李偉娜，尚子方，段志廣，李林波，賀婧，范代娣

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畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)Ⅲ型類人膠原蛋白及其胃粘膜修復(fù)功能

李偉娜1,2，尚子方1,2，段志廣1,2，李林波1,2，賀婧1,2，范代娣1,2

1 西北大學(xué)化工學(xué)院陜西省可降解生物醫(yī)用材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710069 2 西北大學(xué)化工學(xué)院陜西省生物材料與發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，陜西西安 710069

為提高重組畢赤酵母發(fā)酵重組人Ⅲ型膠原蛋白產(chǎn)量，采用響應(yīng)面對(duì)其生長(zhǎng)階段的BMGY培養(yǎng)基(Buffered minimal glycerol-complex medium) 組成進(jìn)行優(yōu)化。通過Placket-Burman試驗(yàn)，得出酵母提取物、蛋白胨、甘油對(duì)膠原蛋白產(chǎn)量有顯著影響，通過Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)以及Design-Expert分析軟件建立了以膠原蛋白產(chǎn)量為響應(yīng)值的響應(yīng)方程，得到最適濃度分別為酵母提取物1.13%，蛋白胨1.61%，甘油0.86%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在最優(yōu)BMGY培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)12 h后，所得到畢赤酵母干重為4.41 g/L，生長(zhǎng)階段的菌重量增加了26%。在22 L發(fā)酵罐中通過高密度發(fā)酵，產(chǎn)量達(dá)到4.71 g/L。該重組膠原蛋白對(duì)大鼠乙酸灼傷胃粘膜有明顯修復(fù)作用，為生物醫(yī)用材料的應(yīng)用制備奠定了基礎(chǔ)。

畢赤酵母，重組人Ⅲ型膠原蛋，響應(yīng)面優(yōu)化法，胃粘膜

膠原蛋白是結(jié)締組織中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)、維護(hù)生物組織和器官的正常生理功能和損傷修復(fù)都有著重要作用[1-2]。因良好的生物相容性、生物可吸收性和促新細(xì)胞形成等特征，廣泛應(yīng)用于包括生物醫(yī)用材料、化妝品、食品工業(yè)、醫(yī)藥和印染等領(lǐng)域[3]。相比酸、堿水解法或酶解法從動(dòng)物的皮和骨組織中提取并純化過程中易帶來病毒隱患、生物功效和臨床療效不穩(wěn)定等問題，利用基因工程技術(shù)重組表達(dá)膠原蛋白成為研究熱點(diǎn)和研究方向[4-5]。

嗜甲醇酵母菌主要應(yīng)用于基因工程蛋白的表達(dá)[4,6]。相比哺乳動(dòng)物細(xì)胞，具有真核蛋白質(zhì)合成途徑的不要求復(fù)雜的生長(zhǎng)培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，在基因水平上比較容易操縱[7]。一般可以通過培養(yǎng)基的優(yōu)化設(shè)計(jì)、發(fā)酵過程關(guān)鍵參數(shù)的調(diào)控以及甲醇誘導(dǎo)等發(fā)酵控制策略實(shí)現(xiàn)的高密度發(fā)酵[8]。Placket-Burman (PB) 設(shè)計(jì)是一種高效篩選重要影響因素的統(tǒng)計(jì)方法[9]，近年來應(yīng)用廣泛的響應(yīng)面分析方法 (RSM) 可預(yù)測(cè)響應(yīng)值以及研究因素間交互作用，并且已成功應(yīng)用于多例發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化中[10-11]。

消化性潰瘍是消化系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，一般認(rèn)為主要與胃粘膜的攻擊因子和防御因子之間的失衡有關(guān)，以胃粘膜防御能力的減弱為主。服用抗酸性藥物如西咪替丁、沙漠替丁等可緩解，但易引起多種并發(fā)癥[12]。結(jié)合類人膠原蛋白具有的良好生物學(xué)相容性、細(xì)胞黏附性、促新細(xì)胞形成和止血功能，推測(cè)膠原蛋白對(duì)于粘膜治愈方面能夠發(fā)揮很大的優(yōu)勢(shì)[10-14]。

