蘇彩霞，李邐，金貞姬，韓旭東，趙平，王琳，江春虎，王月麗，王文雯，徐德啟，朱乃碩

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戊型肝炎病毒樣顆粒在重組漢遜酵母中的發(fā)酵表達(dá)、純化及其免疫原性分析

蘇彩霞1,2，李邐1，金貞姬1，韓旭東1，趙平1，王琳3，江春虎1，王月麗1，王文雯1，徐德啟1，朱乃碩2

1 大連漢信生物制藥有限公司，遼寧大連 116600 2 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433 3 大連市血液中心，遼寧大連 116001

為了研制戊型肝炎新型基因工程疫苗，利用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組戊型肝炎病毒樣顆粒，成功構(gòu)建了重組戊型肝炎疫苗工程菌株HP/HEV2.3，對(duì)該菌株的發(fā)酵條件和純化工藝進(jìn)行了研究。先將工作種子批進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵后的細(xì)胞培養(yǎng)物；對(duì)其先后進(jìn)行細(xì)胞破碎、澄清和超濾、硅膠吸附和解吸附、超濾濃縮換液、色譜純化及除菌過(guò)濾，制得重組漢遜酵母戊型肝炎病毒樣顆粒，純化收率為33%，純度達(dá)99%；電鏡觀察顯示該重組漢遜酵母戊型肝炎病毒樣顆粒與天然戊型肝炎病毒顆粒理論大小一致，為32 nm；基因序列與理論一致；SDS-PAGE分析結(jié)果表明其表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分子量與預(yù)期的目的蛋白質(zhì)分子量大小一致，均為56 kDa，表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的26%，表達(dá)水平為1.0 g/L發(fā)酵液；Western blotting、ELISA活性檢測(cè)及小鼠免疫接種效力試驗(yàn)50結(jié)果表明，此重組漢遜酵母戊型肝炎病毒樣顆粒具有良好的抗原性和免疫原性，可用于制造戊型肝炎新型基因工程疫苗。

戊型肝炎病毒，病毒樣顆粒，發(fā)酵，純化，免疫原性

戊型肝炎 (Hepatitis E，HE) 是一種急性地方性流行腸道疾病，主要由糞-口途徑傳播，戊型肝炎多為急性發(fā)病，較少發(fā)展為慢性肝炎[1]。戊型肝炎作為一種腸道傳染病在一些發(fā)展中國(guó)家可占到急性病毒性肝炎的50%[2]。戊型肝炎臨床癥狀與甲型肝炎基本相同，患者主要表現(xiàn)為黃疸、厭食、肝腫大、腹部疼痛、惡心、嘔吐以及發(fā)燒等癥狀，死亡率約為1%，高于甲型肝炎[3]，尤其是孕婦的病死率可高達(dá)21%[4–5]。

戊型肝炎的第一次病原學(xué)鑒定是1983年Balayan等通過(guò)對(duì)1名志愿者的研究得到的，他們利用免疫電鏡技術(shù)在病人的急性期糞便和康復(fù)期血清中發(fā)現(xiàn)1個(gè)直徑為32 nm的無(wú)包膜病毒顆粒[6]。現(xiàn)有的戊型肝炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)方法均存在細(xì)胞感染率低、病毒載量低以及病毒結(jié)構(gòu)變化等嚴(yán)重問(wèn)題，目前仍未找到可獲得大量病毒的可行方法[7–9]。隨著近年來(lái)人們對(duì)戊型肝炎病毒研究的不斷深入與完善，對(duì)其基因組表達(dá)的認(rèn)識(shí)也越來(lái)越明了，戊型肝炎的基因工程疫苗成為生物科學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)之一。在基因工程疫苗中，病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs) 與可溶性抗原相比，因其免疫原性與安全性更高，常作為制造疫苗的第一候選[10]。

目前全世界范圍內(nèi)研制成功上市的重組戊型肝炎疫苗采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的戊型肝炎病毒抗原通過(guò)體外合適的組裝條件才能形成戊型肝炎病毒樣顆粒，疫苗制造工藝復(fù)雜而且回收率低[11–12]。

本文成功構(gòu)建了胞內(nèi)表達(dá)重組戊型肝炎病毒樣顆粒的重組漢遜酵母戊型肝炎疫苗工程菌株，在誘導(dǎo)表達(dá)的過(guò)程中直接形成完整的病毒樣顆粒，不需要體外組裝；并建立了此菌株的高密度發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物中重組漢遜酵母戊型肝炎病毒樣顆粒 (HEV VLPs) 的純化工藝，并對(duì)其進(jìn)行了免疫原性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

