吳迪，冀永東

蓯蓉提取物高效液相指紋圖譜研究

吳迪，*冀永東

（內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特010010）

以松果菊苷為參照物，利用高效液相色譜，對(duì)蓯蓉提取物進(jìn)行指紋圖譜分析。色譜條件為色譜柱Phenomenex Luna C18型（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相1%乙酸-乙腈，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm。該方法精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均良好，共分離出12個(gè)共有色譜峰，相似度為0.993～0.999，可以作為蓯蓉提取物品質(zhì)控制手段。

蓯蓉提取物；質(zhì)控；高效液相色譜法；指紋圖譜

0 引言

一直以來，香精料液生產(chǎn)及應(yīng)用企業(yè)均將其生產(chǎn)工藝、配方、應(yīng)用參數(shù)等視為核心技術(shù)，因而關(guān)于香精、料液品質(zhì)的綜合控制就顯得尤為重要。基于此，如何有效鑒別香精真?zhèn)渭捌鋬?nèi)在品質(zhì)，控制香精、料液品質(zhì)穩(wěn)定性一直是生產(chǎn)、應(yīng)用企業(yè)高度關(guān)注的問題。目前，大多數(shù)香精質(zhì)控采取的都是通過監(jiān)控相對(duì)密度、折光指數(shù)等一些理化指標(biāo)，再結(jié)合質(zhì)檢人員的感官經(jīng)驗(yàn)（人工嗅香）。這種方法只是國(guó)家為滿足香精質(zhì)控下限而出臺(tái)的通用方法，受個(gè)人感官認(rèn)知影響較大，不能從化學(xué)組成的角度對(duì)香精的差異進(jìn)行全面解釋，難以對(duì)香精的內(nèi)在品質(zhì)進(jìn)行科學(xué)有效的評(píng)價(jià)控制[1]。

蓯蓉提取液成分復(fù)雜，這樣就造成通用質(zhì)控方法適用性降低的問題[2]，有必要借助現(xiàn)代分析儀器、分析化學(xué)等研究成果和技術(shù)手段，實(shí)現(xiàn)輔助甚至提升質(zhì)控水平的要求。

指紋圖譜作為一種較為全面、先進(jìn)的質(zhì)控方法，對(duì)復(fù)雜成分的樣品質(zhì)控具有較強(qiáng)的適用性和可操作性，可以通過一個(gè)完整的、雖然“模糊”但卻“專屬”的色譜得到多層次的整體品質(zhì)信息[3-4]。

試驗(yàn)以蓯蓉提取物指紋圖譜的建立為著手點(diǎn)，加強(qiáng)對(duì)蓯蓉提取物的質(zhì)量監(jiān)督水平。

1 材料儀器與試劑

1.1 材料

試驗(yàn)共收集樣品17個(gè)，滿足指紋圖譜樣品數(shù)量大于10個(gè)的要求。

1.2 儀器與試劑

Waters 2695型高效液相色譜儀，配2998二極管陣列檢測(cè)器；實(shí)驗(yàn)室用中藥粉碎機(jī)；振蕩儀（振蕩頻率能夠達(dá)到100次/min）；活塞式移液槍：1 000，5 000 μL；容量瓶：1 000，100，50，10 mL；注射器：5 mL；0.22 μm有機(jī)相濾膜。

蒸餾水，符合GB/T 6682中一級(jí)水的要求；乙腈，色譜純；醋酸，分析純；松果菊苷為實(shí)驗(yàn)室自制，HPLC檢出純度均大于99%。

國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004 A版”軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

色譜柱PhenomenexLuna C18型（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL；波長(zhǎng)334 nm；流動(dòng)相1%乙酸（A）-乙腈（B）；流速0.8 mL/min；梯度洗脫。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備

稱取松果菊苷對(duì)照品10 mg（精確至0.01），置于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，精密吸取該溶液1 mL，移入10 mL量瓶中，加甲醇稀釋制成0.1 mg/mL的溶液，即得。分析過程中以其保留時(shí)間和峰面積響應(yīng)為“1”，計(jì)算其他各共有峰的相對(duì)值。

2.3 供試樣品的制備

準(zhǔn)確移取4 mL蓯蓉提取物于50 mL容量瓶中，流動(dòng)相初始比例溶劑（1%醋酸水溶液∶乙腈=92∶8）定容，振蕩10 min使分散均勻，靜置10 min，液體經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液待HPLC分析。2.4測(cè)定方法

各供試品溶液按2.1中所述色譜條件進(jìn)行分離測(cè)定，記錄色譜信息。以松果菊苷參照峰為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密性試驗(yàn)

取同一提取物樣品，嚴(yán)格按照2.3中的步驟制備供試樣品，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值，考察儀器精密度。測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值分別為0.13%～0.77%和0.48%～2.95%，均小于3%，表明該方法精密度良好。