重組膠原蛋白發(fā)酵屬于分段式發(fā)酵，與產(chǎn)物生成緊密相關(guān)的誘導(dǎo)階段發(fā)酵已經(jīng)經(jīng)過優(yōu)化[15]，因此本研究對(duì)菌體生長(zhǎng)階段所需具有緩沖能力的甘油混合培養(yǎng)基 (BMGY培養(yǎng)基參數(shù)，包括酵母提取物、蛋白胨、甘油、硫酸銨、酵母氮堿和生物素等) 進(jìn)行優(yōu)化。首先通過PB設(shè)計(jì)確定對(duì)膠原蛋白產(chǎn)量影響的重要參數(shù)并以RSM進(jìn)行優(yōu)化，然后在22 L生物工程(Bioengineering) 發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵。最后，以造模成功率最高 (接近100%)、穩(wěn)定性良好的大鼠乙酸性胃黏膜損傷模型研究類人膠原蛋白對(duì)乙酸性胃潰瘍的修復(fù)作用，探究重組人Ⅲ型膠原蛋白對(duì)胃潰瘍治療的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa公司。巴氏畢赤酵母GS115宿主菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)載體穿梭質(zhì)粒pPIC9k購(gòu)自Invitrogen 公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠20只，體重100?120 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 儀器

瑞士Bioengineering 22 L發(fā)酵罐，發(fā)酵在線控制器，空氣壓縮機(jī)；純氧瓶；高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀有限公司；電子分析天平：瑞士Mettler 公司；蛋白電泳儀：美國(guó)BioRad公司；酶標(biāo)儀Power Wave XS2：美國(guó)Gene公司；分光光度計(jì)Model 2082PCS：美國(guó)UNICO；真空冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種和培養(yǎng)基

選擇本實(shí)驗(yàn)室自構(gòu)建的重組GS115為實(shí)驗(yàn)菌種，表達(dá)載體為pPIC9k。AOX1基因的啟動(dòng)子受甲醇強(qiáng)烈誘導(dǎo)，使其能夠利用甲醇作為唯一碳源快速生長(zhǎng)并表達(dá)分泌性人Ⅲ型膠原蛋白[16]。GS115中重組人Ⅲ型膠原蛋白載體的構(gòu)建和蛋白的表達(dá)方法參考文獻(xiàn)[16]。

1.3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)條件

生長(zhǎng)階段的細(xì)胞在YPD (酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%) 中培養(yǎng)，30 ℃、24 h。在25 mL BMGY緩沖培養(yǎng)基 (酵母提取物1%，蛋白胨2%，0.1 mol/L pH 6.0磷酸鉀緩沖液，酵母氮堿1.34%，生物素4×10–5%，甘油1%) 中操作，220 r/min、18 h后，室溫1 500?3 000×離心5 min，收集菌體細(xì)胞。輕輕倒出上清液，將底部菌體重懸至600為1.0，然后在BMMY (buffered methanol- complex medium) 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)[15]，培養(yǎng)基成分為發(fā)酵培養(yǎng)基成分：酵母提取物1.19%、蛋白胨2.1%、甲醇1.18%、酵母氮堿0.3%、硫酸銨0.77%和生物素4.5×10–5%。

1.3.3 分析方法

分光光度計(jì)通過濁度測(cè)定600的細(xì)胞密度。用BandScan 5.0軟件分析膠原蛋白SDS-PAGE條帶所占比例，然后乘以其對(duì)應(yīng)的總蛋白含量，計(jì)算出相應(yīng)膠原蛋白含量。

