常亞南，劉浩，馮成寶，何曉亮，周曉輝

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人工軟骨支架中TGF-β1緩釋殼聚糖微球?qū)TDC-5細胞生長的促進作用

常亞南1，劉浩2，馮成寶1，何曉亮1，周曉輝1

1 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050000 2 河北科技大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院，河北石家莊 050000

為了提高本課題組前期構(gòu)建的Ⅱ型膠原蛋白-透明質(zhì)酸-硫酸軟骨素的人工三維軟骨支架對軟骨細胞生長的促進作用，采用乳化交聯(lián)法以殼聚糖為原料，加入細胞轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1，并通過真空冷凍干燥技術(shù)制備了包裹TGF-β1的殼聚糖微球。然后分別將其與空白殼聚糖微球整合進軟骨支架中，并接種小鼠軟骨細胞ATDC-5，通過觀察細胞生長狀態(tài)來評價緩釋微球在人工軟骨支架中對軟骨細胞生長是否具有促進作用。結(jié)果顯示所制得的殼聚糖微球球體表面光滑，分散均勻，直徑在100 nm左右，吸水率良好可達983.73%±4.38%，抗酶解作用較強，第28天時降解率僅達到51.0%±1.8%。由TGF-β1累積釋放曲線可知TGF-β1在開始的24 h內(nèi)釋放最快，之后逐漸減慢，在120 h之后進入平臺期，具有緩釋效果。MTT試驗以及熒光染色試驗充分表明，由Ⅱ型膠原蛋白、透明質(zhì)酸以及硫酸軟骨素構(gòu)建的三維軟骨支架適合ATDC-5細胞的生長增殖，并且殼聚糖微球?qū)GF-β1的緩釋能夠顯著促進細胞的生長。

組織工程，軟骨支架，殼聚糖微球，轉(zhuǎn)化生長因子，小鼠軟骨細胞

關(guān)節(jié)軟骨的損傷和病變是臨床骨科的常見疾病。由于軟骨組織自身修復(fù)能力有限，一旦發(fā)生損傷病變，必須進行修復(fù)或置換，如何有效地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷始終是醫(yī)學(xué)界尚待解決的難題之一[1]。近年來快速發(fā)展的組織工程技術(shù)為關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)治療提供了新思路和新方法，研究者們紛紛把目光聚集到構(gòu)建人工軟骨支架的研究中[2]。

轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)是由一類結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的多肽生長因子亞族組成的大家族[3]。其中TGF-β1是一個多功能蛋白，調(diào)節(jié)細胞的多種功能，比如細胞的增殖、分化以及細胞外基質(zhì)的代謝并可以抑制軟骨形成過程中軟骨細胞的終末分化[4]。有關(guān)細胞因子對成骨細胞的作用研究表明，單獨將細胞因子植入體內(nèi)并不能顯著地促進骨的生成，這是因為細胞因子易被體液稀釋、降解等，因此需要有合適的緩釋體系才能有效地發(fā)揮細胞因子的 作用[5–6]。

本課題組已經(jīng)初步構(gòu)建了Ⅱ型膠原蛋白-透明質(zhì)酸-硫酸軟骨素的人工三維軟骨支架[7]。為了進一步提高該支架的生物學(xué)性能，本研究利用生物相容性好、無細胞毒副作用的殼聚糖作為載體材料[8–10]來制備緩釋微球，用于包裹TGF-β1，然后將空白殼聚糖微球和包裹有TGF-β1的殼聚糖微球分別整合進軟骨支架中，接種小鼠軟骨細胞ATDC-5，通過觀察細胞生長狀態(tài)來分析緩釋微球在人工軟骨支架中對軟骨細胞生長是否具有促進作用。旨在探索性能良好的人工軟骨支架，為將來臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

