趙秀艷，常飛，方澤民，張寅良，肖亞中

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黏細(xì)菌漆酶序列篩選及其重組酶酶學(xué)性質(zhì)

趙秀艷1,2，常飛1,2，方澤民1,2，張寅良1,2，肖亞中1,2

1 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230601 2 安徽省微生物與生物催化工程技術(shù)研究中心，安徽合肥 230601

漆酶是一種應(yīng)用廣泛的綠色環(huán)保的多酚氧化酶。漆酶過(guò)去被認(rèn)為廣泛存在于植物、昆蟲(chóng)和真菌中，而近年來(lái)，越來(lái)越多的細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了漆酶的存在。黏細(xì)菌是一類(lèi)重要的資源菌，但與一般細(xì)菌相比，較難分離和純化。文中利用生物信息學(xué)的方法，綜合應(yīng)用Blast和隱馬爾可夫模型方法對(duì)黏細(xì)菌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，并根據(jù)多銅氧化酶的保守銅離子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步篩選，獲得30個(gè)候選黏細(xì)菌漆酶序列。挑選其中9個(gè)，在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)。利用2,6-甲氧基苯酚 (DMP) 等常用漆酶底物檢測(cè)重組酶的催化氧化活性，其中7個(gè)重組蛋白具有漆酶催化活性。選擇1個(gè)對(duì)2,6-甲氧基苯酚 (DMP) 具有較高氧化活性的重組酶 (命名為rSC-2)，通過(guò)Ni-NTA親和層析柱純化rSC-2，測(cè)試其酶學(xué)性質(zhì)。純化的rSC-2蛋白分子量約57 kDa，在最適反應(yīng)條件下，rSC-2催化DMP反應(yīng)的比酶活為0.27 U/mg。催化DMP反應(yīng)的最適溫度為60 ℃，最適pH為7.0。rSC-2在pH 7.0?8.0有較高酶活，在60 ℃孵育1 h保留50%以上剩余酶活。低濃度的Ca2+對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用，而較高濃度的Fe3+、Co2+、Ba2+對(duì)酶活的抑制作用較明顯。這是首次對(duì)黏細(xì)菌漆酶序列進(jìn)行系統(tǒng)性的生物信息學(xué)分析，并實(shí)現(xiàn)纖維堆囊菌序列來(lái)源的漆酶活性蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中重組表達(dá)。

生物信息學(xué)，黏細(xì)菌漆酶，重組表達(dá)，分離純化，酶學(xué)性質(zhì)

漆酶 (Laccase) 是一種含銅的多酚氧化酶，屬于多銅氧化酶家族，能催化多種酚類(lèi)及非酚類(lèi)化合物氧化，在工業(yè)染料脫色、新型藥物合成、生物傳感器研制和食品飲料加工等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值[1-3]。漆酶最初在漆樹(shù)的汁液中被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在認(rèn)為其廣泛分布于植物、 動(dòng)物、特別是真菌中。1993年，Givaudan等[4]從植物根際細(xì)菌生脂固氮螺菌中首次發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌漆酶的存在。通過(guò)對(duì)不同微生物來(lái)源漆酶的性質(zhì)比較發(fā)現(xiàn)，不同的漆酶同工酶蛋白發(fā)揮不同的生理功能，且物種來(lái)源不同的漆酶具有差異的酶學(xué)性質(zhì)，如細(xì)菌來(lái)源的漆酶在中性及偏堿性等環(huán)境有較高催化能力[5-6]，古細(xì)菌來(lái)源的漆酶熱力學(xué)穩(wěn)定性較好，而真菌來(lái)源的漆酶比活力較高。因此，從不同種屬微生物中發(fā)現(xiàn)新型漆酶，對(duì)于深入理解漆酶的功能，以及促進(jìn)其在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