1.3.4 過程參數(shù)優(yōu)化

通過PB設(shè)計(jì)確定重要參數(shù)。篩選發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)畢赤酵母細(xì)胞生長(zhǎng)量有顯著影響的濃度參數(shù)：酵母提取物、蛋白胨、甘油、酵母氮堿、硫酸銨和生物素。對(duì)每個(gè)因素分別選取高、低水平，以膠原蛋白產(chǎn)量作為響應(yīng)值，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。用Design-Expert 8 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA)軟件對(duì)各因素效應(yīng)分別進(jìn)行檢驗(yàn)，根據(jù)因素置信度高低，選取顯著因素作進(jìn)一步考察。

表1 因素水平PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)果及各因素效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析

Note:2=95.33%;2(adj)=89.72%;aNon-significant at<0.05;bSignificant positive effect;cSignificant negative effect.

響應(yīng)面法分析。重要參數(shù)確定后采用快速爬坡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素分別設(shè)計(jì)因素水平中心點(diǎn)和最低、最高水平，細(xì)胞干重為響應(yīng)值。因素與編碼水平如表2所示，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及輸入變量預(yù)測(cè)二次方程。運(yùn)用Design-Expert 8軟件響應(yīng)面分析程序?qū)?7組試驗(yàn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，經(jīng)過回歸方程擬合，根據(jù)回歸方程的方差分析及模型可信度分析，以驗(yàn)證模型的有效性。

1.3.5 畢赤酵母高密度發(fā)酵

在22 L發(fā)酵罐中對(duì)畢赤酵母進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，罐壓0.1 Mpa，溶氧維持在20%以上。當(dāng)600為20左右時(shí)，發(fā)酵罐中接種2 L BMGY種子培養(yǎng)基。甘油間歇補(bǔ)料，開始補(bǔ)甘油 (含12 mL/L PTM1微量元素的50%甘油)，補(bǔ)料速度為每L初始發(fā)酵體積18 mL/h，溫度和pH分別維持在28.5 ℃和5；流加甘油階段，攪拌速度逐漸增加到900 r/min；培養(yǎng)液溶氧水平突然增加，表明培養(yǎng)基中的甘油消耗完全。以含12 mL/L PTM1微量元素溶液的純甲醇啟動(dòng)誘導(dǎo)，采取60 s控制階段以維持30%左右的溶解氧水平。誘導(dǎo)維持約78 h，定時(shí)收集樣品以檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞生長(zhǎng) (600)和蛋白濃度。

表2 BBD試驗(yàn)因素編碼水平、試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Note:1=(1?1.2)/0.1;2=(2?1.5)/0.2;3= (3?0.8)/0.1.

1.3.6 蛋白的分離純化

收集酵母發(fā)酵液，4 ℃、8 000 ×離心20 min，收集上清。乙醇沉淀，溶解、過濾、硫酸銨分級(jí)沉淀，收集沉淀蛋白并用磷酸緩沖液 (PBS) 溶解。經(jīng)超濾樣品用CM瓊脂F(xiàn)ast Flow柱層析，上樣，用0.01 mol/L PBS (pH 6.0) 平衡柱子，然后用0?1.0 mol/L的氯化鈉溶液梯度洗脫，收集蛋白峰。層析后的樣品負(fù)載于Sephadex G-100脫鹽，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，收集目的蛋白[17]。

1.3.7 類人膠原蛋白修復(fù)大鼠的乙酸性胃潰瘍

將20只雄性大鼠分2組，每組10只，分籠喂養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)室條件下正常喂養(yǎng)2 d，使其能夠更好地適應(yīng)環(huán)境；胃潰瘍模型建立前24 h禁食不禁水。如圖1所示，大鼠腹腔注射麻醉藥麻醉后，仰臥固定，上腹部皮膚正中切口，切開腹腔找到胃，于胃體與幽門部分界處血管最少的區(qū)域內(nèi)，用微量注射器在胃竇前壁注入50 μL 20%乙酸溶液達(dá)胃壁肌層與漿膜層之間，將大網(wǎng)膜組織與注射部位的漿膜組織縫合一針，關(guān)閉腹腔，縫合，術(shù)后單籠飼養(yǎng)，模型建立完成。模型建立后第3天開始，每日灌胃給藥1次 (模型組為生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組為類人膠原蛋白)，灌胃量0.8 mL/200 g，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 d后脫臼處死。打開大鼠腹壁并結(jié)扎賁門、幽門，向胃內(nèi)注入1%甲醛溶液10 mL，然后將胃浸泡于10%甲醛溶液中固定15 min。沿胃大彎剪開胃壁，生理鹽水沖洗。

