付新華, 劉國寧, 何健龍, 馬元慶, 宋秀凱, 孟 麗, 賈青妹

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山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水微生物群落多樣性分析

付新華1, 劉國寧2, 何健龍3, 馬元慶3, 宋秀凱3, 孟 麗1, 賈青妹1

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 山東濰坊261053; 2. 濰坊市海洋環(huán)境監(jiān)測中心站, 山東濰坊261041; 3. 山東省海洋環(huán)境與資源研究院, 山東煙臺 264006)

海洋微生物在生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)中發(fā)揮重要作用。為系統(tǒng)了解山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)表層海水微生物群落多樣性, 作者利用Illumina高通量測序及生物信息學(xué)分析技術(shù)研究了12個水體樣本的菌群構(gòu)成和多樣性特征。實驗結(jié)果表明, 山東渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水微生物群落豐富, 12個水體樣品OTU分屬于25門、56綱、103目、163科、227屬; 門、綱、目、科、屬分類等級上的優(yōu)勢類群分別為變形菌門(Proteobacteria)(57.95%)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)(21.88%)、黃桿菌目(Flavobacteriales) (4.31%)、紅細(xì)菌Rhodobacteraceae)(10.68%)、(7.94%); 保護(hù)區(qū)內(nèi)表層海水微生物具有其獨特的菌群特征和多樣性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步認(rèn)識海洋微生物多樣性與海洋生態(tài)環(huán)境保護(hù)的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

渤海海洋保護(hù)區(qū); 微生物群落; 多樣性分析

海洋微生物的種類繁多, 包括細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌等, 物種數(shù)高達(dá)2億~10億[1], 它們在生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)和生物活性物質(zhì)開發(fā)中都發(fā)揮重要作用。因此, 海洋微生物研究已成為當(dāng)今的一大熱點, 并涉及環(huán)境、生態(tài)、醫(yī)藥等多個領(lǐng)域。王家生等[2]分析了海洋極端環(huán)境微生物活動與油氣資源的關(guān)系; 余玥[3]研究了深海極端微生物正青霉(sp.)的化學(xué)成分。許多研究人員還從海洋微生物中分離得到多種糖類、肽類、甾醇類等具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等作用的活性物質(zhì)[4-6]。海洋微生物多樣性研究對了解群落結(jié)構(gòu)間的動態(tài)變化及其生態(tài)功能、修復(fù)海洋生態(tài)系統(tǒng)以及微生物資源的合理開發(fā)均具有重要意義。

Y市魔芋種植歷史悠久，是魔芋產(chǎn)地、粗加工及魔芋精粉配送的中心位置，被譽(yù)為“魔芋之鎮(zhèn)”。2014年，Y市還被中國魔芋協(xié)會評為全國九大“魔芋工業(yè)基地”之一，并且獲得了“農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志”的稱號。多年來，Y市當(dāng)?shù)剞r(nóng)科院、加工企業(yè)與省市技術(shù)部門合作，開展了一系列有關(guān)魔芋的種植研究，包含魔芋高產(chǎn)新品種的選育、主要病害生態(tài)學(xué)及綜合防治技術(shù)研究等，使得Y市魔芋種植技術(shù)處于領(lǐng)先地位，科技含量高。

傳統(tǒng)的海洋微生物多樣性研究方法如平板培養(yǎng)法、核酸分子RFLP、DGGE等方法, 極大地促進(jìn)了海洋微生物生態(tài)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。但是這些方法僅能測定海水中的部分微生物種類, 而且靈敏度不夠高。高通量測序, 如454 Life Sciences公司及Illumina公司的第二代測序技術(shù)以及其他的單分子測序技術(shù)等, 以同時對上萬的基因位點進(jìn)行分析為特色, 具有大規(guī)模平行測序、進(jìn)行定量等優(yōu)點, 越來越多地用于基因組分析, 涉及基因測序和基因組學(xué)研究等多個方面[7-8]。而Illumina測序技術(shù)又具有低錯誤率和低成本的優(yōu)點, 使得簡單、快速、較準(zhǔn)確地獲取海水微生物信息成為可能。16S rDNA是原核生物基因組中的高保守性和高特異性的DNA序列, 對其進(jìn)行序列分析已成為檢測和鑒定微生物的重要手段[9]。16S rDNA由保守區(qū)和高變區(qū)組成, 利用高變區(qū)可進(jìn)行物種多樣性分析[10]。對擴(kuò)增后的16S rDNA高變區(qū)進(jìn)行高通量測序避免了海洋微生物難純培養(yǎng)等的困擾, 可使操作簡單、分析全面而準(zhǔn)確。