黏細(xì)菌 (Myxobacteria) 是一類(lèi)革蘭氏陰性單細(xì)胞生物，主要存在于富含微生物和有機(jī)質(zhì)的環(huán)境中，最適生長(zhǎng)溫度在30 ℃左右，處于饑餓干旱環(huán)境中形成子實(shí)體，并在內(nèi)部生成黏孢子，黏孢子對(duì)逆境有較強(qiáng)的抗性[7-8]。根據(jù)對(duì)底物利用能力的不同，黏細(xì)菌被分為兩大類(lèi)群。一類(lèi)是不能利用纖維素，但可降解利用活細(xì)菌 (嗜細(xì)菌類(lèi)群)；另一類(lèi)不能降解利用活細(xì)菌，卻能分解利用纖維素 (嗜纖維素類(lèi)群)[9]。與一般細(xì)菌相比，黏細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞壁上有復(fù)雜的胞外附屬物，易于黏附攜帶其他污染物，較難分離和純化。已有研究表明，黏細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有豐富多樣的生物活性，是篩選獲得新型抗菌、抗腫瘤等活性化合物的重要資源[10-12]，但關(guān)于黏細(xì)菌漆酶的研究未見(jiàn)報(bào)道。

基因序列測(cè)定技術(shù)的快速進(jìn)步為利用生物信息學(xué)方法挖掘難分離培養(yǎng)微生物資源提供了便利。迄今，有13個(gè)黏細(xì)菌基因組序列被發(fā)布，在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)候選黏細(xì)菌漆酶序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)合基因人工合成方法，進(jìn)一步對(duì)篩選的9個(gè)候選序列進(jìn)行重組表達(dá)，并對(duì)黏細(xì)菌來(lái)源的具有漆酶活性的重組蛋白rSC-2的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器

2,6-甲氧基苯酚 (DMP)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 二銨鹽 (ABTS)、多巴胺、丁香醛連氮 (SGZ)、甲氧基苯酚、愈創(chuàng)木酚、二茂鐵、鄰苯二酚、標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白marker和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；超聲細(xì)胞破碎儀，冷凍離心機(jī)，鎳離子親和層析柱，One Drop微量紫外分光光度計(jì)，pH計(jì)，電泳儀。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 固體培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸膏5，NaCl 10，瓊脂15，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂15，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 黏細(xì)菌潛在漆酶基因序列的篩選

從NCBI下載所有已知的黏細(xì)菌目下的蛋白質(zhì)組序列，以枯草芽孢桿菌的CotA蛋白序列 (PDB ID：1GSK) 和來(lái)自大腸桿菌的CueO蛋白序列 (PDB ID：3OD3) 為模板，對(duì)黏細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/genome/?term=myxobacteria) 中有蛋白序列信息的氨基酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)潛在黏細(xì)菌漆酶序列。保留evalue≤0.001且比對(duì)長(zhǎng)度≥200個(gè)氨基酸的結(jié)果。

按照Ausec等[13]的方法，同時(shí)用5種漆酶多銅氧化酶 (Laccase-like multicopper oxidase，MCO) 的隱馬爾可夫模型，分別表征5類(lèi)不同類(lèi)型的漆酶特征。以這5個(gè)模型為種子，用HMMER3.0軟件分別對(duì)下載的黏細(xì)菌進(jìn)行全蛋白質(zhì)組比對(duì)。保留最高分?jǐn)?shù)大于100的序列，對(duì)于每一條比對(duì)出的蛋白質(zhì)序列，選取分?jǐn)?shù)最高的種子模型作為該序列的特征。

通過(guò)ClustalO工具對(duì)這些序列進(jìn)行多序列比對(duì)，找出銅離子保守位點(diǎn)，去除不包含4個(gè)銅離子保守位點(diǎn)的序列。利用MEGA6工具構(gòu)建系統(tǒng)分類(lèi)樹(shù)狀圖。

1.2.2 黏細(xì)菌漆酶表達(dá)體系的構(gòu)建

選取目標(biāo)黏細(xì)菌蛋白序列，根據(jù)大腸桿菌偏好性對(duì)編碼序列密碼子進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后的序列送往商業(yè)公司進(jìn)行基因合成。用pET22b構(gòu)建黏細(xì)菌漆酶重組表達(dá)載體，選擇BL21 (DE3)作為宿主細(xì)胞，將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3) 細(xì)胞進(jìn)行重組表達(dá)。

