溫睿

酶法制備大豆肽的工藝研究

溫睿

（牡丹江大學(xué)生物制藥與食品工程學(xué)院，黑龍江牡丹江157011）

研究酶法制備大豆肽，堿性蛋白酶優(yōu)勢(shì)最大。通過單因素試驗(yàn)，分析研究了酶法水解擠壓膨化全脂豆粉提取大豆肽的最佳工藝范圍為加酶量1.5%～2.0%，酶解溫度50～65℃，酶解時(shí)間3～5 h，料液比1∶5～1∶8，pH值8.5～10.5，為響應(yīng)面分析研究提供了數(shù)據(jù)依據(jù)。

酶法制備；大豆肽；工藝研究

在植物性原料中，大豆蛋白質(zhì)含量較高。肽是蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物。大豆肽與大豆蛋白相比，其必需氨基酸組成與世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出理想蛋白質(zhì)氨基酸組成模式相近[1]。大豆的某些低分子肽類不僅能提供人體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)，更易被人體消化吸收，又具有改善機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降膽固醇和促進(jìn)脂肪代謝的特殊生理功能[2]。此外，大豆肽還具有加熱不凝固、流動(dòng)性好、易溶于水、良好的吸濕性和保濕性等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)主要研究酶解條件下制備大豆肽。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

市售大豆，硼酸、硫酸鉀、硫酸銅、三氯乙酸、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、無水碳酸鈉，以及NaOH，HCl，H2SO4，Alcalase堿性蛋白酶。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、低速離心機(jī)、微電腦電磁爐、電子分析天平、遠(yuǎn)紅外分析儀、雙螺桿擠壓桿，以及JJ-1型增力電動(dòng)攪拌器、PHS-3C型酸度計(jì)、20型孔消化爐、KDN-04型蛋白質(zhì)測定儀、722型分光光度計(jì)、快速混合器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解工藝

大豆擠壓膨化→粉碎→配制溶液→調(diào)溫度→調(diào)pH值→加入蛋白酶→離心→取上清液。

準(zhǔn)確稱取擠壓膨化后再粉碎的全脂豆粉50 g，加入適量水配制成一定濃度的溶液，置于恒溫水浴鍋中開始攪拌，調(diào)節(jié)溫度至反應(yīng)溫度、pH值至反應(yīng)值，加入一定比例蛋白酶，在反應(yīng)溫度下進(jìn)行恒溫酶解。酶解過程中需要不斷進(jìn)行攪拌，同時(shí)通過滴加1 mol/L的NaOH溶液以保持反應(yīng)體系pH值恒定，反應(yīng)偏差一般控制在±0.1。達(dá)到反應(yīng)預(yù)定時(shí)間后，取出酶解液進(jìn)行離心，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心20 min。離心后，小心傾倒頂層漂浮油脂，收集中層清液，然后利用10%三氯乙酸調(diào)節(jié)其pH值至大豆蛋白等電點(diǎn)（pH值4.3），之后將酶解液水浴10 min，使酶活力喪失，再用低溫離心機(jī)以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心20 min，除去底層沉淀物，即未水解大豆蛋白和其他非溶性物質(zhì)，傾倒出上清液，記錄上清液總體積后裝入塑料小瓶中，置于4℃冷藏保存。取部分上清液測蛋白質(zhì)含量，利用公式（2）計(jì)算TCA-NSI值；記錄NaOH溶液的滴加量，利用公式（1）pH-stat法計(jì)算水解度。

1.2.2 水解度（DH）的測定

運(yùn)用pH-stat法：水解度（DH）以水解斷裂的肽鍵數(shù)目（H）占總肽鍵數(shù)目（Htot）的百分?jǐn)?shù)來確定，即DH=H/Htot×100%。水解度DH與水解過程中耗堿量成正比，可用耗堿量來表征水解度的大小，記錄下不同時(shí)間的耗堿量可得酶解進(jìn)程曲線。計(jì)算公式如下：

式中：VNaOH——消耗堿液的體積，mL；

NNaOH——消耗堿液的摩爾濃度，mol/L；

α——α-氨基解離度，1/α=1+10（pH-pK），其中pK值為α-氨基的平均pK值，pH值為反應(yīng)起始的pH值；

Mp——底物蛋白質(zhì)的總質(zhì)量，g；

Htot——單位質(zhì)量蛋白中的肽鍵總和（mmol/g），對(duì)于某一特定的蛋白質(zhì)來講Htot是一個(gè)常數(shù)，大豆蛋白Htot=7.75 mmol/g。