圖1 大鼠胃粘膜修復(fù)實(shí)驗(yàn)建模過程中大鼠仰臥固定 (A)，切開大鼠腹壁在腹腔找到胃 (B)

2 結(jié)果與分析

2.1 PB設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選參數(shù)

復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)成分為微生物生長(zhǎng)和生產(chǎn)次級(jí)代謝物所必需，營(yíng)養(yǎng)原料是控制該菌體生長(zhǎng)合成的關(guān)鍵[18]。從發(fā)酵培養(yǎng)基參數(shù)：酵母提取物、蛋白胨、甘油、酵母氮堿、硫酸銨和生物素中篩選出對(duì)膠原蛋白產(chǎn)量有顯著影響的濃度參數(shù)，通過PB設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)這6個(gè)因素進(jìn)行12組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。PB設(shè)計(jì)得到的細(xì)胞干重變化范圍在2.42–3.33 g/L之間。通過檢驗(yàn)篩選有顯著影響的變量。<0.05說明該因素對(duì)響應(yīng)有顯著影響。如表1所示，為0.002的蛋白胨確定為最重要影響因素，其次為酵母提取物(0.003) 和甘油(0.004)。因此，選取這3個(gè)因素作為顯著因素用于后續(xù)優(yōu)化研究。

2.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

采用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)法，進(jìn)一步研究關(guān)鍵因素，對(duì)篩選的3因素取3個(gè)水平，Box-Behnken設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2，預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值接近，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞干重最低、最高值分別為1.75 g/L，4.83 g/L。對(duì)細(xì)胞干重進(jìn)行二次回歸擬合，得到對(duì)蛋白胨(1)、酵母提取物(2) 和甘油(3) 帶交互項(xiàng)和平方項(xiàng)的三元二次方程：

DCW= 4.43 – 0.0771+ 0.0592+ 0.923– 0.331–0.602–1.133–0.5812–0.2613– 0.04423。

上述擬合模型的2=95.87%，調(diào)整后的2= 89.67%，這表明該擬合模型只有約10.33%的變量無法被其解釋，說明該模型擬合性良好?；貧w方程的方差分析結(jié)果見表3，可以看出，該擬合模型的失擬項(xiàng)=0.051>0.05，表明模型失擬不顯著，另外=0.000，失擬值=0.945也說明回歸顯著，曲面效應(yīng)顯著。

表3 用于細(xì)胞干重優(yōu)化的擬合多項(xiàng)式回歸方程的方差分析

2.3 響應(yīng)曲面分析

3D響應(yīng)面和2D等高線圖是回歸方程的圖形表示[19]，如圖2A、B、C所示，通過響應(yīng)面及等高線圖，更直觀地判斷各兩兩因素對(duì)因變量 (細(xì)胞生長(zhǎng)量) 的影響，優(yōu)化濃度范圍。

圖2A為甘油濃度取中間水平時(shí)，酵母提取物與蛋白胨對(duì)畢赤酵母菌體生長(zhǎng)量的影響。等高線圖相對(duì)橢圓的輪廓可知，在整個(gè)酵母提取物濃度范圍內(nèi)，隨蛋白胨含量的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)量不斷提高，但是蛋白胨濃度高于1.5% (零水平) 時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)量隨蛋白胨濃度的增加而逐漸降低。和Plackett-Burman的結(jié)果相符合，蛋白胨在酵母提取物和蛋白胨對(duì)畢赤酵母菌體生長(zhǎng)量的影響中占主要地位。