ATCC26012購(gòu)自美國(guó)菌種保存中心，漢遜酵母ATCC26012 (Ura3–)和重組漢遜酵母HEV 1、2、4和6拷貝的重組表達(dá)質(zhì)粒pDGXHP1.0- HEV、pDGXHP2.0-2MOX-HEV、pDGXHP2.0- 4MOX-HEV、pDGXHP2.0-6MOX-HEV及HEV原核大腸桿菌工程菌株[13]，由本室構(gòu)建并保存。

1.2 引物合成

用于鑒定重組菌株的引物P1位于MOXP啟動(dòng)子，P2位于MOXT終止子，具體序列如下：P1 5′-CACGGTGTGACATCATCTAAAGT-3′，P2 5′-TCCTTCCACGTCTCCTTAGTCTG-3′，以上引物由寶生物工程 (大連) 有限公司合成。

1.3 試劑

蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于TaKaRa公司；ELISA抗原和抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司；羊抗HEV多克隆抗體由中國(guó)食品藥品檢定研究院王佑春研究員惠贈(zèng)；HRP-兔抗羊IgG購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購(gòu)于Pall公司；色譜介質(zhì)Sepharose 4FF及DEAE Sepharose FF購(gòu)于GE公司；TSK-GEL G5000PW XL色譜柱購(gòu)于東曹公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠，體重14–16 g，4–5周齡，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK (遼) 2015-0001。

1.5 培養(yǎng)基

MDL培養(yǎng)基：0.14% YNB、0.5%硫酸銨、2%葡萄糖；MM培養(yǎng)基：1%甲醇、0.67% YNB、0.5%硫酸銨；酵母氮源培養(yǎng)基：0.67% YNB，0.5% (NH4)2SO4，2.5%甘油；甘油培養(yǎng)基：0.3% MgSO4·7H2O，0.4% KCl，0.04% NaCl，1.3% NH4H2PO4，3.4%甘油。

1.6 工程菌株的構(gòu)建和篩選

將重組表達(dá)質(zhì)粒1、2、4和6拷貝的重組表達(dá)質(zhì)粒pDGXHP1.0-HEV、pDGXHP2.0- 2MOX-HEV、pDGXHP2.0-4MOX-HEV和pDGXHP2.0-6MOX- HEV以電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化ATCC26012 (Ura3–) 宿主菌，轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于MDL平皿上，33 ℃孵箱培養(yǎng)1周，將長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化菌落轉(zhuǎn)接入10 mL MDL液體培養(yǎng)基中，33 ℃搖床傳代培養(yǎng)。傳代過(guò)程中運(yùn)用PCR的方法篩選重組菌株，引物為P1和P2，選擇生長(zhǎng)性能較穩(wěn)定的重組菌株進(jìn)行MDL培養(yǎng)，33 ℃搖床培養(yǎng)大約24 h，值達(dá)15–18，將其離心轉(zhuǎn)接到含有1%甲醇的MM培養(yǎng)基中，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)72 h后對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)重組菌株表達(dá)產(chǎn)物采用SDS-PAGE、ELISA和電子顯微鏡檢查病毒樣顆粒大小的方法進(jìn)行鑒定。最后將所鑒定的理想的原始菌株穩(wěn)定傳代培養(yǎng)70?80代，并且經(jīng)PCR篩選為穩(wěn)定整合有外源基因的重組菌株，接入YPD培養(yǎng)基中33 ℃搖床培養(yǎng)，加入凍存液制成主種子批于–70 ℃保存菌種。

1.7 工程菌株的高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.7.1 一級(jí)菌種制備

將篩選的工程菌株以1%接種量接種于酵母氮源培養(yǎng)基，30–33 ℃、200 r/min培養(yǎng)約20 h，當(dāng)用紫外-可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)一級(jí)培養(yǎng)物吸光度值600為10–20時(shí)，培養(yǎng)物可用于制備二級(jí) 菌種。

1.7.2 二級(jí)菌種制備

以10%的接種量將一級(jí)菌種接種于酵母氮源培養(yǎng)基，30–33 ℃、200 r/min培養(yǎng)約20 h，當(dāng)用紫外-可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)二級(jí)培養(yǎng)物吸光度值600為10–20時(shí)，培養(yǎng)物可用于發(fā)酵。