TGF-β1 (Peprotech)，殼聚糖 (Solarbio)，溶菌酶 (北京科百奧生物科技有限公司)，ELISA試劑盒 (聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，DMEM : F12細胞培養(yǎng)基 (Gibco)，胎牛血清 (Hyclone)，谷氨酰胺 (Solarbio)，Hoechest 33342 (Sigma)， FITC (Sigma)，Span 80 (Solarbio)，胰蛋白酶(Solarbio)，DMSO (MP)；小鼠軟骨細胞ATDC-5，購自南京科佰生物科技有限公司。

真空冷凍干燥機 (Gene)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，掃描電子顯微鏡 (Hitachi)，倒置熒光顯微鏡 (Olympus)。

1.2 殼聚糖緩釋微球的制備

將2.5 mL殼聚糖溶液和20 μL TGF-β1溶液加入到5% Tween80液體石蠟混合液中，磁力攪拌器高速攪拌2 h至溶液均一。然后緩慢滴加濃度為5%、pH 2.5的三聚磷酸鈉溶液6.25 mL，高速攪拌2 h至溶液成為均一的乳濁液。高速冷凍離心機4 ℃、12 000×g條件下離心15 min，小心棄掉上層溶液，所得微球沉淀用異丙醇洗2次，每次均使用高速冷凍離心機在4 ℃、12 000 ×條件下離心15 min，再用雙蒸水洗4次，每次均按上述條件離心，沉淀置于–20 ℃冷凍，最后使用真空冷凍干燥機凍干后置于–20 ℃保存。

1.3 殼聚糖緩釋微球參數(shù)測定

1.3.1 掃描電子顯微鏡觀察微球形貌

冷凍干燥后的微球粉末進行上機噴金，然后進行掃描電子顯微鏡檢測，加速電壓為3 kV。

1.3.2 吸水率測定

稱量20 mg左右殼聚糖微球分別置于4個EP管中，分別稱重。每管加入1 mL PBS溶液，將其置于培養(yǎng)箱中，37 ℃、130 r/min條件下振蕩，分別在0.5、1.0、1.5、2.0 h時間段取出，3 000 r/min離心后棄上清并棄去表面殘留的水分后再次稱重。試驗前質(zhì)量記為1，試驗后質(zhì)量記為2。按以下公式計算吸水率。

吸水率(%)=(2–1)/1×100%

式中，1為吸水前殼聚糖微球的質(zhì)量 (g)；2為吸水后殼聚糖微球的質(zhì)量 (g)。

1.3.3 降解率測定

分別準確稱取20 mg殼聚糖微球，置于6個EP管中，分別稱重。加入含溶菌酶107U/L的磷酸緩沖液 (PBS) 溶液，于培養(yǎng)箱中37 ℃、130 r/min條件下氣浴振蕩，分別在1、3、7、14、21、28 d取出，10 000 r/min離心5 min，棄上清后用雙蒸水漂洗沉淀2遍，–20 ℃冷凍，然后一起冷凍干燥，分別稱重。試驗前質(zhì)量記為m，試驗后質(zhì)量記為4。按以下公式計算降解率。

降解率(%)=(3–4)/3×100%

式中，3為降解前殼聚糖微球的質(zhì)量 (g)；m為降解后殼聚糖微球的質(zhì)量 (g)。

1.3.4 TGF-β1累積釋放曲線測定

分別稱取10 mg TGF-β1殼聚糖微球于1.5 mL EP管中，加入1 mL PBS，37 ℃條件下135 r/min振蕩，分別于2 h、4 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d取出后，10 000 r/min離心5 min。取出150 μL樣品，–20 ℃保存?zhèn)溆?，并補加150 μL PBS溶液繼續(xù)試驗。7 d后采用ELISA試劑盒 (Human TGF-β1 Sunny Elisa) 測定吸光值，記為1。同時另取10 mg TGF-β1殼聚糖微球溶于 2 mL 2%乙酸溶液中，制成待測樣本，測定吸光值，記為2，并計算10 mg微球中包裹的生長因子總量。試驗重復(fù)進行3次。