1.2.3 肽得率的計(jì)算公式

取酶解上清液，加入等量的10%三氯乙酸（TCA）溶液，混合振蕩30min，離心分離20min（4500r/min），測上清液可溶性氮，計(jì)算氮溶指數(shù)，也是肽得率。

式中：TCA-NSI——三氯乙酸可溶性氮得率，%；

N1——在10%TCA中可溶性氮含量，mg；

N2——樣品中總的氮含量，mg。

1.2.4 水解酶的選擇

酶解反應(yīng)的特點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和，然而我國的大豆蛋白酶解技術(shù)目前還不成熟，處于起步階段，與國外的差距較大。目前，大豆方面的研究多使用動(dòng)物蛋白酶，但其副反應(yīng)多，效果很一般；植物蛋白酶使用較少，由于其成本高、周期長，越來越多的研究傾向于使用微生物蛋白酶。

試驗(yàn)研究風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、Alcalase堿性蛋白酶[3]5種酶對(duì)大豆蛋白的酶解效果，比較篩選它們的酶活性，并以水解一定程度的水解度描述各酶的大豆蛋白水解能力，從而得出高效、合理、安全的酶種類，這樣使之后的酶解工藝和優(yōu)化工藝更加完善。

1.2.5 Alcalase堿性蛋白酶

試驗(yàn)以酶解溫度、底物濃度、pH值、加酶量、酶解時(shí)間為考察因素，以水解度（DH）為指標(biāo)，確定Alcalase堿性蛋白酶水解擠壓膨化后全脂豆粉的最適水解條件。

（1）酶與底物比，即加酶量對(duì)水解度和肽得率的影響。取6只四頸瓶，分別精確稱取50 g擠壓膨化后的全脂豆粉，用250 mL水將其溶解，料液比1∶5，酶解溫度55℃，pH值9.0，按照E/S為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%添加量分別加入Alcalase堿性蛋白酶，開始水解4 h，直至反應(yīng)結(jié)束。測定水解度及肽得率，確定堿性蛋白酶水解大豆的合理加酶量。

（2）酶解溫度對(duì)水解度和肽得率的影響。取5只四頸瓶，分別精確稱取50 g全脂豆粉，用250 mL水將其溶解，料液比1∶6，將酶解溫度分別控制在45，50，55，60，65℃水平下，調(diào)節(jié)pH值至9.0，按照E/S為2.0%添加量加入Alcalase堿性蛋白酶，開始水解4 h，直至反應(yīng)結(jié)束。測定水解度及肽得率，確定堿性蛋白酶水解大豆的合理酶解溫度。

（3）酶解時(shí)間對(duì)水解度和肽得率的影響。取6只四頸瓶，分別精確稱取50 g全脂豆粉，用250 mL水將其溶解，料液比1∶6，酶解溫度55℃，pH值9.0，按照E/S為2.0%添加量加入Alcalase堿性蛋白酶，分別水解1，2，3，4，5，6 h，直至反應(yīng)結(jié)束。測定水解度及肽得率，確定堿性蛋白酶水解大豆的合理酶解時(shí)間。

（4）料液比對(duì)水解度和肽得率的影響。取5只四頸瓶，分別精確稱取50 g全脂豆粉，分別將料液比控制在1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8水平下加入不同體積的水，酶解溫度55℃，pH值9.0，按照E/S為2.0%添加量加入Alcalase堿性蛋白酶，進(jìn)行水解4 h，直至反應(yīng)結(jié)束。測定水解度及肽得率，確定堿性蛋白酶水解大豆的合理料液比。

（5）pH值對(duì)水解度和肽得率的影響。取5只四頸瓶，分別精確稱取50 g全脂豆粉，用250 mL水將其溶解，料液比1∶6，酶解溫度55℃，分別將pH值控制在8.0，8.5，9.0，9.5，10.0水平下，按照E/S為2.0%添加量加入Alcalase堿性蛋白酶，開始水解4 h，直至反應(yīng)結(jié)束。測定水解度及肽得率，確定堿性蛋白酶水解大豆的合理pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解酶的選擇

