張明明, 王 雷, 王寶杰, 劉 梅, 戰(zhàn)文斌, 蔣克勇

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凡納濱對蝦堿性磷酸酶和酸性磷酸酶基因的克隆、表達(dá)及鹽度應(yīng)答效應(yīng)

張明明1, 3, 王 雷2, 3, 王寶杰2, 3, 劉 梅2, 3, 戰(zhàn)文斌1, 蔣克勇2, 3

(1. 中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 山東青島 266003; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室, 山東青島 266071; 3. 中國科學(xué)院實驗海洋生物學(xué)重點(diǎn)實驗室, 山東青島 266071)

本研究通過cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)首次克隆得到凡納濱對蝦()堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)基因的cDNA全長序列, 其中ALP基因全長序列1 910 bp, 編碼536個氨基酸; ACP基因全長序列1 544 bp, 編碼439個氨基酸。鹽度調(diào)控設(shè)3個鹽度組: 31(對照)、16和3。養(yǎng)殖45 d后, 熒光定量PCR測定對蝦肝胰腺、肌肉、胃、腸和鰓5個組織中的ALP和ACP 基因mRNA的表達(dá)情況。RT-PCR顯示, ALP基因在5個組織中普遍表達(dá), 在肝胰腺中表達(dá)量最高(<0.05), 腸道中的表達(dá)量最低(<0.05); ACP基因在5個組織中也均表達(dá), 在肝胰腺和鰓中表達(dá)量明顯高于其他3個組織(<0.05)。鹽度應(yīng)答實驗表明, 不同鹽度條件下, 不同組織中, ALP和ACP基因存在不同的表達(dá)模式。在胃和鰓組織中, ALP基因在31鹽度組的表達(dá)量顯著高于其他兩組(<0.05); 在肝胰腺和腸道中, ALP基因在16鹽度下的表達(dá)量明顯低于其他兩組(<0.05); 在肌肉中, ALP基因的表達(dá)與其他組織均不同, 31鹽度組表達(dá)量最高, 而16鹽度組最低(<0.05); 在肝胰腺中, ACP基因在31鹽度組的表達(dá)量明顯低于其他鹽度組(<0.05); 在肌肉和鰓兩個組織中, ACP基因在31鹽度下的表達(dá)量明顯高于其余兩個鹽度組(<0.05); 在腸道中, ACP基因的表達(dá)量在3鹽度組明顯高于其他兩組(<0.05); 而在胃中, ACP基因在3個鹽度下的表達(dá)量沒有顯著性差異。上述結(jié)果為研究低鹽條件下凡納濱對蝦的磷酸酶基因的變化機(jī)制提供了參考。

凡納濱對蝦(); ALP基因; ACP基因; 克隆表達(dá); 鹽度

凡納濱對蝦()俗稱南美白對蝦, 原產(chǎn)地為太平洋沿岸水域[1], 是廣鹽性的優(yōu)良蝦種。凡納濱對蝦具有生長迅速、出肉率高、抗病能力強(qiáng)、適于高密度養(yǎng)殖及對鹽度的適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn), 另外根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示, 自20世紀(jì)80年代初以來全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷增加, 越來越多的消費(fèi)者把蝦作為重要的蛋白質(zhì)來源[2], 對蝦在淡水、半咸水和海水中有著大規(guī)模的養(yǎng)殖[3], 其養(yǎng)殖區(qū)域也由沿海進(jìn)一步向著內(nèi)陸延伸[4]。

鹽度是對蝦養(yǎng)殖過程中重要的環(huán)境因子[5], 影響對蝦的滲透壓調(diào)節(jié)和能量收支等方面。有研究認(rèn)為凡納濱對蝦的等滲點(diǎn)在25附近[6]。目前的文獻(xiàn)研究得到的最適生長鹽度并不一致, Samocha[7]等研究認(rèn)為凡納濱對蝦生長的最適鹽度在2~8, Bray[8]等研究認(rèn)為最適生長鹽度在5~15; Ponce-Palafox[9]等研究認(rèn)為最適生長鹽度在33~40。朱春華[10]研究認(rèn)為鹽度14~22是凡納濱對蝦的最適生長鹽度, 環(huán)境鹽度為18時生長速度最快, 也有研究認(rèn)為15~25是凡納濱對蝦生長的理想鹽度范圍[4]。