圖2B為當(dāng)?shù)鞍纂藶榱闼綍r(shí)，在整個(gè)酵母濃度范圍內(nèi)，甘油低于0水平 (濃度0.7%–0.8%) 時(shí)，畢赤酵母菌體產(chǎn)量的增加隨著二者含量的增加而不斷提高；而甘油濃度高于零水平 (0.8%–0.9%) 時(shí)，其生長(zhǎng)量隨甘油含量的增加而逐漸降低。因此，甘油在蛋白胨和甘油對(duì)畢赤酵母菌體生長(zhǎng)量的影響中占主要地位。

圖2 酵母提取物與蛋白胨 (A)、酵母提取物與甘油 (B)、蛋白胨與甘油 (C) 交互影響膠原蛋白產(chǎn)量的響應(yīng)面和等高線圖

圖2C為以酵母提取物濃度取中間水平時(shí)，在整個(gè)蛋白胨濃度范圍內(nèi)，畢赤酵母菌體生長(zhǎng)量隨著甘油和蛋白胨濃度的增加而提高，而當(dāng)甘油濃度高于零水平 (0.8%–0.9%) 時(shí)，其生長(zhǎng)量隨甘油含量的增加而逐漸降低。由此可見，甘油在蛋白胨和甘油對(duì)畢赤酵母菌體生長(zhǎng)量的影響中占主要地位。

2.4 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)回歸方程中的各個(gè)變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，求得1、2、3對(duì)應(yīng)真實(shí)值分別為酵母提取物1.13%，蛋白胨1.61%，甘油0.86%，再將真實(shí)值代入方程式中，算出細(xì)胞干重最優(yōu)值為4.44 g/L。

重新活化菌種，經(jīng)種子液培養(yǎng)，然后接種到BMGY培養(yǎng)液中，保持其他條件相同，經(jīng)過12 h BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲菌體進(jìn)行測(cè)定，所得畢赤酵母干重平均值為4.41 g/L。相對(duì)于之前未優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)的畢赤酵母干重值3.50 g/L，高出26%。因此該響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果可靠，達(dá)到了較好的優(yōu)化效果。

2.5 高密度發(fā)酵工藝

表達(dá)系統(tǒng)成本低、表達(dá)量高、能對(duì)外源基因進(jìn)行正確翻譯和修飾等優(yōu)勢(shì)；近來在發(fā)酵罐培養(yǎng)重組蛋白表達(dá)方面的優(yōu)勢(shì)日益顯現(xiàn)[20-21]。

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化工藝控制參數(shù)，菌體生長(zhǎng)曲線和目的蛋白表達(dá)曲線如圖3所示。已知經(jīng)BMMY發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化，誘導(dǎo)期表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組人Ⅲ型膠原蛋白的量成功增加了19.3%[15]。甲醇流加方式對(duì)細(xì)胞代謝的影響表明，相較脈沖方式，間歇甲醇流加更有利于目的蛋白的生產(chǎn)[22]。我們采取兩段式補(bǔ)料，在甲醇誘導(dǎo)補(bǔ)料初期，細(xì)胞開始從以甘油生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐约状紴樘荚凑T導(dǎo)表達(dá)的生長(zhǎng)狀態(tài)需要一定適應(yīng)期，如圖3A所示，第27小時(shí)甲醇誘導(dǎo)補(bǔ)料時(shí)，菌體細(xì)胞生長(zhǎng)極其緩慢，在甲醇誘導(dǎo)初期前3 h設(shè)定甲醇流加量為3.6 mL/(h?L)，經(jīng)過3?5 h適應(yīng)期，菌體逐漸適應(yīng)利用甲醇為碳源的環(huán)境，菌體密度開始逐漸增加，目的蛋白也開始誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)酵母菌體細(xì)胞完全適應(yīng)甲醇的代謝后，菌體生長(zhǎng)繁殖增快，根據(jù)溶氧變化逐漸加大甲醇補(bǔ)加速率。隨著酵母菌體細(xì)胞密度的增加，蛋白表達(dá)量也逐漸增加。在甲醇誘導(dǎo)33 h左右，菌體濃度600達(dá)到240。