蓯蓉提取物指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（精密性）見表2。

表2 蓯蓉提取物指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（精密性）

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品樣品，分別在0，6，12，24，48 h檢測(cè)，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值，考察試樣溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，所有共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值均小于3%，樣品在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定，表明供試品溶液在48 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

蓯蓉提取物指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（穩(wěn)定性）見表3。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品5份，按要求制備供試品溶液，分別進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值分別為0.05%～0.56%和0.27%～2.28%，均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

蓯蓉提取物指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（重復(fù)性）見表4。

2.6 指紋圖譜分析及評(píng)價(jià)

2.6.1 不同批次蓯蓉提取物指紋圖譜及蓯蓉提取物共有模式指紋圖譜的建立

隨機(jī)選取13批次的蓯蓉提取物，進(jìn)行唯一性標(biāo)識(shí)（S1～S13），按照2.3中制備供試樣品，利用高效液相色譜儀，按照2.1中所示色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，記錄13批樣品指紋圖譜。將全部13個(gè)蓯蓉提取液HPLC數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004（A版）”軟件，生成蓯蓉提取液對(duì)照?qǐng)D譜R，共標(biāo)記出共有峰12個(gè)，7號(hào)松果菊苷為參照峰。

表3 蓯蓉提取物指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（穩(wěn)定性）

表4 蓯蓉提取物指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（重復(fù)性）

蓯蓉提取物HPLC指紋圖譜見圖1。

圖1 蓯蓉提取物HPLC指紋圖譜

2.6.2 蓯蓉提取液相似度評(píng)價(jià)

以2.6.1中生成的對(duì)照?qǐng)D譜R為標(biāo)準(zhǔn)，利用軟件對(duì)13個(gè)批次的樣品進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。

蓯蓉提取物指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表5。

表5 蓯蓉提取物指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

在此制備方法和儀器條件下，13批蓯蓉提取液的指紋圖譜相似度均大于0.99，說明批次間相似度良好，對(duì)照?qǐng)D譜確定合理，且非共有峰面積百分比小于總峰面積的10%，符合國(guó)家藥典委員會(huì)對(duì)指紋圖譜研究的通用要求。

2.7 蓯蓉提取物樣品濃度差異的評(píng)價(jià)

取同一供試樣品，分別稀釋1.0，0.8，0.6倍，按照2.1中色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，記錄指紋圖譜并利用軟件評(píng)價(jià)相似度。結(jié)果顯示，當(dāng)提取液稀釋至0.8，0.6倍時(shí)，相似度雖有下降但仍大于0.95，松果菊苷響應(yīng)值會(huì)隨著稀釋度等比例下降。

樣品稀釋對(duì)松果菊苷響應(yīng)值及相似度的影響見表6，未稀釋樣品松果菊苷響應(yīng)值見表7。

表6 樣品稀釋對(duì)松果菊苷響應(yīng)值及相似度的影響

表7 未稀釋樣品松果菊苷響應(yīng)值

隨機(jī)選取7個(gè)不同批次蓯蓉提取物進(jìn)行測(cè)定，積分結(jié)果顯示，未經(jīng)稀釋的5個(gè)樣品松果菊苷響應(yīng)值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%。這一結(jié)果一方面證明了提取物各組分比例關(guān)系穩(wěn)定，同時(shí)也說明研究者需要通過對(duì)參照物的相對(duì)定量來補(bǔ)充相似度評(píng)價(jià)的不足。

3 討論

（1）苯乙醇苷類化合物是肉蓯蓉屬藥材的中藥特征成分，其中又以松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量較高，通常關(guān)于蓯蓉屬藥材的指紋圖譜研究，選取這2種物質(zhì)作為參照物。但不同于純中藥材研究，提取液作為中草藥下游產(chǎn)物，除了受中藥原材料品質(zhì)波動(dòng)影響，提取工藝以及浸提溶劑對(duì)其成分的影響也很大，這方面應(yīng)予以注意。不能照搬中草藥研究經(jīng)驗(yàn)，應(yīng)根據(jù)檢測(cè)實(shí)際情況確定參考物質(zhì)，若2種物質(zhì)質(zhì)量濃度較低，可以人為補(bǔ)償，甚至嘗試其他內(nèi)標(biāo)。試驗(yàn)在方法開發(fā)中重點(diǎn)考慮了松果菊苷，發(fā)現(xiàn)提取液中松果菊苷含量穩(wěn)定，故將其作為參照物。

（2）通常情況，提取液成分受中草藥原料影響較大，但肉蓯蓉屬中藥材種類較多，包括管花肉蓯蓉、草蓯蓉、鹽生肉蓯蓉等諸多品類[5-7]，這里未做研究，只從蓯蓉提取液采購及應(yīng)用的角度建立現(xiàn)實(shí)可行的質(zhì)控方法。