磷酸酶(phosphatase)是一種正磷酸單酯酶, 能夠催化各種含磷化合物的水解反應(yīng), 根據(jù)他們起催化作用的最適pH不同, 可分為堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP), 它們是動物體內(nèi)解毒體系的重要組成, 并且在動物機(jī)體的骨化過程以及在磷化物和其他一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中都起著重要作用[11]。ALP廣泛存在于人體動物、植物和微生物中, 是生物代謝的重要酶類, 在堿性條件下的水解反應(yīng)外, 還可以參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng), 參與對蝦體內(nèi)能量的收支平衡。ACP來自于顆粒細(xì)胞的顆粒體, 是巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體的標(biāo)志酶, 是溶酶體的重要組成部分[12], 作為生物體內(nèi)重要的代謝酶和免疫酶, 主要參與磷酸酯的代謝, 與細(xì)胞的消化代謝[13]、自溶過程和免疫調(diào)節(jié)[14]有關(guān)。

目前, 對鹽度影響凡納濱對蝦ALP和ACP的研究多集中在鹽度突變和鹽度的長期效應(yīng)對ALP和ACP酶活力的影響, 而鹽度的長期效應(yīng)對于ALP基因和ACP基因表達(dá)的影響研究相對較少。本實驗通過研究鹽度的長期效應(yīng)對不同組織中ALP基因和ACP基因表達(dá)的影響, 旨在為凡納濱對蝦適應(yīng)低鹽度養(yǎng)殖的磷酸酶類分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

凡納濱對蝦取自膠南養(yǎng)殖場, 原養(yǎng)殖環(huán)境鹽度為31, 無外傷, 體色正常, 規(guī)格一致, 體長平均在8 cm左右。

1.2 實驗設(shè)計

實驗設(shè)置3個鹽度梯度, 分別是3、16和31, 以正常海水31作為對照組, 在1.5 m3養(yǎng)殖循環(huán)水箱中進(jìn)行。每缸放養(yǎng)90尾對蝦, 每個梯度設(shè)3個平行組。低鹽度組用正常海水和淡水進(jìn)行調(diào)節(jié), 以每天3的速率降低至16和3鹽度后正式開始實驗, 養(yǎng)殖周期45 d, 試驗期間水溫范圍為22~28℃, 每天換水1次, 換水量1/3, 吸污1次, 投餌2次。

1.3 樣品采集

各組在設(shè)定的鹽度中養(yǎng)殖45 d后取樣, 每組取對蝦3尾。分別取對蝦肝胰腺、肌肉、胃、腸、鰓5個組織, 放于1 mL RNAguard中, 上述樣品放于–80℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA提取和cDNA克隆

1.4.1 RNA的提取

取對照組31鹽度組的凡納濱對蝦肝胰腺, 利用上海飛捷生物技術(shù)有限公司總RNA極速抽提試劑盒提取總RNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.4.2 目的片段的克隆

用TransScript ? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA后–20℃冰箱保存。參照近緣蝦類ALP和ACP核苷酸序列, 用Primer Premier5設(shè)計性引物(表1)。片段克隆PCR反應(yīng): 94 ℃預(yù)變性5 min; 94℃ 30 s, 退火溫度30 s, 72℃ 60 s, 35個循環(huán); 72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物; Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)分析獲得目的條帶, 目的片段產(chǎn)物利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0進(jìn)行凝膠回收; 連接pEASY-T1載體; 轉(zhuǎn)化到Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞; 氨芐抗性固體培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng); 挑菌, 以氨芐抗性液體培養(yǎng)基培養(yǎng); 菌體PCR檢測; 陽性菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.4.3 基因全長的克隆