渤海為中國唯一內(nèi)海, 資源豐富, 其中漁業(yè)、港口、石油、旅游和海鹽是渤海的五大優(yōu)勢資源, 但是近封閉的內(nèi)海特征使得其水體交換能力很差。作為黃河、遼河、海河三大水系的匯聚地, 環(huán)渤海區(qū)域在經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展的同時, 其海區(qū)亦飽受污染事故的影響。海洋污染對海洋生物生存造成嚴(yán)重危害, 并影響了其生物多樣性[11]。雖為中國重要海域, 但是對渤海海洋微生物資源研究較少, 且主要集中在海洋沉積物微生物上[12-14]; 而海水微生物則鮮有報道, 僅限于采用非高通量測序方法的研究[15-16]。是以保護(hù)海洋自然環(huán)境為目的, 依法對具有特殊保護(hù)價值的海域、海岸、河口、島嶼等劃出一定面積予以特殊保護(hù)和管理的海洋相關(guān)區(qū)域。本研究采用Illumina Miseq 測序平臺, 研究了山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水微生物群落多樣性, 本研究結(jié)果將對該海域生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)修復(fù)和微生物資源的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況、海水樣品采集與微生物收集

山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)位于山東省渤海區(qū)境內(nèi), 是為保護(hù)貝類、魚類等重點保護(hù)對象、有關(guān)部門在山東省渤海區(qū)海域設(shè)立的海洋保護(hù)區(qū)。作者于2014年秋季在保護(hù)區(qū)內(nèi)選取了12個采樣點, 采樣點位置見圖1, 取每個點的表層海水1 L, 封存后立即運往實驗室供實驗分析用。取樣及封存方法根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB17378.3-2007。

水樣先進(jìn)行過濾以除去水體中的大顆粒, 再用0.22 μm微孔濾膜抽濾, 將濾膜有菌面對折后用無菌錫箔紙包住, 裝于滅菌袋中, 標(biāo)記好后置于–20℃保存。

[8] Mardis E R. Next-generation DNA sequencing methods[J]. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2008, 9: 387-402.

水體微生物DNA提取采用水樣DNA提取試劑盒(OMEGA), 提取步驟參照說明書。提取后的微生物DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 凝膠成像系統(tǒng)分析DNA提取的結(jié)果, 符合實驗需求的基因組–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別用16sFF/16sFR、V3F/V3R和V4F/V4R 3對引物, 對水體微生物DNA的16S rDNA全長、V3高可變區(qū)、V4高可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 引物序列見表1。對純化后質(zhì)量合格的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA文庫的構(gòu)建, 用合格的文庫進(jìn)行Illumina Paired-end測序。

表1 用于PCR反應(yīng)的3對引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理與信息分析

高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)濾除低質(zhì)量的序列。使用FLASH軟件[17]進(jìn)行序列拼接, 利用重疊關(guān)系將成對讀段(reads)拼裝成高變區(qū)的序列標(biāo)簽(Tags)。利用USEARCH軟件[18]將拼接好的Tags經(jīng)過優(yōu)化后, 在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的操作單元(OTU)。通過OTU與數(shù)據(jù)庫比對, 進(jìn)行物種注釋和OTU的物種分類。計算常用的α生物多樣性指數(shù): Chao、ACE、Simpson和Shannon指數(shù), 分析微生物群落的多樣性, 通過稀疏度分析樣品的測序深度; 并采用QIIME 進(jìn)行主成分分析(PCoA), 分析不同樣品微生物多樣性的差異[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體微生物16S rDNA全長、V3高變區(qū)、V4高變區(qū)擴(kuò)增

