外，異常增多的ROS能夠通過促進脂質(zhì)過氧化、減少抗氧化物酶、促進成骨細胞凋亡等途徑加速骨量丟失[16-17]。本實驗研究在進行細胞損傷指標檢測過程中發(fā)現(xiàn)：在加入10 μmol/L DEX作用MC3T3-E1細胞24 h后，細胞內(nèi)氧化型二氯熒光素(DCF)的熒光強度顯著增強，細胞內(nèi)ROS水平升高；在此過程中，細胞凋亡率顯著升高；然而，在加入CAPE后，上述指標呈現(xiàn)回降現(xiàn)象，可見CAPE通過降低細胞內(nèi)ROS蓄積，減輕細胞氧化應激損傷，從而減輕地塞米松誘導的細胞凋亡。

目前認為Nrf-2是調(diào)控細胞外源性刺激因子和氧化損傷的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，在參與細胞抗氧化應激和外源性有毒物質(zhì)誘導的主要防御機制中發(fā)揮重要的作用[18-19]。靜息狀態(tài)下，Nrf-2在胞漿中處于一種非活性狀態(tài)，當處于應激狀態(tài)時，Nrf-2轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，與基因中的抗氧化反應元件結合，啟動下游Ⅱ相代謝酶基因的表達和轉(zhuǎn)錄，以增加細胞對氧化應激的抵抗作用，使細胞免于凋亡[20]。在被Nrf2激活的眾多的抗氧化酶中，HO-1具有較好的抗氧化能力、抑制細胞凋亡的作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)在治療激素誘導的MC3T3-E1細胞凋亡過程中，沉默Nrf-2基因后抗氧化基因表達明顯降低，而氧化應激損傷明顯增強，提示Nrf-2通路在調(diào)節(jié)激素誘導的成骨細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)紊亂中發(fā)揮重要作用。本研究結果表明DEX顯著降低細胞內(nèi)Nrf-2和HO-1蛋白表達水平；而應用CAPE后，細胞內(nèi)Nrf-2和HO-1蛋白表達量均增加。本實驗結果進一步表明CAPE可激活細胞內(nèi)Nrf-2途徑并增加Ⅱ相代謝酶基因的表達，增強細胞抗氧化能力。

綜上所述，咖啡酸苯乙酯通過增強MC3T3-E1細胞內(nèi)Nrf-2途徑內(nèi)抗氧化蛋白的表達水平，清除細胞內(nèi)異常增多的ROS，從而遏制了Caspase-3介導的細胞凋亡通路的啟動，減輕地塞米松誘導的細胞損傷及凋亡。同時，為咖啡酸苯乙酯進一步應用于激素性骨質(zhì)疏松癥的防治提供實驗依據(jù)和理論基礎。

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(本文編輯:葉華珍； 英文編輯：王建東)

Caffeic acid phenethyl ester inhibits the apoptosis induced by dexamethasone via the regulation of Nrf-2 pathway in osteoblasts

LIN Qiang1, LI Hong-wei2,GUO Kai-jin2,ZHOU Bing2, LI Dong-ya2

(1.GraduateSchool,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,Jiangsu,China; 2.DepartmentofOrthopedics,theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221002,Jiangsu,China)

Objective To explore the effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on the apoptosis of MC3T3-E1 preosteoblasts induced by dexamethasone (DEX). Methods MC3T3-E1 cells were exposed to DEX (10 μmol/L) to establish a model of osteoblast injury. The incubated MC3T3-E1 cells were pretreated with various concentrations of CAPE for 2 hours, and then cultured in combination with 10 μmol/L DEX for 24 hours. Cell proliferation was evaluated by cell count kit (CCK-8). The final concentration of drug was determined by the results of CCK-8, then cells randomly divided into four groups: Control group, CAPE group, DEX group, and CAPE+DEX group. Cell apoptosis rate was detected by Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry in each group. Caspase-3 activity was monitored by Caspase-3 activity assay kit; Intracelluar ROS was detected by DCFH-DA fluorescence staining．The expressions of Nrf-2 and HO-1 were examined by Western blot. Results Dexamethasone could induced MC3T3-E1 cell injury with overt morphological and cell activity changes at 24 hours, especially the 10 μmol/L DEX. Compared with control group, and the cell activi- ty was decreased significantly (P<0.01), while the level of intracellular ROS, cell apoptosis rate and Caspase-3 activity increased significantly (P<0.01). Moreover, the Nrf-2 and HO-1 was decreased significantly (P<0.01). Compare with DEX group, expression of Nrf-2 and HO-1 (P<0.01vsDEX group) in CAPE+DEX group were significantly increased (P<0.01). In addition, the levels of ROS, apoptosis and Caspase-3 activity were significantly lower in the CAPE+DEX group (P<0.01). Conclusion CAPE inhibits the level of ROS in osteoblasts via regulating Nrf-2 pathway, resulting in the reduction of apoptosis induced by dexamethasone.

Caffeic acid phenethyl ester; Dexamethasone; Osteoblast cell; Nrf-2 pathway; Apoptosis

徐州市科學技術局項目(KCl4SHl02)

1.221004徐州，徐州醫(yī)科大學研究生學院； 2. 221002徐州，徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨科

李洪偉，E-mail：lihongwei2000@126.com

林 強，李洪偉，郭開今，等.咖啡酸苯乙酯通過Nrf-2 途徑抑制地塞米松誘導的成骨細胞凋亡[J].東南國防醫(yī)藥，2017,19(2):126-131.

R681

A

1672-271X(2017)02-0126-06

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.02.004

2016-11-05;

2017-02-15)