3′RACE: 以3′CDS為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板, 利用克隆得到的目的片段和Primer Premier5軟件設(shè)計特異性引物(表1), 利用特異性引物和UPM、NUP進(jìn)行巢式PCR(Nested-PCR)。電泳, DNA片段回收, 連接, 轉(zhuǎn)化, 測序方法同前。5′RACE: 5′RACE實驗參考孫姝娟等[15]的方法, 并對部分細(xì)節(jié)進(jìn)行了改動。以oligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板, 利用克隆得到的目的片段和Primer Premier5軟件設(shè)計特異性引物(表1)。在合成的cDNA末端加上polyC尾, 用接頭引物oligo(dG)-adaptor分別和基因特異性引物進(jìn)行Nested-PCR。電泳, DNA片段回收, 連接, 轉(zhuǎn)化, 測序方法同前。

1.5 基因序列分析

用ORF Finder (Open Reading Frame Finder)(http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)預(yù)測ORF和翻譯的蛋白序列。Prot-param (http: //web.expasy.org/protparam/)用于預(yù)測翻譯蛋白的理化特征分析。SingalP3.0Server (http: //www.cbs.dtu.dk/services/SingalP)尋找基因可能存在的信號肽序列, 使用NetPhos2.0 Server (http: // www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測磷酸化位點(diǎn), 使用NetNGlyc1.0 Server (http: //www.cbs.dtu.dk /services/ NetNGlyc/)預(yù)測糖基化位點(diǎn), Prosite(http: //prosite. expasy.org/)和采用SMART (http: //smart.embl-heidelberg. de/)用于預(yù)測蛋白功能結(jié)構(gòu)域。Swiss-model模型用于預(yù)測蛋白的高級空間結(jié)構(gòu)(http: //swissmodel.expasy. org)。BioEdit(http: //www.mbio.Ncsu.edu/BioEdit)軟件用于氨基酸的多序列比對。分子進(jìn)化樹構(gòu)建用MEGA4.0軟件。

表1 ALP和ACP基因克隆和熒光定量引物

1.6 熒光定量PCR

根據(jù)ALP和ACP的cDNA序列設(shè)計熒光定量引物(表1)。以β-actin為內(nèi)參基因, 檢測凡納濱對蝦在不同鹽度不同組織中ALP和ACP的表達(dá)水平。用TaKaRa SYBR Green Premix Ex TaqTM||試劑盒。在羅氏熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng), 實驗設(shè)3個重復(fù)。熒光定量采用兩步法, PCR程序: 94℃30s; 94℃5s, 退火30s, 40個循環(huán); 溶解。用2–ΔΔCt法處理各基因熒光定量所得數(shù)據(jù), 并分析擴(kuò)增效率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 進(jìn)行Duncan’s多重比較, 當(dāng)<0.05時, 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆及序列分析

2.1.1 凡納濱對蝦ALP基因全長克隆及序列分析

克隆得到凡納濱對蝦ALP cDNA全長序列1 910 bp(GenBank登錄號: R534873.1), 包括156 bp的非編碼區(qū)(Untranslated Region, URT), 143 bp的3’URT和1611的ORF。該基因編碼536個氨基酸, 預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為58.67 kDa, 等電點(diǎn)為5.02, 含有12個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、6個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)以及12個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)和3個糖基化位點(diǎn)。SMART預(yù)測凡納濱對蝦ALP的結(jié)構(gòu)域, 結(jié)果顯示, 第88~526位置的氨基酸為ALP的核心結(jié)構(gòu)域alkPPc(Alkaline phosphatase homologues), alkPPc是ALP蛋白家族所共有的結(jié)構(gòu)域(圖1A)。

2.1.2 凡納濱對蝦ACP基因全長克隆及序列分析

克隆得到凡納濱對蝦ACP cDNA全長序列1 544 bp (GenBank登錄號: KR676 449.1), 包括63 bp的非編碼區(qū)(Untranslated Region, URT), 161 bp的3′URT和1427的ORF。該基因編碼439個氨基酸, 預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為50.73 kDa, 等電點(diǎn)為5.15, 含有7個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、5個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)以及8個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)和5個糖基化位點(diǎn)。SMART和NCBI預(yù)測凡納濱對蝦ACP的結(jié)構(gòu)域, 結(jié)果顯示, 第230~429位置的氨基酸為ACP的結(jié)構(gòu)域MPP_PAPs (purple acid phosphatases of the metallophosphatase superfamily)(圖1B)。