1.2.3 重組酶的制備

挑取待培養(yǎng)的重組大腸桿菌陽(yáng)性克隆單菌落于LB液體培養(yǎng)基 (按1%接種量)，37 ℃、 220 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，轉(zhuǎn)接4 mL培養(yǎng)液至400 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至600達(dá)到0.8，加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG，16 ℃、150 r/min誘導(dǎo)表達(dá)15–18 h。收集菌體，超聲破碎細(xì)胞，8 000×離心30 min，收集上清，利用Ni2+-NTA柱親和純化蛋白，純化過(guò)程參照生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度，用One Drop微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定280并計(jì)算蛋白濃度。

1.2.4 重組酶的活性測(cè)定

以DMP為底物考察重組蛋白的漆酶活 力，反應(yīng)體系包括：10 μL適當(dāng)稀釋的酶液、 終濃度為1 mmol/L的DMP以及50 mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH 7.0)，60 ℃反應(yīng) 5 min后，冰上孵育30 s終止反應(yīng)，設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組，3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，測(cè)定方法參照Fang等[14]。酶活力單位 (U) 定義為每分鐘氧化 1 μmol DMP所需的酶量。

1.2.5 重組酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

將漆酶酶液用50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液 (pH 7.0) 適當(dāng)稀釋?zhuān)糜?0 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃的水浴中保溫1 h，0 h測(cè)定初始酶活，1 h后測(cè)定剩余酶活，計(jì)算相對(duì)酶活，以最高的酶活為100%，相對(duì)酶活 (%) = (各溫度條件下的酶活/最高酶活)×100%。以未處理酶液的酶活力為100%，剩余酶活 (%) = (各溫度條件下的剩余酶活/最初酶活)×100%。

1.2.6 重組酶的最適pH值和pH穩(wěn)定性

取等量的酶液置于不同pH值 (pH 4.5?5.5 CH3COONa-CH3COOH；pH 5.5?8.0 Na2HPO4- KH2PO4；pH 8.0?8.5 Tris-HCl) 的緩沖液中，在最適溫度下測(cè)定酶活力，以0 h為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)酶活。以最高的酶活100%，相對(duì)酶活 (%) = (各pH條件下的酶活/最高酶活)×100%。在酶對(duì)pH值的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，以pH 4.5?8.5的緩沖液適當(dāng)稀釋酶液于30 ℃保溫1 h后測(cè)定其剩余酶活。

1.2.7 金屬離子對(duì)重組酶活性的影響

選取K+、Ca2+、Mg2+、Na+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Co2+、Ba2+，用Na2HPO4/KH2PO4(50 mmol/L、pH 7.0) 配成母液濃度分別為100 mmol/L金屬離子溶液，測(cè)定金屬離子存在的條件下對(duì)重組酶漆酶活力的影響，以不含金屬離子的反應(yīng)液為對(duì)照，加入適量母液金屬離子緩沖液，使其終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L，每種金屬離子的2個(gè)濃度都設(shè)3個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(±) 計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 黏細(xì)菌漆酶活性蛋白候選序列的篩選及分析

從已發(fā)布的13個(gè)黏細(xì)菌蛋白質(zhì)組篩選獲得31條潛在漆酶序列。通過(guò)多序列比對(duì)，去除1個(gè)不完全包含4個(gè)保守銅離子結(jié)合位點(diǎn)的序列 (WP_002631421.1)，共計(jì)30個(gè)序列作為漆酶活性蛋白候選序列。構(gòu)建的30個(gè)漆酶活性蛋白候選序列系統(tǒng)分類(lèi)進(jìn)化圖如圖1所示。從圖1可以看出，黏細(xì)菌漆酶活性蛋白候選序列大致可分為4類(lèi)。

圖1 候選黏細(xì)菌漆酶系統(tǒng)分類(lèi)進(jìn)化圖

Fig. 1 Phylogenetic evolutionary tree of the myxobacteria laccase candidates.