（3）色譜條件的選擇。①色譜柱。結(jié)合蓯蓉提取液樣品實(shí)際情況，結(jié)合《中國(guó)藥典》和文獻(xiàn)經(jīng)驗(yàn)，考查了150 mm和250 mm這2種不同長(zhǎng)度的C18反相色譜柱，二者表征出的色譜峰在峰形、分離度等方面均滿足指紋圖譜檢測(cè)要求。按照液相色譜方法開發(fā)經(jīng)驗(yàn)和慣例，當(dāng)2個(gè)色譜柱均滿足檢測(cè)要求時(shí)，考慮柱效及出峰速率，選擇較短的150 mm色譜柱，有效采集時(shí)間65 min。②檢測(cè)波長(zhǎng)。通過驗(yàn)證，記錄比較了254，310，330，334，345 nm等5個(gè)不同波長(zhǎng)條件下的色譜圖，結(jié)果顯示330 nm與334 nm處，各峰貢獻(xiàn)率適度，較完整地體現(xiàn)了供試樣品化學(xué)成分的全面信息，符合指紋圖譜的目標(biāo)要求。波長(zhǎng)為334 nm時(shí)前端極性物質(zhì)的分離狀況略好，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm。

（4）供試樣品制備。在開發(fā)蓯蓉提取液檢測(cè)方法環(huán)節(jié)，由于最合適檢測(cè)濃度尚未確定，在利用蓯蓉提取液制備供試樣品時(shí)，通過利用初始比例流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行逐級(jí)稀釋（由低到高），然后進(jìn)樣檢測(cè)，可以避免出現(xiàn)樣品質(zhì)量濃度過高引起進(jìn)樣殘留等問題，同時(shí)弱化溶劑差異產(chǎn)生的干擾。

4 結(jié)論

通過對(duì)隨機(jī)抽取的13批蓯蓉提取液樣品指紋圖譜檢測(cè)與分析，各色譜峰分離良好，前段（1～20 min）、中間段（20～40 min）、末端（40～60 min）均出現(xiàn)明顯且峰形極好的物質(zhì)峰，各峰貢獻(xiàn)率適度，較完整地體現(xiàn)了供試樣品化學(xué)成分的全面信息，符合指紋圖譜的目標(biāo)要求。不同批次的蓯蓉提取液內(nèi)在品質(zhì)存在差異，相似度存在波動(dòng)。試驗(yàn)共確定了12個(gè)共有色譜峰，且各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值均小于3%，相似度大于0.99，方法穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性均良好。

結(jié)果表明，結(jié)合對(duì)松果菊苷響應(yīng)值的穩(wěn)定性，該方法可應(yīng)用于蓯蓉提取液品質(zhì)評(píng)價(jià)，測(cè)定簡(jiǎn)便快捷，效果良好。

[1]曾曉鷹，者為，王明鋒，等.卷煙調(diào)香體系構(gòu)建——以云煙品牌為例[M].成都：西南交通大學(xué)出版社，2013：57-63.

[2]張南平，肖新月，張萍，等.建立中藥“對(duì)照指紋圖譜”的可行性探討[J].中國(guó)藥事，2003，17（6）：347-350.

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[4]張麗芳，薛飛群.中藥指紋圖譜的檢測(cè)方法[J].廣東藥學(xué)，2004，14（6）：10-12.

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[7]Jiang Y，Li S P，Wang Y T.Differentiation of Herba cistanches by fingerprint with high-performance liquid chromatograghy diode array detection mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，2009（11）：2 156-2 162.◇

Study on HPLC Fingerprint of Liquid Material Extracted from Cistanche

WU Di，*JI Yongdong
（Inner Mongolia Kunming Cigarette Limited Liability Company，Huhhot，Inner Mongolia 010010，China）

Echinacoside is used as a reference，the liquid material extracted from Cistanche is analyzed with HPLC fingerprint. The chromatographic conditions are as follows：Phenomenex Luna C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）is used；the mobile phase is composed of acetonitrile and 1%acetic acid；the gradient elution is used at a flow rate of 0.8 mL/min and the UV absoibance detection is set at 334 nm.This method shows high precision，good repeatability and stability，12 comnlon peaks are found in the HPLC fingerprint and the similarities are between 0.993～0.999.The research can be used as a quality control method for liquid material extracted from Cistanche.

liquid material extracted from Cistanche；quality control；HPLC；fingerprint

R284

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.040

1671-9646（2017）03b-0047-04

2017-03-15

吳迪（1973—），女，碩士，工程師，研究方向?yàn)橘|(zhì)量管理、卷煙配方及煙草化學(xué)分析。*

冀永東（1984—），男，碩士，工程師，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)、分析化學(xué)及色譜技術(shù)。