12個海水微生物樣本的總基因組DNA分別用3對引物擴(kuò)增16S rDNA、V3高變區(qū)、V4高變區(qū)結(jié)果顯示: 對于16S rDNA的擴(kuò)增, 所得單一產(chǎn)物長度在1 000~2 000 bp, 條帶清晰規(guī)則較亮, 即濃度較高; 對于V3高變區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶近似彌散, 且條帶較暗, 即濃度較低; 而對于V4高變區(qū)的擴(kuò)增, 所得單一產(chǎn)物長度在250~500 bp, 條帶清晰規(guī)則較亮, 即濃度較高。綜上結(jié)果, 選取V4高變區(qū)進(jìn)行高通量測序。

2.2 高通量測序原始數(shù)據(jù)處理

對山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)12個水體微生物樣本進(jìn)行高通量測序, 共得到312 451條reads, 平均每個樣品26 037條, SD值為209; 共拼裝獲得310 330條Tags, 平均每個樣品25 860條, SD值為214; 共產(chǎn)生676個OUT。每個樣品OTU統(tǒng)計結(jié)果見表2。

建筑施工行業(yè)是一個勞動密集型的產(chǎn)業(yè)，機(jī)械化水平較低，施工過程中需要依靠大量的工人參與手工作業(yè)，無法像工廠一樣大規(guī)模生產(chǎn)出標(biāo)準(zhǔn)化的產(chǎn)品，不可避免地會產(chǎn)生一些缺陷或偏差。

表2 樣品OTU統(tǒng)計

[7] 王興春, 楊致榮, 王敏, 等. 高通量測序技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 中國生物工程雜志, 2012, 32(1): 109-114. Wang Xingchun, Yang Zhirong, Wang Min, et al. High-throughput sequencing technology and its application[J]. China Biotechnology, 2012, 32(1): 109-114.

通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對, 對OTU進(jìn)行物種分類, 并分別在門、綱、目、科、屬5個分類等級水平上對各個樣品作微生物物種構(gòu)成柱狀圖。圖2~圖6顯示了各樣品在不同分類等級上的物種構(gòu)成狀況, 從圖中可以直觀看出不同物種在每個樣品中所占的比例。門分類等級畫所有物種的柱狀圖, 從綱分類等級開始, 將物種豐度在所有樣品均低于0.5%的物種全部合并成其他(Others)。12個水體樣品所有OTU分屬于25門, 56綱, 103目, 163科, 227屬。

2.3.1 門

總體上看, 12個水體樣品內(nèi)共有來自25個菌門的微生物種系型被鑒定出來, 微生物群落多樣性樣品間存在差異。在門水平, 水體內(nèi)平均相對豐度處在前10位的微生物門類依次為變形菌門(Proteobacfteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、泉古菌(Crenarchaeota)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(Planctomycetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)、厚壁菌門(Firmicutes)和脫鐵桿菌門(Deferribacteres, SAR406); 平均相對豐度大于1%的有6種, 其中變形菌門(Proteobacteria)豐度高達(dá)57.95%, 擬桿菌門(Bacteroidetes)達(dá)15.79%, 藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)達(dá)11.27%, 放線菌門(Actinobacteria)達(dá)6.62%, 泉古菌門(Crenarchaeota)達(dá) 3.70%, 疣微菌門(Verrucomicrobia)達(dá)1.34%; 其他菌門平均豐度在1%以下。各樣品在門分類等級上的微生物組成見圖2。

2.3.2 綱

各樣品在綱分類等級上的微生物組成見圖3。12個水體樣品中共檢測到微生物56綱, 其中物種豐度在所有樣品中平均高于0.5%的共有19個。平均相對豐度大于10%的綱分別是α-變形菌綱(Alphaproteobacteria) (21.88%)、g-變形菌綱(Gammaproteobacteria)(19.75%)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)(14.31%)和β-變形菌綱(Betaproteobacteria)(10.93%)。

2.3.3 目

②螺栓在下降的過程中，首扣出現(xiàn)了磕碰，造成了螺紋凸出螺紋表面，在旋入的過程中不斷把螺牙上的材料帶下來最終超過擰入的力矩保護(hù)值。咬死螺栓拆除后發(fā)現(xiàn)首扣螺紋有變形。

[10] 劉朝軍. 16SrDNA 序列測定在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用[J]. 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報, 2011, 32(7): 774-776. Liu Zhaojun. Application of 16SrDNA sequencing for identification of bacteria[J]. J Chinese PLA Postgrad Med Sch, 2011, 32(7): 774-776.