以釋放時間為橫坐標，/為縱坐標測定繪制累積釋放率曲線、繪制標準曲線，并按照下面公式分別計算包封率和載藥量。

載藥量=溶液中藥物含量/微球質(zhì)量

包封率(%)=載藥量×微球總量/總投藥量×100%

1.4 三維復(fù)合軟骨支架的制備

稱取TGF-β1殼聚糖微球1 mg，將其分散在100 μL的90%乙醇中，然后加入到已構(gòu)建的三維軟骨支架中，–80 ℃冷凍后利用真空冷凍干燥機凍干，–20 ℃保存?zhèn)溆?，以上為試驗組，對照組將不含有TGF-β1的殼聚糖微球按照同樣的方法進行試驗。

1.5 細胞在三維復(fù)合軟骨支架上的培養(yǎng)

采用24孔板來培養(yǎng)細胞，實驗組在孔中加入含有TGF-β1的三維復(fù)合軟骨支架，對照組中加入不含有TGF-β1的三維復(fù)合軟骨支架。取生長狀態(tài)良好的細胞ATDC-5，消化后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至2.5×104/mL，按照2.5×104/孔的密度接種到放有三維復(fù)合軟骨支架的孔板中培養(yǎng)。

1.6 MTT法檢測細胞活力

小心棄去孔中的培養(yǎng)基，實驗組和對照組均加入200 μL不含血清的新鮮培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液20 μL，于CO2培養(yǎng)箱中避光條件下37 ℃培養(yǎng)4 h。然后每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，在490 nm條件下測定吸光值。分別在3、5、7、14 d利用MTT法檢測細胞活力。試驗平行進行3次，記錄數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 熒光染色法觀察細胞生長狀態(tài)

小心棄去孔中的培養(yǎng)基，加入1 mL濃度為0.01 mol/L的PBS溶液洗支架，棄去PBS溶液，再加入990 μL濃度為0.01 mol/L的PBS溶液和10 μL濃度為5 mg/mL的FITC溶液，小心混勻。置于CO2培養(yǎng)箱中避光條件下37 ℃染色15 min。FITC染色結(jié)束后，用濃度為0.01 mol/L的PBS溶液洗支架2–3次，每次3–5 min。然后加入990 μL濃度為0.01 mol/L的PBS溶液和10 μL濃度為 1 mg/mL的Hoechst 33342溶液，小心混勻。置于CO2培養(yǎng)箱中避光條件下37 ℃染色20 min，染色結(jié)束后，使用濃度為0.01 mol/L的PBS溶液洗支架2–3次，每次3–5 min。分別在第3、5、7、14天進行染色試驗，并用倒置熒光顯微鏡觀察支架中的細胞，拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描電子顯微鏡觀察微球形貌

通過真空冷凍干燥機凍干的殼聚糖微球為淡黃色粉末狀，粒度極細。由圖1可以看出，所制備的微球外觀為球狀，球體表面光滑，分散較好，大小均勻，直徑在100 nm左右。

2.2 殼聚糖緩釋微球的吸水率

經(jīng)實驗測定，殼聚糖緩釋微球在0.5、1.0、1.5、2.0 h所對應(yīng)的吸水率分別為301.21%±2.35%、976.32%±9.41%、977.67%±7.51%、983.73%±4.38%。

圖1 殼聚糖微球掃描電子顯微鏡圖

可以看出，在0.5 h的時候殼聚糖微球的吸水率約為自身重量的3倍，在1.0 h時達到平衡，約為自身重量的9.8倍，吸水率較高，具有很好的吸水膨脹性能，能夠增強殼聚糖微球的緩釋效果。

2.3 殼聚糖緩釋微球的降解率

經(jīng)實驗測定，殼聚糖緩釋微球在1、3、7、14、21、28 d的降解率分別為4.5%±0.6%、7.0%±0.8%、11.0%±1.6%、19.5%±1.6%、32.0%±1.5%、51.0%± 1.8%，如圖2所示。隨著溶菌酶對殼聚糖微球作用時間的延長，殼聚糖微球逐漸被降解，并且降解速率在增加，降解速率的變化可能是因為隨著酶解時間的延長，殼聚糖微球的表面逐漸被酶解，逐漸破壞其乳化交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐漸暴露，溶菌酶對殼聚糖的降解作用更容易發(fā)揮。但第28天時降解率僅達到51.0%±1.8%，表明所制得的殼聚糖微球就有較強的抗酶解能力。