1.7.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

以10%的接種量將二級(jí)菌種接種于甘油培養(yǎng)基，控制除溫度外的其他條件相同，分別于28 ℃、30 ℃、32 ℃及34 ℃培養(yǎng)4批，其中30 ℃條件下菌種生長(zhǎng)最快。在30 ℃條件下分別培養(yǎng)4批，13–15 h后開(kāi)始誘導(dǎo)?？刂瞥状剂骷铀俣韧馄渌麠l件相同，分別勻速流加終濃度為0.5%、1%、1.5%及2%的甲醇，誘導(dǎo)75–80 h，其中甲醇添加終濃度為1%時(shí)目的物表達(dá)量最高。

1.8 HEV VLPs的分離與純化

1.8.1 菌體破碎

將發(fā)酵液離心收集菌體，充分混懸于PBS緩沖液 (50 mmol/L PBS，pH 8.0)，使菌體濃度為50%，再離心收集菌體，如此清洗菌體3次。將清洗后的菌體充分混懸于細(xì)胞破碎液 (50 mmol/L PBS，100 mmol/L NaCl，1% Tween-80)，使菌體濃度為30%，采用玻璃珠研磨法破碎。在破碎液中加入終濃度為0.04%的PMSF，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，離心收集上清。

1.8.2 澄清過(guò)濾

將上清液通過(guò)0.65 μm中空纖維柱進(jìn)行澄清去掉細(xì)胞碎片，用PBS緩沖液 (50 mmol/L PBS，pH 8.0) 沖洗9–10倍上清液體積，收集膜下透過(guò)液，相同條件下將透過(guò)液分別通過(guò)500 kDa、750 kDa及0.2 μm規(guī)格的中空纖維柱進(jìn)行超濾濃縮，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)750 kDa中空纖維柱能在完全保留目的蛋白的前提下去除較多的雜質(zhì)，且目的蛋白收率最高。濃縮后用PBS緩沖液沖洗5–6倍透過(guò)液體積，收集膜上液。

1.8.3 硅膠吸附和解吸附

于膜上液中加入7.5%硅膠溶液，2–8 ℃攪拌吸附10–16 h，離心去除上清液；沉淀充分重懸于與原上清液等體積的生理鹽水中洗滌，離心去除洗滌上清液，如此洗滌2次；在沉淀中加入原上清液體積40%–50%的硅膠解吸附液(3.814 g/L Na2B4O7·10H2O，0.742 g/L EDTA，2.5 g/L脫氧膽酸鈉)，于57 ℃攪拌90 min，離心去除沉淀，上清液中加入4 mol/L的NaCl溶液，使NaCl終濃度為0.33 mol/L，混勻，2–8 ℃靜置30 min，離心去除沉淀，收集上清液。

1.8.4 過(guò)濾濃縮

將經(jīng)硅膠吸附和解吸附操作后得到的上清液經(jīng)750 kDa中空纖維柱過(guò)濾，PBS緩沖液清洗5–6倍上清液體積，膜上保留溶液濃縮至蛋白濃度為2–3 mg/mL，收集保留濃縮溶液。

1.8.5 層析工藝優(yōu)化

嘗試使用Q Sepharose FF及DEAE Sepharose FF兩種陰離子交換色譜介質(zhì)純化保留濃縮液，其中Q Sepharose FF在各種條件下均對(duì)保留濃縮液中的目的蛋白和雜質(zhì)同時(shí)保持較高吸附率，純化效果不理想；DEAE Sepharose FF純化效果較好，對(duì)其進(jìn)一步摸索，分別采用不同pH值 (pH 7.0–8.5) 的平衡液 (3 mmol/L PBS) 平衡系統(tǒng)后上樣，檢測(cè)穿透峰，確定在pH 8.0條件下目的蛋白完全吸附且雜質(zhì)吸附最少。在pH 8.0條件下上樣，穿透峰完全穿出后嘗試不同NaCl濃度的洗脫液 (50 mmol/L PBS，0.2–1.5 mol/L NaCl范圍，pH 8.0) 洗脫，比較洗脫峰形，檢測(cè)洗脫峰，確定NaCl濃度為0.5 mol/L時(shí)純化結(jié)果最好。在NaCl濃度為0.5 mol/L條件下洗脫，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)280 nm，收集280第1個(gè)洗脫峰；繼續(xù)考察此洗脫峰經(jīng)色譜介質(zhì)Sepharose 4FF及Sepharose 6FF純化的效果，二者都出現(xiàn)2個(gè)穿透峰，其中經(jīng)Sepharose 4FF純化時(shí)含有目的蛋白的1峰純度更好。則采用Sepharose 4FF對(duì)上述洗脫峰進(jìn)行進(jìn)一步純化，平衡液 (3 mmol/L PBS，pH 8.0) 平衡系統(tǒng)后上樣，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)280 nm，收集280第1個(gè)穿透峰。