2.3.4 科

通過安裝預(yù)應(yīng)力波紋管（見圖2），可以對孔道進(jìn)行保護(hù)，防止預(yù)應(yīng)力鋼筋束在穿束過程中對混凝土結(jié)構(gòu)造成損壞。固定塑料波紋管時，應(yīng)先在箍筋上確定預(yù)應(yīng)力曲線的具體的位置，然后通過鋼筋馬凳進(jìn)行支托，間隔為700mm，然后通過焊接將支托的鋼筋固定在箍筋上。為了保證塑料波紋管的施工的效果，避免在澆筑混凝土的過程中產(chǎn)生偏移，塑料波紋管和支托的鋼筋的固定必須牢固。

12個水體樣品中有微生物163科, 物種豐度在所有樣品平均高于0.5%的共有32個。相對豐度最大的5個科所占比例總和達(dá)36.6%, 分別是紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)(10.68%); 嗜甲基菌科(Methylophilaceae) (9.50%); 鹽單胞菌科(Halomonadaceae) (7.96%); 彎曲菌科(Campylobacteraceae)(4.31%)和OM60(4.15%)。各樣品在科分類等級上的微生物組成見圖5。

2.3.5 屬

各樣品在屬分類等級上的微生物組成見圖6。12個水體樣品中含有微生物227屬, 物種豐度在所有樣品平均高于0.5%的共有22個。相對豐度最大的5個屬所占比例總和達(dá)23.23%, 分別是(7.94%)、(4.72%)、弓(形)桿菌屬()(4.31%)、亞硝化侏儒菌屬() (3.69%)和海洋生菌屬()(2.57%)。

[9] Kolbert C P, Persing D H. Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens [J]. Curr Opin Microbiol, 1999, 2(3): 299-305.

選擇底物質(zhì)量濃度、酶添加量、酶解溫度、酶解時間作為考查因素。底物質(zhì)量濃度設(shè)置為10，20，30，40，50，60 mg/mL；酶添加量設(shè)置為 0.5×105，1×105，2×105，8×105，14×105，20×105U/mg；酶解溫度設(shè)置為40，45，50，55，60，65℃；酶解時間設(shè)置為1，2，3，4，5，6 h。每個設(shè)計做3個平行樣取其平均值進(jìn)行計算分析。

樣品的a多樣性分析見表3, 12個水體樣品chao平均值為410.68, ace平均值為417.67, shannon平均值為4.30, simpson平均值為0.0313, 樣品微生物多樣性較高。

對教師A的反思日志總結(jié)后，主要內(nèi)容有：學(xué)生專業(yè)特點、學(xué)生課堂表現(xiàn)、師生互動、教案中的課堂設(shè)計、教學(xué)方法、師生關(guān)系、對傳統(tǒng)課堂的反思。其中對學(xué)生專業(yè)特點和學(xué)生課堂參與度反思較多。

裂縫寬度也稱裂縫開度，開度決定了裂縫的規(guī)模，同時開度是裂縫物性參數(shù)計算中的關(guān)鍵參數(shù)，因此對裂縫開度的定性研究成為儲層裂縫的重要研究內(nèi)容。以肉眼能否識別為依據(jù)，裂縫的規(guī)模可簡單分為大裂縫和微裂縫兩種類型。一般大裂縫反映形成時期的構(gòu)造應(yīng)力場較強(qiáng)，微裂縫則相反，反映形成時期的構(gòu)造應(yīng)力場較弱［1］。本次研究主要通過野外露頭、巖心觀察對大裂縫進(jìn)行定量描述，通過薄片觀察對微裂縫進(jìn)行研究。

稀疏曲線用來評估所測序列庫容中環(huán)境微生物的種類和數(shù)量。樣品稀疏曲線顯示12條曲線已達(dá)到平臺期, 表明通過高通量測序技術(shù), 12個水體樣品中的微生物基本完全測出(圖7)。

[15] Zhang Jiaojiao, Ma Guannan, Deng Yuangao, et al. Bacterial diversity in Bohai Bay solar saltworks, China[J]. Current Microbiol, 2016, 72(1): 55-63.