2.2 空間結(jié)構(gòu)模擬

采用SWISS-MODEL軟件的同源建模方法, 分別將ALP蛋白序列和ACP蛋白序列與軟件搜索得到的模(PDB code: 1shq.1和PDB code: 2qfr.1), 人工進(jìn)行聯(lián)配, 以ALP和ACP推導(dǎo)的氨基酸構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)(圖2), ALP有42個α-螺旋, 58個β-折疊和111個β-轉(zhuǎn)角, ACP有8個α-螺旋, 30個β-折疊和50個β-轉(zhuǎn)角。

上面大寫字母為核苷酸序列, 下面字母為對應(yīng)的編碼的氨基酸序列; 起始密碼子(ATG)、終止密碼子(TAG)用加粗標(biāo)示; 絲氨酸、酪氨酸以及蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)分別用“□, =, _”標(biāo)示; alkPPc(ALP的結(jié)構(gòu)域)以及MPP_PAPS(ACP的結(jié)構(gòu)域)用灰色底紋標(biāo)示

Capital letters separated by spacesrepresent the coding sequence, with the nucleotide sequence above. The initiation codon(ATG) and the stop codon(TGA) arecharacterized in bold. Potential phosphorylation sitesof the Ser, Tyr and Thr are indicated by “□, =, _” respectively.The alkPPc domain and MPP_PAPS are shaded

2.3 多重比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

使用BioEdit軟件將已推導(dǎo)的ALP和ACP氨基酸序列和其他物種的ALP和ACP進(jìn)行多序列比對。經(jīng)過比對可知: 凡納濱對蝦ALP與濕木白蟻()、北方長額對蝦()的ALP氨基酸序列的一致性相對較高,可達(dá)到44%、46%, 與斑馬魚()、小鼠()、人()的一致性相對較低分別為37%、36%、36%(圖3); 凡納濱對蝦ACP氨基酸序列與致倦庫蚊()的ACP氨基酸序列的一致性較高可達(dá)到54%, 與果蠅()、小鼠、人的氨基酸序列一致性較低分別為12%、9%、8%(圖4)。

根據(jù)NCBI上已有的ALP和ACP氨基酸序列, 利用MEGA4.0軟件, 以鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明, 在無脊椎動物里, 凡納濱對蝦ALP與北方長額對蝦ALP遺傳距離較近聚成一支, 并且它們與濕木白蟻聚成了節(jié)肢動物獨(dú)立的一支, 其他物種和凡納濱對蝦ALP距離較遠(yuǎn)(圖5)。凡納濱對蝦ACP與羅氏沼蝦()ACP遺傳距離較近聚成了一支, 并且它們與致倦庫蚊聚成了一支, 其他物種和凡納濱對蝦ACP距離較遠(yuǎn)(圖6)。

左側(cè)物種名稱及相應(yīng)的登錄號分別為: 凡納濱對蝦(ALC78852.1); 北方長額對蝦(CAC35697.1); 斑馬魚(AFU97155); 小鼠(CAA31775); 人(AAH09647); 濕木白蟻(KDR12134.1)。ALP核心結(jié)構(gòu)用方框標(biāo)示, 酶活性中心區(qū)域用“▲”標(biāo)示, 保守的Cys用黑體加陰影標(biāo)示, N糖基化位點(diǎn)下劃線標(biāo)示。可能的Mg結(jié)合位點(diǎn)用“■”表示, Ca結(jié)合位點(diǎn)用“□”標(biāo)示, Zn1+結(jié)合位點(diǎn)用“●”標(biāo)示。Bioedit比對后相同氨基酸殘基用“*”標(biāo)示, 相似的氨基酸殘基分別用“:”或“.”標(biāo)示