1.9 HEV VLPs檢測(cè)

1.9.1 電子顯微鏡檢查

取50 μL HEV VLPs純化樣品滴于銅網(wǎng)，2%磷鎢酸負(fù)染3 min，室溫下干燥4 min，樣品置于透射電子顯微鏡 (H-7000FA) 下觀察，本實(shí)驗(yàn)在大連醫(yī)科大學(xué)完成，儀器和試劑由該實(shí)驗(yàn)室提供。

1.9.2 ELISA檢測(cè)

采用雙抗體夾心ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下：在已包被戊型肝炎病毒多克隆抗體的酶標(biāo)板孔中加入梯度稀釋的細(xì)胞破碎上清液(設(shè)HEV抗原陽(yáng)性血清作為陽(yáng)性對(duì)照、HEV抗原陰性血清作為陰性對(duì)照、稀釋樣品所用的緩沖液作為空白對(duì)照)。37 ℃孵育l h；然后加入HRP標(biāo)記的HEV特異性單克隆抗體，37 ℃孵育l h；加入1% TMB顯色液顯色10 min，加終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)分析儀上測(cè)定ELISA反應(yīng)各孔450值，P/N≥2.1，判斷為陽(yáng)性，且450≥0.1，抗原的最高稀釋度為目的蛋白的效價(jià)。

1.9.3 SDS-PAGE檢測(cè)

配制12%分離膠、6%濃縮膠，菌體樣品經(jīng)NaOH、SDS 緩沖液處理；破碎上清樣品經(jīng)SDS 緩沖液處理；加樣量均為4 μL，同時(shí)點(diǎn)樣HEV原核表達(dá)菌陽(yáng)性對(duì)照及無(wú)HEV基因原核和酵母菌陰性對(duì)照，小搖瓶和發(fā)酵罐樣品進(jìn)行表達(dá)量的對(duì)比并確定細(xì)胞破碎效果。先12 mA恒流電泳20 min，再24 mA恒流繼續(xù)電泳1.5 h，電泳完畢，取下膠，考馬斯亮藍(lán)染色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析目的蛋白HEV VLPs的分子量和表達(dá)量。

1.9.4 HPLC分析

采用TSK-GEL G5000PW XL色譜柱分析HEV VLPs純化樣品的純度，平衡液 (3 mmol/L PBS，pH 8.0) 平衡系統(tǒng)至少30 min，進(jìn)樣，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)280 nm，記錄圖譜。

1.10 HEV VLPs抗原性和免疫原性分析

1.10.1 Western blotting鑒定

純化樣品SDS-PAGE膠電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以160 mA的恒定電流轉(zhuǎn)移2 h；封閉：將轉(zhuǎn)移后的PVDF膜置封閉液PBST中37 ℃封閉過(guò)夜；結(jié)合：加入羊抗HEV多克隆抗體(1∶500) 作為第一抗體，與PVDF膜37 ℃結(jié)合2 h，然后加入HRP-兔抗羊IgG (1∶1 000) 第二抗體，37 ℃作用l h；OPD顯色直至出現(xiàn)清晰條帶，去離子水終止反應(yīng)。

1.10.2 疫苗效力50(免疫原性)檢測(cè)

戊型肝炎病毒樣顆粒與鋁佐劑配制成疫苗，用鋁佐劑分別稀釋成HEV VLPs濃度為2.5 μg/mL、0.625 μg/mL和0.156 μg/mL的3個(gè)樣品，采用SPF級(jí)BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫，每個(gè)樣品各注射10只小鼠，每只小鼠注射1.0 mL，28 d取血，小鼠血室溫放置1 h，8 000 r/min離心1 min，即得免疫血清。采用戊型肝炎病毒IgG抗體ELISA試劑盒檢測(cè)血清抗體，統(tǒng)計(jì)抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算小鼠效力50(半數(shù)有效劑量)，確定其免疫原性。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株的PCR篩選結(jié)果

PCR引物P1和P2位于外源基因兩端啟動(dòng)子和終止子上，擴(kuò)增目的基因片段大約為1 600 bp，部分HEV工程菌PCR結(jié)果如圖1所示。