類(lèi)別Ⅰ包含8個(gè)候選黏細(xì)菌漆酶，來(lái)源于6個(gè)物種，分別為珊瑚狀珊瑚球菌、深褐孢囊桿菌、葉柄黏球菌、黃色黏球菌、纖維堆囊菌和橙色標(biāo)樁菌。隱馬爾可夫模型分析顯示，這8個(gè)漆酶活性蛋白屬于typeB的兩域小漆酶[15]，氨基酸數(shù)目較少，在410?456之間。另外，這8個(gè)黏細(xì)菌漆酶活性蛋白兩兩之間氨基酸序列一致性超過(guò)60%，雖然來(lái)源不同，但相似性較高。

類(lèi)別Ⅱ也包含了8個(gè)候選黏細(xì)菌漆酶，來(lái)源于5個(gè)物種，分別為珊瑚狀珊瑚球菌、葉柄黏球菌、黃色黏球菌、太平洋鄰囊菌和纖維堆囊菌。隱馬爾可夫模型分析表明，這8個(gè)黏細(xì)菌漆酶活性蛋白屬于普通的三域漆酶，氨基酸數(shù)目在450?502之間。值得注意的是，它們中有4個(gè)均來(lái)源于，而這4個(gè)蛋白的兩兩序列一致性只有30%?40%。反而是3個(gè)不同菌株來(lái)源的候選漆酶 (、和) 序列一致性較高，達(dá)到50%?60%。

類(lèi)別Ⅲ包含6個(gè)候選黏細(xì)菌漆酶，來(lái)源于4個(gè)物種，分別是脫鹵厭氧黏桿菌、深褐孢囊桿菌、赫黃嗜鹽囊菌和纖維堆囊菌。這6個(gè)蛋白較大，氨基酸數(shù)量在591?1 359之間，兩兩序列一致性也只有20%?30%，雖然包含4個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)，但可能還擁有其他酶的活性。

類(lèi)別Ⅳ同樣包含了8個(gè)候選黏細(xì)菌漆酶，來(lái)源于6個(gè)物種，分別為軟骨霉?fàn)罹?、深褐孢囊桿菌、細(xì)小玻管狀菌、太平洋鄰囊菌、纖維堆囊菌和橙色標(biāo)樁菌。隱馬爾可夫模型分析表明這8個(gè)候選黏細(xì)菌漆酶也屬于普通的三域漆酶，但氨基酸數(shù)目比類(lèi)別Ⅱ大，在527–651之間。兩兩之間序列一致性差異較大，有的只有20%?30%，而有的高達(dá)70%。

對(duì)獲得的30個(gè)候選黏細(xì)菌漆酶序列以及真菌來(lái)源且具有晶體結(jié)構(gòu)的2個(gè)漆酶序列 (1KYA、1GYC) 和2個(gè)細(xì)菌漆酶(CotA、3OD3_A)序列進(jìn)行全序列比對(duì)。結(jié)果表明，所比對(duì)序列的4個(gè)銅離子結(jié)合區(qū)氨基酸類(lèi)型高度保守，分別為HxHG、HxH、HxxHxH和HCHxxxH (圖2A)，而4個(gè)底物結(jié)合區(qū)域編碼序列的長(zhǎng)度和類(lèi)型差異較大 (圖2B，2C)。此外，我們還標(biāo)注了漆酶的4個(gè)底物結(jié)合loop區(qū)，這4段區(qū)域彼此高度特異，序列長(zhǎng)度和氨基酸類(lèi)型均不同。

2.2 重組酶的分離純化及其性質(zhì)分析

從4個(gè)類(lèi)別分別選取2個(gè)潛在黏細(xì)菌漆酶序列，共計(jì)9個(gè)潛在漆酶序列送往公司進(jìn)行基因合成，并構(gòu)建重組酶大腸桿菌表達(dá)體系BL21 (DE3)/pET22b-lacX。初步重組蛋白表達(dá)后，獲得粗酶液，分別用底物SGZ、DMP、愈創(chuàng)木酚、二茂鐵和鄰苯二酚等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中來(lái)自WP_012240709.1、WP_012240711.1、WP_012233138.1、WP_012234756.1、WP_002621665.1、WP_006975397.1、WP_044243002.1序列獲得的7個(gè)重組蛋白具有催化活性。