Species are listed on the left in the figure and given here with their Genbank Accession numbers:(ALC78852.1);(CAC35697.1);(AFU97155);(CAA31775);(AAH09647); and(KDR12134.1). Boxed aminoacids correspond to the ALP domain. Cysteins are shaded in black. The active site is marked with “▲”. The putative N-glycosylation sites are underlined. Residues predicted to bind to magnesium “■”, to calcium “□” and to Zn1+“●” are indicated. Identical “*” and similar “:” or “.” residues identified by the ClustalW program are indicated

左側(cè)物種名稱及相應(yīng)的登錄號分別為: 凡納濱對蝦(ALC78849.1); 人(NP_149059.1); 果蠅(BAF47908.1); 小鼠(NP_001181963.1); 致倦庫蚊(XP_001851362.1); 凡納濱對蝦ACP的核心結(jié)構(gòu)域用方框標(biāo)示, 保守的Cys用黑體加陰影標(biāo)示, N糖基化位點(diǎn)下劃線標(biāo)示。金屬離子結(jié)合位點(diǎn)用“■”標(biāo)示。Bioedit比對后相同氨基酸殘基用“*”標(biāo)示, 相似的氨基酸殘基分別用“:”或“.”標(biāo)示

Species are listed on the left in the figure and given here with their Genbank Accession numbers:(ALC78849.1),(NP_149059.1),(BAF47908.1),(NP_001181963.1), and(XP_001851362.1).Boxed aminoacids correspond to the ACP domain. Cysteins are shaded in black. The putative N-glycosylation sites are underlined. Residues predicted to bind to metal ions “■” are indicated. Identical “*” and similar “:” or “.” residues identified by the ClustalW program are indicated

2.4 ALP基因以及ACP基因mRNA組織表達(dá)模式

凡納濱對蝦ALP和ACP在各組織中的表達(dá)結(jié)果分別如圖7A和圖7B所示。在5個組織中均檢測到ALP基因mRNA且組織分布存在差異, ALP在肝胰腺中表達(dá)量最高, 且明顯高于其他組織(<0.05), 在腸中表達(dá)量最低, 且明顯低于其他組織(<0.05), 在肌肉、鰓和胃組織中未產(chǎn)生明顯差異。同樣, 在5個組織中也均檢測到了ACP 基因mRNA表達(dá), ACP基因在肝胰腺和鰓中表達(dá)量較高, 且明顯高于其他組織(<0.05), 在肌肉、胃和腸中表達(dá)量較低, 并且未產(chǎn)生顯著性差異。

2.5 鹽度調(diào)控ALP和ACP表達(dá)規(guī)律

由圖8A可知, 在不同鹽度下, ALP基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律不同。在胃和鰓中, 31鹽度組ALP基因的表達(dá)量均顯著高于16和3鹽度組(<0.05), 16鹽度組和3鹽度組之間差異不明顯; 在肝胰腺和腸道中, 16鹽度組ALP基因的表達(dá)量均明顯低于31和3鹽度組<0.05), 而31和3鹽度組之間未產(chǎn)生明顯差異。在肌肉中的表達(dá)規(guī)律與其他組織均不同, 31鹽度組表達(dá)量最高, 其次是3鹽度組, 而16鹽度組表達(dá)量最低, 且3組之間存在顯著性差異(<0.05)。

由圖8B可知, 在不同鹽度下, ACP基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律也不相同。在肝胰腺中, 31鹽度組ACP基因的表達(dá)量明顯低于16和3鹽度組(<0.05), 而16和3鹽度組之間沒有明顯差異; 在肌肉和鰓中, 31鹽度組ACP基因的表達(dá)量最高, 明顯高于16和3鹽度組(<0.05), 16和3兩組之間差異不明顯; 在腸道中, 3組鹽度組ACP基因的表達(dá)量明顯高于其余兩個鹽度組(<0.05), 其余兩個鹽度組之間沒有顯著性差異; 而在胃中, 3個鹽度組之間ACP基因的表達(dá)量沒有顯著性差異。

. 凡納濱對蝦;. 斑馬魚;. 人;. 大黃魚;. 小鼠;. 大西洋鮭;. 濕木白蟻;. 牛;. 獼猴;. 北方長額對蝦;. 合浦珠母貝;. 非洲爪蟾

. 凡納濱對蝦;. 人;. 密西西比鱷;. 致倦庫蚊;. 家鼠;. 家牛;. 羅氏沼蝦;. 馬氏珠母貝;. 非洲爪蟾

不同字母表示結(jié)果之間存在顯著性差異(<0.05)