3 討論

本研究利用Illumina Miseq測序平臺對山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水微生物群落特征和多樣性進(jìn)行了初步研究, 列出了保護(hù)區(qū)海水微生物門、綱、目、科、屬不同分類等級上的優(yōu)勢群落類型和相對豐度。雖然本次研究所采集海水樣本的數(shù)量及其分布范圍有限, 但是Illumina Miseq高通量測序技術(shù)的應(yīng)用為進(jìn)一步對山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)內(nèi)海水微生物資源的調(diào)查積累了一定的經(jīng)驗和新的技術(shù)支撐。本研究中, 12個樣品在遺傳距離0.03下的稀疏曲線已達(dá)到平臺期, 說明通過高通量測序技術(shù)測出的微生物包含了山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)內(nèi)水體樣品中微生物的絕大部分。微生物群落特征顯示, 山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)表層海水內(nèi)存在大量微生物群落, 并具有其獨特的菌群特征和多樣性。保護(hù)區(qū)內(nèi)表層海水微生物在門、綱、目、科、屬不同分類等級上的未分類OUT分別為0.40%、1.08%、11.89%、23.53%, 62.81%, 說明隨著分類的細(xì)化無明確分類名稱信息的群落類型所占比例增大, 這可能與測序區(qū)間、序列長度以及比對的數(shù)據(jù)庫等有關(guān)。

表3 樣品Alpha多樣性統(tǒng)計結(jié)果

本研究在山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)典型海域表層海水中共檢測出變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)等25門, 其中變形菌門是相對豐度最高的微生物類群, 這一結(jié)果與國內(nèi)外關(guān)于水體微生物多樣性的很多研究相一致[20-22]。對黃海表層海水微生物多樣性的研究報道顯示, 其水體微生物群落主要有變形菌門、擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門、疣微菌門、放線菌門和浮霉菌門[23]。渤海與黃海表層海水微生物組成在門分類等級水平上有較高的相似性, 這可能與兩者地理位置相近有關(guān)。微生物類群的相對豐度與其多樣性有關(guān), 研究中按97%相似性定義OTU是因為微生物群落并不僅僅是只含有少數(shù)高相對豐度的基因型, 而是含有大量相對獨特的基因型。

Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析[24], 包括observed species指數(shù)、chao指數(shù)、ace指數(shù), shannon指數(shù)以及simpson指數(shù)等。前面4個指數(shù)越大, 最后一個指數(shù)越小, 說明樣品中的物種越豐富。本研究中12個樣品chao平均值為410.68, ace平均值為417.67, shannon平均值為4.30, simpson平均值為0.0313, 表明渤海海洋保護(hù)區(qū)內(nèi)微生物多樣性較高。主坐標(biāo)分析(PCoA)可以展示樣品間微生物多樣性的差異大小, 如果兩個樣品距離較近, 則表示這兩個樣品的物種組成較相似。主坐標(biāo)分析圖中的一個點代表一個樣品, 兩個點之間的距離越近, 說明兩個樣品的微生物群落差異越小。本研究中12個取樣點, 除兩個取樣點外的其他取樣點水體微生物樣品不能聚集在一起, 說明渤海海洋保護(hù)區(qū)不同區(qū)域間微生物組成差異顯著。

水體污染會影響其微生物群落組成與多樣性[24-25]。渤海為中國內(nèi)海, 山東省渤海海洋保護(hù)區(qū)距離陸地較近, 海洋微生物會由于海水的有機(jī)物污染而獲得大量營養(yǎng)物質(zhì), 人類活動會影響微生物的群落組成及其多樣性。對渤海海水微生物多樣性的研究不僅有利于對其微生物群落結(jié)構(gòu)的了解, 而且有助于特殊功能微生物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。另外, 海水溫度、溶解氧和季節(jié)可能是影響渤海水體微生物群落結(jié)構(gòu)特征的重要因素。有研究表明, 海洋中微生物的組成及其多樣性與海水的溫度、季節(jié)、深度等環(huán)境條件相關(guān)[26-28]。2008年發(fā)生在黃海的滸苔災(zāi)害曾引起表層海水中a-變形菌和藍(lán)細(xì)菌的增加,g-變形菌綱和擬桿菌的減少[23]。因此, 有關(guān)溫度、溶解氧含量、浮游生物和季節(jié)等因素對渤海表層海水微生物分布和其群落結(jié)構(gòu)變化的影響, 有待深入研究。

[1] 張偲, 張長生, 田新朋, 等. 中國海洋微生物多樣性研究[J]. 生物多樣性保護(hù), 2010, 25(6): 651-657. Zhang Si, Zhang Changsheng, Tian Xinpeng, et al. Study of diversities of marine microbes in China[J]. Biodiversity Conservation, 2010, 25(6): 651-657.