2.2 工程菌株的篩選

對(duì)重組菌株采用MM培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)后，產(chǎn)物采用SDS-PAGE和電子顯微鏡檢查病毒樣顆粒大小的方法進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)外源基因拷貝數(shù)越高的重組菌株外源蛋白表達(dá)量越高，但高拷貝表達(dá)量過(guò)高的菌株病毒樣顆粒形成大小不理想，最后篩選到了外源基因兩拷貝的高表達(dá)工程菌株，命名為HP/HEV2.3，其表達(dá)量高并能組裝形成與天然病毒顆粒大小一致的病毒樣顆粒。結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

圖1 HEV ORF2重組工程菌PCR鑒定結(jié)果

2.3 層析工藝優(yōu)化結(jié)果

保留濃縮溶液經(jīng)色譜介質(zhì)DEAE Sepharose FF進(jìn)行純化的純化圖譜見(jiàn)圖2，HEV VLPs存在于280第1個(gè)洗脫峰 (圖2中的b1峰)；此洗脫峰再經(jīng)過(guò)色譜介質(zhì)Sepharose 4FF進(jìn)行純化的純化圖譜見(jiàn)圖3，280第1個(gè)穿透峰 (圖3中的a峰) 為目的蛋白峰HEV VLPs SDS-PAGE分析見(jiàn)圖4。

圖2 DEAE Sepharose FF介質(zhì)純化280 nm吸收光譜圖

圖3 Sepharose 4FF介質(zhì)純化280 nm吸收光譜圖

圖4 色譜純化的HEV VLPs蛋白電泳結(jié)果

2.4 電子顯微鏡檢查

電鏡檢查HEV VLPs大小為32 nm左右，與天然病毒顆粒理論大小一致，結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.5 ELISA檢測(cè)

抗原的最高稀釋度為目的蛋白的效價(jià)，檢測(cè)效價(jià)為1∶10 000，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 SDS-PAGE檢測(cè)

SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4、圖6和圖7，結(jié)果確定分子量大小約為56 kDa；凝膠成像系統(tǒng)掃描分析表達(dá)量結(jié)果見(jiàn)圖6第6泳道和表2，分析可知表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的26%，發(fā)酵液總的表達(dá)量為1.0 g/L，通過(guò)對(duì)整體純化收率估算，收率為33%，估算見(jiàn)表3。

表1 細(xì)胞破碎液的ELISA檢測(cè)結(jié)果

圖6 細(xì)胞破碎上清蛋白電泳分析結(jié)果

表2 細(xì)胞破碎上清蛋白電泳條帶(圖6中的泳道6)的凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果

圖7 細(xì)胞破碎上清的初步純化蛋白電泳結(jié)果

表3 各純化步驟HEV VLPs收率

2.7 Western blotting鑒定

Western blotting鑒定見(jiàn)圖8，可見(jiàn)為特異性的56 kDa的單一條帶。

2.8 HPLC分析

最終純化樣品經(jīng)HPLC分析顯示，HEV VLPs純度為99%；結(jié)果見(jiàn)圖9。

2.9 疫苗效力50(免疫原性) 檢測(cè)

2.9.1 抗體檢測(cè)結(jié)果

將HEV VLPs濃度為2.5、0.625和0.156 μg/mL的3個(gè)樣品分別腹腔注射3組各10只小鼠，小鼠編號(hào)1–10，小組編號(hào)分別為Group 1、2、3；免疫小鼠采血檢測(cè)抗體，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖8 HEV VLPs最終純化樣品的Western blotting鑒定結(jié)果

2.9.2 Reed-Muench法計(jì)算50

距離比例=(高于50%陽(yáng)轉(zhuǎn)率?50%)/(高于50%陽(yáng)轉(zhuǎn)率?低于50%陽(yáng)轉(zhuǎn)率)=(91.67%? 50%)/(91.67%?18.18%)=0.57

50%陽(yáng)轉(zhuǎn)率終點(diǎn)對(duì)數(shù)=高于50%陽(yáng)轉(zhuǎn)率含量對(duì)數(shù)+距離比×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)=lg0.625+0.57×lg0.25=–0.55