選取其中一個(gè)來(lái)自類(lèi)別II () 對(duì)DMP具有較高催化活性的三域漆酶SC-2 (WP_012240711.1) 的重組酶進(jìn)行純化制備，分析其酶學(xué)性質(zhì)。

2.2.1 rSC-2表觀分子量

成功構(gòu)建表達(dá)載體pET22b-SC-2，并實(shí)現(xiàn)具有漆酶活性蛋白SC-2在BL21 (DE3)中的活性表達(dá)。通過(guò)Ni2+-NTA柱純化蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)顯示單一目標(biāo)蛋白條帶 (圖3)，說(shuō)明rSC-2已被成功純化到SDS-PAGE電泳純。編碼rSC-2的氨基酸共525個(gè)，理論計(jì)算rSC-2分子量為57.15 kDa，與蛋白電泳條帶位置大小一致。

2.2.2 溫度對(duì)rSC-2活性的影響

將反應(yīng)體系置于各溫度水浴中，測(cè)定溫度對(duì)rSC-2活性的影響。由圖4A可以看出，rSC-2的最適反應(yīng)溫度是60 ℃，50 ℃?70 ℃剩余酶活保留80%以上，80 ℃時(shí)剩余酶活40%左右。

圖3 rSC-2的SDS-PAGE電泳

圖4 溫度、pH對(duì)rSC-2酶活力的影響

2.2.3 rSC-2熱穩(wěn)定性分析

將最適反應(yīng)體系置于各溫度水浴中20 ℃–70 ℃放置1 h后測(cè)定其剩余活性。由圖4B可以看出，rSC-2在低溫時(shí) (0 ℃?30 ℃) 的穩(wěn)定性較好，酶活損失較少，剩余酶活都在80%以上。30 ℃以后，隨著溫度升高，酶活下降較快，70 ℃時(shí)剩余酶活殘留約45%，rSC-2適宜低溫保存。

2.2.4 pH對(duì)rSC-2活性的影響

分別將各pH反應(yīng)體系置于60 ℃水浴中測(cè)定不同pH對(duì)rSC-2活性的影響。結(jié)果如圖4C所示，rSC-2的最適反應(yīng)pH為7.0時(shí)，酶活最高，在pH為7.5時(shí)，酶活較高，剩余酶活在90%以上。

2.2.5 rSC-2的pH穩(wěn)定性

將重組酶SC-2與不同pH緩沖液充分混合稀釋后，置于30 ℃孵育1 h，在最適條件下測(cè)量剩余酶活。結(jié)果如圖4D所示，在pH為6.5?8.0時(shí)具有較高的酶活，酶的穩(wěn)定性比較好，pH 7.5時(shí)酶具有最好的保藏穩(wěn)定性。

2.2.6 金屬離子對(duì)rSC-2活性的影響

在反應(yīng)體系中加入適量金屬離子緩沖液，使金屬離子終濃度分別為1 mmol/L、5 mmol/L，最適溫度孵育3 min，反應(yīng)5 min測(cè)量酶活。不同金屬離子對(duì)rSC-2活性影響的差異較大，結(jié)果如表1所示，金屬離子終濃度1 mmol/L時(shí)，Ca2+對(duì)rSC-2的活性有一定促進(jìn)作用，Mn2+、Na+、K+、Mg2+對(duì)rSC-2活性影響不大，Zn2+、Fe3+、Co2+、Ba2+對(duì)rSC-2活性有不同程度的抑制作用。金屬離子終濃度為5 mmol/L時(shí)，各金屬離子對(duì)rSC-2活性都有不同程度的抑制作用，F(xiàn)e3+、Co2+、Ba2+對(duì)rSC-2活性影響最大，實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)不到酶活 (表1)。