2.4 TGF-β1累積釋放曲線、包封率和載藥量

對包裹有TGF-β1殼聚糖微球緩慢釋放TGF-β1體系連續(xù)監(jiān)測7 d，利用ELISA試劑盒檢測并繪制體外累積釋放曲線，如圖3所示，在最初的24 h內(nèi)TGF-β1的釋放率最大，24–120 h釋放量還在增加，但速率較最初的24 h減慢，在120 h之后，曲線平緩，表明釋放進入平臺期，保持穩(wěn)定。7 d的累積釋放率為57.57%±1.32%。結(jié)合累積釋放曲線通過公式計算得殼聚糖微球載藥量為 (25.6±0.23) μg/g，包封率為80.21%±0.02%。

2.5 MTT法檢測ATDC-5細胞活力

對實驗組和對照組的細胞定期利用MTT法檢測細胞活力，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析如圖4所示。整體來看，試驗組細胞的活力均高于對照組細胞的活力。第3天時，實驗組和對照組之間的細胞活力相差較小，這是因為剛開始培養(yǎng)時，細胞數(shù)目均相對較少，且吸收TGF-β1后有一個短暫的適應(yīng)期，在第3天開始表現(xiàn)出差異。隨培養(yǎng)時間的延長，細胞緊貼三維復(fù)合軟骨支架生長，數(shù)目逐漸增加，且TGF-β1的釋放量趨于穩(wěn)定，對照組和實驗組之間細胞活力的差異逐漸表現(xiàn)出來，并且越來越顯著，在細胞培養(yǎng)2周時，差異極其顯著(<0.01)。以上結(jié)果充分說明，由Ⅱ型膠原蛋白、透明質(zhì)酸以及硫酸軟骨素構(gòu)建的三維軟骨支架適合ATDC-5細胞的生長增殖，并且殼聚糖微球?qū)GF-β1的緩釋能夠顯著促進細胞的生長。

2.6 熒光染色法觀察細胞生長狀態(tài)

將對照組和實驗組的細胞定期進行熒光染色后利用倒置熒光顯微鏡拍照，如圖5所示，其量化結(jié)果見表1。支架通過熒光照射呈現(xiàn)綠色，細胞通過熒光照射呈現(xiàn)藍色，可以清楚看出支架為三維立體狀，細胞均勻吸附在三維立體支架中，生長狀態(tài)良好。圖5中分別記錄了培養(yǎng)3、5、7、14 d細胞的生長過程。接種細胞后3 d時，對照組和試驗組細胞均較少，這是因為剛開始培養(yǎng)時，細胞數(shù)目均相對較少且需經(jīng)過一個短暫的適應(yīng)期，并且在試驗初期TGF-β1的釋放量較小。但是可以看出試驗組細胞數(shù)目多于對照組，隨培養(yǎng)時間的延長，細胞生長速率增加，細胞在三維支架中均勻分散，且由于TGF-β1對細胞生長的促進作用，試驗組細胞數(shù)目較對照組細胞數(shù)目多，差異隨培養(yǎng)時間的延長越來越明顯。在培養(yǎng)14 d時，支架中細胞數(shù)目更多，細胞均勻分散在支架中，密度很大，且試驗組尤其明顯。充分說明由Ⅱ型膠原蛋白、透明質(zhì)酸以及硫酸軟骨素構(gòu)建的三維軟骨支架適合ATDC-5細胞的生長增殖，并且殼聚糖微球?qū)GF-β1的緩釋能夠顯著促進細胞的生長。

圖5 支架上培養(yǎng)的軟骨細胞ATDC-5熒光染色圖 (×400)