50值(μg)=10(50%陽(yáng)轉(zhuǎn)率終點(diǎn)對(duì)數(shù))=10–0.55=0.3

計(jì)算結(jié)果50值為0.3 μg，表明其具有很好的免疫原性。

圖9 HEV VLPs最終純化樣品的HPLC圖譜

表4 HEV VLPs免疫小鼠抗體滴度檢測(cè)結(jié)果

3 討論

基因工程疫苗實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的基本條件是目的蛋白表達(dá)量足夠高，并能夠從宿主雜蛋白中純化出純度足夠高和免疫原性足夠好的目的蛋白，滿足這3個(gè)條件之后才有可能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。本室多年在漢遜酵母平臺(tái)上研發(fā)戊型肝炎疫苗，前期構(gòu)建了一系列單和多拷貝HEV重組表達(dá)質(zhì)粒，本文通過(guò)一些檢測(cè)手段篩選到了表達(dá)量足夠高并能形成理想VLPs的HEV漢遜工程菌株HP/HEV2.3，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)外源基因拷貝數(shù)越多外源蛋白的表達(dá)量越高，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[14-15]，但表達(dá)量過(guò)高又會(huì)影響理想VLPs的形成[16-17]。然后通過(guò)并對(duì)此菌株的發(fā)酵條件的摸索及其發(fā)酵產(chǎn)物的純化方法的研究，建立了酵母菌胞內(nèi)直接組裝成完整的重組戊型肝炎病毒樣顆粒的制備工藝路線，經(jīng)檢測(cè)，表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的26%，發(fā)酵液表達(dá)量為1.0 g/L；經(jīng)純化后所得樣品純度可高達(dá)99%，收率達(dá)33%，具備了產(chǎn)業(yè)化的可能性；ELISA效價(jià)為1∶10 000，疫苗效力50值為0.3 μg，結(jié)果表明制備的HEV VLPs純度高免疫原性良好，能夠用來(lái)制備新型重組戊型肝炎疫苗，為戊型肝炎的防治工作提供了新的方法。本研究采用多形漢遜酵母作為表達(dá)系統(tǒng)，多形漢遜酵母是一種有很大潛力的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，已在科研和工業(yè)化生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用，用它生產(chǎn)來(lái)源于真核生物的外源基因有諸多優(yōu)勢(shì)，如遺傳穩(wěn)定、能進(jìn)行正確的翻譯后加工和修飾、表達(dá)量高等[18–21]，而且病毒樣顆粒的裝配和加工也更適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[22–25]。

致 謝：本課題的研究工作得到了中國(guó)食品藥品檢定研究院王佑春研究員及其實(shí)驗(yàn)室老師們的大力支持，在此深表感謝！

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Fermentation, purification and immunogenicity evaluation of hepatitis E virus-like particles expressed in

Caixia Su1,2, Li Li1, Zhenji Jin1, Xudong Han1, Ping Zhao1, Lin Wang3, Chunhu Jiang1, Yueli Wang1, Wenwen Wang1, Deqi Xu1, and Naishuo Zhu2

1 Dalian Hissen Bio-Pharmaceutical INC., Dalian 116600, Liaoning, China 2 College of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China 3 Dalian Blood Center, Dalian 116001, Liaoning, China

To develop a new recombinant hepatitis E vaccine, we usedexpression system to express recombinant hepatitis E virus-like particles (HEV VLPs), to construct a recombinant engineered strain HP/HEV2.3. The fermentation conditions and purification process were studied next. The first working seed lots were fermented in liquid culture, and the fermentation products were collected, then crushed, clarified, purified by ultrafiltration, silica gel adsorbed and desorbed, concentrated by ultrafiltration, purified by liquid chromatography and sterilized by filtration. The purity reached 99% with a yield of 33%. Electron microscopy analysis revealed that both the purified recombinant HEV VLPs from HP/HEV2.3 and natural hepatitis E virus particles appear identical of being 32 nm. The resulting DNA sequence obtained from VLPs is identical to the published HEV sequence. The SDS-PAGE analysis has revealed that the protein molecular weight of the HEV VLPs is 56 kDa, and the expression product HEV VLPs were accumulated up to 26% of total cellular protein. The expression level is 1.0 g/L. Western blotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) results of the protein and50of the vaccine showed that the HEV VLPs have good antigenicity and immunogenicity. In summary, the recombinant HEV VLPs fromcan be used in the manufacture of a new genetically engineered vaccine against hepatitis E.

hepatitis Evirus, virus-like particles, fermentation, purification, immunogenicity

Supported by:The Special Fund of Enterprise Technology Center of Liaoning Province (No. 2011623).

遼寧省企業(yè)技術(shù)中心專(zhuān)項(xiàng)資金 (No. 2011623) 資助。

October 18, 2016; Accepted: February 7, 2017

Caixia Su. Tel: +86-411-87642925; Fax: +86-411-87407613; E-mail: sucx@hotmail.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-02-16

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170216.1106.004.html