表1 金屬離子對(duì)漆酶活性影響

3 討論

細(xì)菌漆酶于1993年首次從植物根際細(xì)菌生脂固氮螺菌中被發(fā)現(xiàn)。自此，不斷有新的細(xì)菌漆酶被報(bào)道。已有研究顯示，漆酶活性蛋白在細(xì)菌中廣泛存在，且已經(jīng)從真細(xì)菌[16-17]、古細(xì)菌[18]、放線菌[19]等微生物中克隆并表達(dá)獲得了相應(yīng)的細(xì)菌漆酶活性蛋白。然而，至今未見(jiàn)有對(duì)黏細(xì)菌漆酶序列生物信息學(xué)分析和酶學(xué)性質(zhì)研究的報(bào)道。我們利用生物信息學(xué)方法結(jié)合基因人工合成技術(shù)，篩選黏細(xì)菌漆酶序列并實(shí)現(xiàn)其在中異源表達(dá)，能為深入理解細(xì)菌漆酶的功能，以及促進(jìn)其在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

Blast方法是基于啟發(fā)式算法尋找進(jìn)化上親緣關(guān)系較近、全局高度相似的序列，是最常用的序列相似性比對(duì)工具；隱馬爾可夫模型是一個(gè)動(dòng)態(tài)的模型，可以通過(guò)訓(xùn)練識(shí)別同一特征的蛋白質(zhì)序列，更加準(zhǔn)確地獲得進(jìn)化上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)但具有保守特征的序列，基于隱馬爾可夫模型的方法越來(lái)越多地用在生物信息學(xué)中。我們分別用Blast和HMMER的方法對(duì)黏細(xì)菌進(jìn)行了全蛋白質(zhì)組的比對(duì)，從13個(gè)黏細(xì)菌蛋白質(zhì)組篩選獲得30個(gè)漆酶活性蛋白候選序列，且兩種方法獲得的序列完全相同，由于這兩種方法完全獨(dú)立，因此也說(shuō)明獲得的序列可信度較高。

Kües等對(duì)來(lái)自6個(gè)真菌基因組的45個(gè)多銅氧化酶序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，這些序列聚類(lèi)為6個(gè)亞家族，包括漆酶亞家族1 (Laccase sensustricto subfamily 1)、漆酶亞家族2 (Laccase sensustricto subfamily 2)、真菌鐵基氧化酶亞家族 (Fungal ferroxidases)、鐵基氧化酶/漆酶亞家族 (Ferroxidase/laccase)、真菌色素多銅氧化酶亞家族 (Fungal pigment MCOs) 以及真菌抗壞血酸氧化酶 (Fungal ascorbate oxidases)，這些蛋白在微生物中發(fā)揮不同的生理功能，如參與木質(zhì)素的分解、菌絲體的發(fā)育、對(duì)植物的致病性等[20]。與Kües等的結(jié)果類(lèi)似，我們對(duì)獲得的30個(gè)黏細(xì)菌來(lái)源多銅氧化酶序列的生物信息學(xué)分析顯示，其可分為4個(gè)類(lèi)別 (Ⅰ–Ⅳ)，且同物種來(lái)源的多銅氧化酶序列一致性較低；同時(shí)，潛在黏細(xì)菌漆酶序列的4個(gè)銅離子結(jié)合區(qū)序列之間和底物結(jié)合區(qū)序列之間也存在差異，暗示其在黏細(xì)菌中也可能發(fā)揮不同的生理功能。