試驗(yàn)研究了5種酶制劑，即中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶活力，以及水解大豆蛋白的能力。

蛋白酶水解的最適pH值和酶解溫度見表1，不同酶的種類對(duì)短肽得率的影響見圖1。

由圖1可看出，堿性蛋白酶優(yōu)勢(shì)最大，所以試驗(yàn)選擇堿性蛋白酶。

2.2 Alcalase堿性蛋白酶水解條件的確定

以水解度和肽得率為指標(biāo)，研究5種因素各自對(duì)水解效果的影響規(guī)律，同時(shí)確定了響應(yīng)面的因素水平范圍。

表1 蛋白酶水解的最適pH值和酶解溫度

圖1 不同酶的種類對(duì)短肽得率的影響

加酶量對(duì)水解度和肽得率的影響見圖2。

圖2 加酶量對(duì)水解度和肽得率的影響

由圖2可看出，當(dāng)加酶量大于1.5%時(shí)，隨著加酶量的增大，水解度和肽得率明顯增加，在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中加酶量水平選擇1.5%～2.0%。

酶解溫度對(duì)水解度和肽得率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)水解度和肽得率的影響

由圖3可看出，酶解溫度在55℃附近時(shí)，水解度和肽得率都有較大值出現(xiàn)?？紤]到交互作用，所以在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，酶解溫度選擇50～65℃。

酶解時(shí)間對(duì)水解度和肽得率的影響見圖4。

由圖4可看出，酶解時(shí)間大于2 h，肽得率明顯增加；但當(dāng)酶解時(shí)間大于5 h，水解度和肽得率均有明顯下降。所以，在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中酶解時(shí)間選擇3～5 h。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解度和肽得率的影響

料液比對(duì)水解度和肽得率的影響見圖5。

圖5 料液比對(duì)水解度和肽得率的影響

由圖5可看出，料液比大于1∶4，短肽得率明顯增加；但當(dāng)料液比大于1∶8，短肽得率呈下降趨勢(shì)。所以，在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中料液比選擇1∶5～1∶8。

pH值對(duì)水解度和肽得率的影響見圖6。

圖6 pH值對(duì)水解度和肽得率的影響

由圖6可看出，pH值在8.5～10.0時(shí)，水解度和肽得率都有較大值出現(xiàn)，所以在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中pH值選擇8.5～10.5。

3 結(jié)論

試驗(yàn)研究酶法制備大豆肽，堿性蛋白酶優(yōu)勢(shì)最大，選擇堿性蛋白酶。通過單因素試驗(yàn)，分析研究了酶法水解擠壓膨化全脂豆粉提取大豆肽的最佳工藝范圍為加酶量1.5%～2.0%，酶解溫度50～65℃，酶解時(shí)間3～5 h，料液比1∶5～1∶8，pH值8.5～10.5。

此研究，為響應(yīng)面分析研究提供了數(shù)據(jù)依據(jù)。參考文獻(xiàn)：

[1]潘進(jìn)權(quán)，劉耕.大豆多肽研究概況[J].中國調(diào)味品，2003（2）：6-10.

[2]陶紅麗，朱志偉，江津津.大豆多肽生理活性研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2007，23（6）：133-136.

[3]楊曉泉，陳中，黃紀(jì)昆.Alcalase蛋白酶降解大豆胰蛋白酶抑制劑的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27（1）：18-22.◇

Study on Preparation of Soybean Peptide by Enzymatic Methed

WEN Rui
（Biological Pharmacy and Food Engineering of Institute，Mudanjiang University，Mudanjiang，Heilongjiang 157011，China）

In this study，soybean peptides are prepared by enzyme method，and alkaline protease is the best.The optimum range through single factor analysis of extruded full fat soybean meal by enzyme hydrolysis extraction of soybean peptide：enzyme concentration 1.5%～2.0%，temperature 50～65℃，hydrolysis time 3～5 h，ratio of material to water 1∶5～1∶8，pH 8.5～10.5.This study provides the data basis for response surface analysis.

enzymatic preparation；soybean peptide；technology research

TQ936.16

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.033

1671-9646（2017）03b-0023-03

2017-01-23

溫睿（1979—），女，碩士，副教授，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。