[2] 王家生, 王永標(biāo), 李清. 海洋極端環(huán)境微生物活動與油氣資源的關(guān)系[J]. 地球科學(xué)-中國地質(zhì)大學(xué)學(xué)報, 2007, 32(6): 781-788. Wang Jiasheng, Wang Yongbiao, Li Qing. Potential relationship between extremophiles and hydrocarbon resources in marine extreme environment[J]. Earth Science-Journal of China University of Geosciences, 2007, 32(6): 781-788.

[3] 余玥. 深海極端微生物正青霉(sp.)化學(xué)成分[D]. 哈爾濱: 哈爾濱商業(yè)大學(xué), 2012: 1-60. Yu Yue. Chemical constituents ofsp. from deep-sea derived extremophile[D]. Harbin: Harbin University of Commerce, 2012: 1-60.

[4] 詹萍, 梁靜娟, 龐宗文. 產(chǎn)生物活性物質(zhì)海洋微生物的研究進(jìn)展[J]. 玉林師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)), 2007, 28(3): 71-74. Zhan Ping, Liang Jingjuan, Pang Zongwen. Development of study on marine microbe bioactive substance[J]. Journal of Yulin Teachers College(Natural Science), 2007, 28(3): 71-74.

(3) 動物園的安全警示是否充足。根據(jù)城市動物園管理規(guī)定第三章第二十一條：動物園管理機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)完善各項安全設(shè)施，加強(qiáng)安全管理，確保游人、管理人員和動物的安全。動物園方應(yīng)該設(shè)置足夠多且位于醒目位置的警示牌、在危險區(qū)域安排足夠多的巡邏車、安裝數(shù)量充足的監(jiān)控攝像頭保證二十四小時的不停歇監(jiān)控, 在發(fā)現(xiàn)游客有危險舉動時應(yīng)立即上前勸阻與阻攔。

2.相關(guān)政策章程的頒布及試點工作方案的細(xì)化，為試點工作制定了基本規(guī)范。2017年5月17日，財政部《關(guān)于在糧食主產(chǎn)省開展農(nóng)業(yè)大災(zāi)保險試點的通知》發(fā)布以來，各地、各糧食主產(chǎn)省、各試點縣更為具體的試點方案細(xì)則紛紛出臺。其中，糧食大省山東于2017年6月24日率先出臺了《山東省農(nóng)業(yè)大災(zāi)保險試點工作方案》。相關(guān)政策細(xì)則相繼頒布，各地因地制宜地推出的地方性、區(qū)域性、個性化、特色化的農(nóng)業(yè)大災(zāi)保險試點工作方案，使農(nóng)業(yè)大災(zāi)保險的發(fā)展有章可循。

[5] 張清麗, 顧謙群, 崔承彬, 等. 海洋來源的放線菌次級生物代謝產(chǎn)物及其生物活性[J].中國海洋藥物, 2004, 23(5): 49-54.Zhang Qingli, Gu Qianqun, Cui Chengbin, et al. Secondary metabolites of marine-derived actinomycete microbes and their bioactivities[J]. Chin J Mar Drugs, 2004, 23(5): 49-54.

[6] 張亞鵬, 朱偉明, 顧謙群, 等. 源于海洋真菌抗腫瘤活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中國海洋藥物, 2006, 25(1): 54-58. Zhang Yapeng, Zhu Weiming, Gu Qianqun, et al. Advances in studies of antitumor compounds from marine fungi[J]. Chin J Mar Drugs, 2006, 25(1): 54-58.