圖3 高密度發(fā)酵菌體生長(zhǎng)和目的蛋白表達(dá)曲線(A) 和發(fā)酵中不同時(shí)間點(diǎn)蛋白SDS-PAGE分析 (B)

分析不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液上清蛋白SDS-PAGE，結(jié)果見圖3B。目的蛋白表達(dá)量逐漸增加，同時(shí)蛋白降解。當(dāng)酵母細(xì)胞培養(yǎng)到54 h時(shí)，即誘導(dǎo)27 h左右，菌體量、目的蛋白表達(dá)量趨于穩(wěn)定，繼續(xù)發(fā)酵目的蛋白增加量不多，因菌體密度過大自溶釋放胞內(nèi)酶，造成對(duì)目的蛋白的降解。因此，甲醇誘導(dǎo)第33小時(shí)時(shí)，停止發(fā)酵。經(jīng)蛋白濃度檢測(cè)，發(fā)酵培養(yǎng)到60 h時(shí)，目的蛋白表達(dá)量最高，可達(dá)4.71 g/L。

2.6 類人膠原蛋白促進(jìn)胃粘膜修復(fù)的生物功效

類人膠原蛋白可通過影響細(xì)胞膜，增強(qiáng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)功能而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[19]，以前課題組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示類人膠原蛋白具有促進(jìn)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的功效[23-24]，能促進(jìn)潰瘍愈合。課題組研究的外用類人膠原蛋白口腔粘膜修復(fù)液治療潰瘍安全有效，能顯著縮短潰瘍愈合時(shí)間，已經(jīng)獲得國(guó)家醫(yī)療器械注冊(cè)許可進(jìn)入市場(chǎng)。本研究旨在研究實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的系列類人膠原蛋白在粘膜修復(fù)方面其他的潛在用途，課題組以胃潰瘍作為粘膜修復(fù)模型，建立了乙酸致慢性胃潰瘍模型[25]。本文利用重組類人膠原[26]、Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白α1鏈修復(fù)大鼠的乙酸性胃潰瘍，研究HLC對(duì)乙酸性胃潰瘍的修復(fù)作用。

在本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物潰瘍模型建立后，分別用類人膠原蛋白與重組的類人Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白α1鏈進(jìn)行修復(fù)對(duì)比，觀察不同的人源型膠原HLC對(duì)乙酸性胃潰瘍的修復(fù)效果。由圖4可以看出，給藥膠原蛋白實(shí)驗(yàn)組的大鼠胃粘膜都有一定程度的修復(fù)。在給藥1周后，其中類人膠原蛋白的修復(fù)效果最佳，已基本修復(fù)為正常水平，胃內(nèi)粘膜光滑未見潰瘍斑點(diǎn)，類人膠原Ⅰ型和Ⅲ型膠原α1鏈相對(duì)于模型組也有比較好的修復(fù)效果，但修復(fù)效果弱于類人膠原蛋白，而胃潰瘍后單純補(bǔ)給生理鹽水的模型組的潰瘍部位不能隨著時(shí)間延長(zhǎng)自行修復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，類人膠原蛋白治療乙酸損傷胃黏膜大鼠時(shí)未發(fā)現(xiàn)毒副作用，大鼠生長(zhǎng)正常 (圖5)。類人膠原蛋白及其系列重組人源型Ⅰ型、Ⅲ型膠原α1鏈均可用于胃潰瘍粘膜的修復(fù)，其作用效果初步獲得實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖4 模型組(A) 與實(shí)驗(yàn)組類人膠原蛋白 (B)、Ⅰ型(C) 和Ⅲ型 (D) 大鼠胃部解剖圖