為了了解黏細(xì)菌漆酶功能，掌握其酶學(xué)性質(zhì)，選取不同類(lèi)別來(lái)源共計(jì)9個(gè)序列進(jìn)行基因合成，并構(gòu)建重組酶大腸桿菌表達(dá)體系。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有7個(gè)重組蛋白具有催化丁香醛連氮氧化活性，其中rSC-2具有最高活性，rSC-1次之。丁香醛連氮被認(rèn)為是鑒別漆酶與酪氨酸酶等的專(zhuān)一性底物。因此，rSC-2和rSC-1可被認(rèn)為是細(xì)菌漆酶。同時(shí)，以結(jié)構(gòu)信息已知的真菌漆酶為參考，全序列比對(duì)結(jié)果表明，分布于類(lèi)別Ⅱ中的潛在黏細(xì)菌漆酶與真菌漆酶的序列相似性最高 (圖2)。因此，選擇歸類(lèi)于類(lèi)別Ⅱ的rSC-2進(jìn)行深入研究。

一般情況下，真菌來(lái)源漆酶催化酚類(lèi)底物氧化的最適pH在5.0左右，當(dāng)催化pH高于7.0時(shí)，酶活力迅速降低[21-23]；而細(xì)菌來(lái)源漆酶通常在pH 7.0左右具有最適的催化活力[24-25]。對(duì)rSC-2酶學(xué)性質(zhì)的初步分析表明，與其他細(xì)菌來(lái)源漆酶蛋白類(lèi)似，rSC-2擁有中性偏堿的最適催化pH (7.0?7.5)。然而，與rSC-2不同，來(lái)自牛瘤胃微生物元基因組文庫(kù)的細(xì)菌漆酶RL5[26]催化丁香醛連氮的最適pH為4.5。另外，rSC-2具有較好的耐熱性，在60 ℃水浴1 h，殘留55%活性，高于海洋來(lái)源細(xì)菌漆酶Lac15 (45℃半衰期為72 min)[11]，但低于枯草芽孢桿菌來(lái)源細(xì)菌漆酶CotA[27]?？傊?，對(duì)rSC-2酶學(xué)性質(zhì)的初步研究表明，對(duì)于某些偏堿性的工業(yè)廢水如造紙和染料廢水等，使用真菌漆酶處理時(shí)活性較低，rSC-2可能具有較好的應(yīng)用潛力。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Bioinformatic analysis and characterization of myxobacteria laccase-like multicopper oxidases

Xiuyan Zhao1,2, Fei Chang1,2, Zemin Fang1,2, Yinliang Zhang1,2, and Yazhong Xiao1,2

1 School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230601, Anhui, China 2 Anhui Provincial Engineering Technology Research Center of Microorganisms and Biocatalysis, Hefei 230601, Anhui, China

Laccase is a widely-used environment-friendly copper-containing oxidase found in many plants, insects and fungi. Recently, more and more laccases are also found in bacteria. Myxobacteria are an important bacteria resource. However, myxobacteria are much more difficult to isolate and purify than other bacteria. We used bioinformatic approach to screen myxobacteria proteomes available in NCBI. Based on conserved sequences of four copper binding sites in multicopper oxidase, 30 potential laccase sequences were obtained. Among them, nine genes were synthesized and expressed inBL21 (DE3). Seven proteins showed laccase activity when tested with traditional laccase substrates. One protein, named rSC-2, was chosen for further research because it exhibited the highest activity towards 2,6-dimethyl phenol (DMP). The molecular weight of rSC-2 was 57 kDa. Its specific activity to DMP was 0.27 U/mg. The optimal temperature and the optimal pH were 60 ℃ and 7.0, respectively. About 50% of the original activity was retained after incubation at 60 ℃ and pH 7.0?8.0 for 1 h. Metals showed different effects on rSC-2. rSC-2 activity was enhanced by several metalsat concentration of 1 mmol/L, such as Ca2+and Mn2+. With a higher concentration of 5 mmol/L, the activity of rSC-2 was apparently inhibited. This is the first report of bioinformatics screening myxobacteria laccases in combination with expression in

bioinformatics, myxobacteria laccase, recombinant expression, separation and purification, enzymology characterization

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31600078).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31600078) 資助。

September 23, 2016; Accepted: January 3, 2017

Yinliang Zhang. Tel/Fax: +86-551-63861929; E-mail: ylzhang@ahu.edu.cn Yazhong Xiao. Tel/Fax: +86-551-63861929; E-mail: yzxiao@ahu.edu.cn