2.3 水體微生物群落結(jié)構(gòu)

1.2 微生物DNA提取、擴(kuò)增和高通量測序

(1)通過鉆探、測井、二維地震三種勘探手段對比分析，查明了QN-06V井目的煤層(3號)缺失的原因為構(gòu)造(F4正斷層)斷失。

2.4 水體微生物多樣性指數(shù)

各樣品在目分類等級上的微生物組成見圖4。12個水體樣品中包含微生物103目, 其中物種豐度在所有樣品平均高于0.5%的共有30個。相對豐度大于5%的目分別是黃桿菌目(Flavobacteriales)(14.31%)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)(10.07%)、嗜甲基菌目(Methylophilales)(9.50%)和交替單胞菌目(Alteromonadales)(7.39%)

[11] 申丹, 焦琳琳, 常禹, 等. 黃海和渤海沿海地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)健康評價[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2015, 34(8): 2362-2372. Shen Dan, Jiao Linlin, Chang Yu, et al. Ecosystem health assessment of Yellow Sea and Bohai coastal areas[J]. Chinese Journal of Ecology, 2015, 34(8): 2362- 2372.

[12] Wang Liping, Zheng Binghui, Lei Kun. Diversity and distribution of bacterial community in the coastal sediments of Bohai Bay, China [J]. Acta Oceanologica Sinica, 2015, 34(10): 122-131.

[13] Liu Jiwen, Liu Xiaoshou, Wang Min, et al. Bacterial and archaeal communities in sediments of the north chinese marginal seas [J]. Microbial Ecology, 2015, 70: 105-117.

[14] Yang Fenglong, Yang Jingshui, Deng Chunping, et al. Bacterial communities and their hydrocarbon bioremediation potential in the Bohai Sea, China[J]. Marine Ecology Progress Series, 2015, 538: 117-130.

使用主坐標(biāo)分析(PCoA)的方法展示12個水體樣品間微生物多樣性的差異大小。主成分PC1和次要成分PC2分析結(jié)果見圖8。由圖可見多數(shù)樣品點之間距離較遠(yuǎn), 表明組間差異顯著。主成分分析結(jié)果顯示, PC1貢獻(xiàn)度為49.45%, PC2貢獻(xiàn)度為20.09%, 除5號和6號取樣點外的其他取樣點水體微生物樣品不能聚集在一起, 說明樣品間水體微生物組成有差異。

[16] Sun Jinsheng, Guo Fei, Geng Xuyun, et al. Seasonal changes and diversity of bacteria in Bohai Bay by RFLP analysis of PCR-amplified 16S rDNA gene fragments[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011, 27(2): 275-284.

[17] Magoc T, Salzberg S. FLASH: Fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies[J]. Bioinformatics, 2011, 27(21): 2957-2963.

[18] Edgar R C. UPARSE: Highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J]. Nature Methods, 2013, 10(10): 996-998.

[19] Patrick D S, Sarah L W. Introducing mothur: open-source,platform- independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities[J]. Appl Environ Microbiol , 2009, 75(23): 7537-7541.

[20] Sogin M L, Morrison H G, Huber J A. Microbial diversity in the deep sea and the underexplored “rare biosphere” [J]. PNAS, 2006, 103(32): 12115-12120.

一路上周大國都在說毛主任業(yè)務(wù)能力突出，為人謙恭，醫(yī)德高尚等。秦明月突然說：“我聽說前段時間有患者家屬找他鬧事，是怎么一回事??？”

[21] Murray A E, Grzymski J J. Diversity and genomics of antarctic marine micro-organisms[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2007, 362(1488): 2259-2271.

[22] Zeng Y X, Zou Y, Grebmeier J M. Culture-independent and-dependent methods to investigate the diversity of planktonic bacteria in the northern Bering Sea[J]. Polar Biology, 2012, 35(1): 117-129.

From the perspective of TCM theory,this could be explained as the occurrence of more severe spleen-kidney Yang deficiency and liver-Qi stagnation leading to the appearance of a greater number of corresponding symptoms and a more severe degree of male infertility.

[23] Guo Cong, Li Fuchao, Jiang Peng, et al. Bacterial diversity in surface water of the Yellow Sea during and after a green alga tide in 2008 [J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2011, 29(6): 1147-1154.

[24] Beazley M J, Martinez R J, Rajan S. Microbial community analysis of a coastal salt marsh affected by the deepwater horizon oil spill[J]. PLoS One, 2012, 7(7): 1-13.