圖5 健康對(duì)照組、模型對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組類人膠原蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型大鼠給藥治療前后體重變化

后續(xù)還需要進(jìn)一步通過以下兩方面實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：1) 確定類人膠原蛋白對(duì)胃潰瘍作用的量效關(guān)系。研究不同劑量的膠原蛋白在修復(fù)胃潰瘍模型時(shí)對(duì)潰瘍指數(shù)、潰瘍抑制率及對(duì)病灶部位的修復(fù)程度進(jìn)行組織學(xué)觀察；2) 研究類人膠原蛋白對(duì)乙酸性胃潰瘍黏膜的修復(fù)機(jī)制。測(cè)定胃組織堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、腫瘤壞死因子(TNF-β) 的水平等，為進(jìn)一步開發(fā)功效性藥食兼用的粘膜修復(fù)藥物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

對(duì)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組人Ⅲ型膠原蛋白的BMMY發(fā)酵培養(yǎng)基成分 (酵母提取物1.13%、蛋白胨1.61%、甘油 0.86%、硫酸銨0.8%、酵母氮堿0.3%和生物素4.5×10–5%) 進(jìn)行優(yōu)化，使得重組人Ⅲ型膠原蛋產(chǎn)量成功增加了19.3%。采取甲醇間歇流加補(bǔ)料，在22 L自控發(fā)酵罐上進(jìn)行類人膠原蛋白高密度發(fā)酵，產(chǎn)量達(dá)到4.71 g/L，對(duì)于后期工業(yè)發(fā)酵過程的工藝優(yōu)化和生產(chǎn)成本的縮減有重要意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，類人膠原蛋白治療乙酸損傷胃黏膜大鼠時(shí)未發(fā)現(xiàn)毒副作用，大鼠生長(zhǎng)正常。類人膠原蛋白及其系列重組人源型Ⅰ型、Ⅲ型膠原α1鏈均可用于胃潰瘍粘膜的修復(fù)，其作用效果初步獲得實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Production ofgastric-mucosa protective collagen Ⅲ by

Weina Li1,2, Zifang Shang1,2, Zhiguang Duan1,2, Linbo Li1,2, Jing He1,2, and Daidi Fan1,2

1 Shaanxi Key Laboratory of Degradable Biomedical Materials, School of Chemical Engineering, Northwest University, Xi’an 710069, Shaanxi, China 2 Shaanxi R&D Center of Biomaterials and Fermentation Engineering, College of Chemical Engineering, Northwest University, Xi’an 710069, Shaanxi, China

To improve collagen production by recombinant, we applied Placket-Burman and Box-Behnken design to optimize the fermentation medium. Through Placket-Burman design, three variables in the medium (concentration of yeast extract, peptone and glycerol) were selected for having significant effect on cell dry weight. Through Box-Behnken design regression coefficients analysis, a secondary degree polynomial equation was established, and the optimum levels of the three variables were yeast extract 1.13%, peptone 1.61% and glycerol 0.86%. During the growth period, an average cell dry weight of 4.41 g/L was obtained after 12 h fermentation, increased by 26%. Through high density fermentation, the production of recombinant human collagen (Ⅲ) was up to 4.71 g/L in 22 L fermentor. The recombinant human collagen (Ⅲ) exhibited good results to repair acetic acid induced gastric ulcer in rats.

, human collagen (Ⅲ), response surface methodology, gastric tissue

Supported by:Educational Commission of Shaanxi Province of China (No. 16JS104), China Postdoctoral Science Foundation (No. 2015M582698), Scientific Research Foundation in Northwest University (No. 338050025).

陜西省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研計(jì)劃項(xiàng)目(No. 16JS104)，博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目 (No. 2015M582698)，西北大學(xué)科研啟動(dòng)金 (No. 338050025) 資助。

October 14, 2016; Accepted: December 22, 2016

Daidi Fan. Tel: +86-29-88303360; E-mail: fandaidi66@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-01-09

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170109.1235.001.html