表1 ATDC-5熒光染色細胞數(shù)目統(tǒng)計表

3 討論

目前，國內(nèi)外對關(guān)節(jié)軟骨損傷和缺損修復(fù)的研究主要集中在以下幾個方面：關(guān)節(jié)鏡清創(chuàng)術(shù)[11]、軟骨細胞移植[12]、組織工程化軟骨[13–15]和凝膠類關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)材料[16–18]。其中，組織工程化關(guān)節(jié)軟骨被認為是最有應(yīng)用前景的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)材料。因此，組織工程化軟骨中新型支架材料的開發(fā)成為一個熱點研究方向。應(yīng)用在組織工程的支架材料主要有膠原蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、殼聚糖和羥基磷灰石等。許多學(xué)者紛紛致力于新型軟骨支架的開發(fā)研究[19–23]。

本課題組前期實驗構(gòu)建了Ⅱ型膠原蛋白-透明質(zhì)酸-硫酸軟骨素的三維人工軟骨支架，孔徑為 (83.33±7.20) μm，孔隙率為86.63%±0.67%。研究人員普遍認為組織工程軟骨支架的孔徑應(yīng)為 (60–200) μm，孔隙率應(yīng)在70%–90%[24–26]。因此，自制軟骨支架符合上述條件，有利于支架內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，對于支架內(nèi)細胞的生長代謝以及軟骨修復(fù)都有著重要意義。

本實驗通過制備包裹生長因子TGF-β1具有緩釋作用的殼聚糖微球，并將其整合到軟骨支架上用以培養(yǎng)小鼠軟骨細胞ATDC-5。MTT試驗以及熒光染色試驗結(jié)果充分證明該三維軟骨支架適合ATDC-5細胞的生長增殖，并且殼聚糖微球?qū)GF-β1的緩釋能夠顯著促進細胞的生長，隨培養(yǎng)時間的延長，試驗組細胞生長速率顯著高于對照組，且在三維支架中分散均勻，培養(yǎng)14 d時，細胞密度增殖最大，較對照組高出近3倍。這為將來人工軟骨支架更好地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了參考依據(jù)。至于該自制人工軟骨支架在動物體內(nèi)的生物相容性及慢性毒性等評價待進一步研究。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

ATDC-5 growth promoted by sustained-releasing chitosan microspheres loading TGF-β1 in artificial cartilage scaffolds

Ya’nan Chang1, Hao Liu2, Chengbao Feng1, Xiaoliang He1, and Xiaohui Zhou1

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In order to promote the growth of chondrocyte ATDC-5 in collagen type II-hyaluronic acid-chondroitin sulfate composite scaffolds constructed previously, the sustained-releasing chitosan microspheres loading TGF-β1 were prepared by emulsification and cross-linking. In addition, ATDC-5 was inoculated into the scaffolds incorporating the chitosan microspheres with TGF-β1. Results show that the morphology of microsphere was round and uniform, mean diameter was about 100 nm, absorption rate was up to 983.7%±4.38%.When the microsphere was incubated under the condition of 107U/L lysozyme, the degradation rate was only 51.0%±1.8% on day 28. Moreover, to compare the effect of TGF-β1, the growth of ATDC-5 in different scaffolds was observed by MTT assay and fluorescence staining test. According to the cumulative release curve, TGF-β1 was released quickly at initial 24 h, then gradually decelerated, finally reached the plateau after 120 h. MTT assay and fluorescence staining test demonstrated that the scaffolds were suitable for ATDC-5 growth and proliferation, as well as, suggested that the sustained-releasing chitosan microspheres loading TGF-β1 could significantly promote the growth of ATDC-5.

tissue engineering, cartilage scaffolds, chitosan microsphere, transforming growth factor, mouse chondrocyte

Supported by:"100 Talent Program" of Hebei Province (No. E2012100005), Scientific Research Staring Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, Ministry of Education of China, Natural Science Foundation of Hebei Province (No. C2012208019).

河北省“百人計劃”項目(No. E2012100005)，教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金，河北省自然科學(xué)基金 (No. C2012208019) 資助。

September 26, 2016; Accepted: January 17, 2017

Xiaohui Zhou. Tel/Fax: +86-311-81668487; E-mail: zhouxh2003@aliyun.com