[25] 李磊, 蔣玫, 沈新強(qiáng), 等. 長江口及鄰近海域水體中石油烴分布特征及其污染評價[J]. 環(huán)境化學(xué), 2014, 33(8): 1366-1372.Li Lei, Jiang Mei, Shen Xinqiang, et al. Spatial distribution and pollution analysis of the petroleum hydrocarbons in water from the Changjiang Estuary and its adjacent areas[J]. Environmental Chemistry, 2014, 33(8): 1366-1372.

[26] 白佳玉, 馬學(xué)廣. 中國海洋入侵種的大海洋生態(tài)系空間分布[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2015, 34(23): 347-353. Bai Jiayu, Ma Xueguang. Spatial distribution of marine invasive species in the large marine ecosystems of China[J]. Marine Environmental Science, 2015, 34(23): 347-353.

道路交通水泥路面混凝土質(zhì)量是行業(yè)發(fā)展競爭的關(guān)鍵，在施工中應(yīng)該思考科學(xué)有效的施工質(zhì)量管理理論與方法，將技術(shù)內(nèi)容付諸于管理與施工切實行為中實現(xiàn)，為公路建設(shè)建立基于全面質(zhì)量管理的完善化質(zhì)量保證體系。

[27] 劉曉輝, 王健鑫, 王帥兵, 等. 長江口及鄰近海域表層海水細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)[J]. 海洋與湖沼, 2015, 46(6): 1531-1541. Liu Xiaohui, Wang Jianxin, Wang Shuaibing, et al. Bacterial diversity and community structure in surface seawater of Changjiang River estuary and adjacent areas[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2015, 46(6): 1531-1541.

[28] Ning X, Lin C, Su J. Long-term changes of dissolved oxygen, hypoxia, and the responses of the ecosystems in the East China Sea from 1975 to 1995[J]. Journal of Oceanography, 2011, 67(1): 59-75.

Analysis ofmicrobial communitydiversity in the Bohai Sea marine protected areas of the Shandong Province

FU Xin-hua1, LIU Guo-ning2, HE Jian-long3, MA Yuan-qing3, SONG Xiu-kai3, MENG Li1, JIA Qing-mei1

(1. Weifang Medical University, Weifang 261053, China; 2. Weifang Marine Environment Monitoring Centre, Weifang 261041, China; 3. Shandong Marine Resource and Enviroment Research Institute, Weifang 264006, China)

Marine microbes play an essential role in marine ecosystems. To systematically understand microbial community diversity in the Bohai Sea marine protected areas of the Shandong Province, we investigated the microbial community composition and diversity of 12 water samples using the Illumina high-throughput sequencing and bioinformatics analysis technology. Results for the 12 sampling points showed that the number of relative microbial groups included 25 phyla, 56 classes, 103 orders, 163 families, and 227 genera. Dominant groups at the phylum, class, order, family and genus classification levels were Proteobacteria (57.95%), Alphaproteobacteria (21.88%), Flavobacteriales (14.31%), Rhodobacteraceae (10.68%), and(7.94%), respectively. These findings suggest that Bohai Sea marine protected areas in the Shandong Province brine have high levels of microbial diversity. This diversity provides basic information and knowledge to further understand the relationship between marinemicrobial diversity andprotection ofoceanic environmentecology.

Bohai Sea marine protected areas; microbial community; diversity analysis

X55

A

1000-3096(2017)01-0039-09

10.11759//hykx20160329002

2016-03-29;

2016-04-27

山東省渤海海洋生態(tài)修復(fù)及能力建設(shè)項目(20140601); 山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖?7J12LE51); 山東省科技發(fā)展計劃項目(2014GSF117030); 濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃(2016ZJ1047)

付新華(1976-), 女, 山東茌平人, 副教授, 博士, 主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究, 電話: 0536-8462531, E-mail: wfyxyfxh@163.com

Mar. 29, 2016

[Ecological Restoration and Capacity Building Program for Bohai Sea of Shandong Province, No.20140601; The Project of Shandong Province Higher Educational Science and Technology Program , No.7J12LE51; Science and Technology Development Projects of Shandong Province, No.2014GSF117030; Weifang Science and Technology Development Plan, No.2016ZJ1047]

(本文編輯: 譚雪靜)