Different letters indicate a significant difference(<0.05)

同一組織之間不相同字母表示存在顯著性差異(<0.05)

Different letters from the same group indicate a significant difference(<0.05)

3 討論

3.1 凡納濱對蝦ALP和ACP結(jié)構(gòu)及組織分布

磷酸酶作為生物體內(nèi)廣泛存在的單酯水解酶, 在人、鼠、牛等方面的研究較為廣泛。磷酸酶基因的研究在人和鼠中的報道較為豐富, 但是在水生動物中的研究較多集中于組織學(xué)、酶的生化性質(zhì)等方面, 關(guān)于基因的表達(dá)和調(diào)控的報道還不多[16]。本實驗采用RACE的方法[17]克隆出凡納濱對蝦ALP和ACP基因的全長cDNA序列。ALP基因(GenBank登錄號: R534873.1)共編碼536個氨基酸, 其編碼的氨基酸序列和濕木白蟻、北方長額對蝦等ALP氨基酸有一定的相似性(45%~47%), 多重比對結(jié)果表明, 不同物種的ALP具有較高的相似性, 具有多個與Mg離子和Zn離子的結(jié)合位點(diǎn), 并且具有ALP家族共有的alkPPC結(jié)構(gòu)域和ALP家族的保守序列[18]。系統(tǒng)發(fā)育樹表明, 凡納濱對蝦ALP和羅氏沼蝦ALP聚為一支, 比和濕木白蟻這類節(jié)肢動物的親緣關(guān)系更進(jìn)一步。另外本實驗克隆得到的ACP基因(GenBank登錄號: KR676449.1)共編碼439個氨基酸, 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示其結(jié)構(gòu)以β-折疊為主, 僅含有少量的α-螺旋。從NCBI查找其他物種的ACP氨基酸序列, 多重比對結(jié)果顯示, 其編碼的氨基酸序列和致倦庫蚊、羅氏沼蝦等有較高的相似性(54%~57%), 具有ACP基因家族的核心結(jié)構(gòu)域MPP_PAPs, 含有可能與金屬離子結(jié)合的多個位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明, 凡納濱對蝦ACP與羅氏沼蝦ACP聚為一支, 并且這兩個物種與致倦庫蚊構(gòu)成了節(jié)肢動物分支, 符合生物進(jìn)化理論。

目前, ALP基因在動物中進(jìn)行了廣泛的研究, ALP基因是在脊椎動物發(fā)育中的表達(dá)水平在時間和組織特異性方面有所不同[19]。有研究報道, 人和鼠的基因已經(jīng)被克隆[20], 并且在人和鼠中存在多種ALP, 在人和鼠中分別具有3種和2種組織特異性ALP[21], 分別是人的腸ALP、胎盤ALP和生殖細(xì)胞ALP; 小鼠的腸ALP和胚胎ALP[22]。在人和鼠中還具有一種組織非特異性的ALP(tissue-non-specific alkaline posphatase), 在肝、早期胚胎、腎以及骨骼等多種組織中表達(dá)。同時有研究報道, 文昌魚早期發(fā)育過程中存在腸特異性ALP和非組織特異性2種ALP[21]。施志儀[16]等實驗結(jié)果表明, 牙鲆ALP是組織非特異性的堿性磷酸酶類。本實驗中, RT-PCR結(jié)果顯示, ALP基因在凡納濱對蝦肝胰腺、肌肉、胃、腸和鰓5個組織中均有表達(dá), 從其mRNA的表達(dá)特點(diǎn)可知, ALP在凡納濱對蝦體內(nèi)的分布是組織非特異性的ALP, 但是肝胰腺和鰓中表達(dá)量較高, 在肌肉、胃和腸中的表達(dá)量較低, 說明ALP基因的表達(dá)水平在不同組織中存在差異性[23], 張輝[24]在對日本沼蝦的研究同樣表明了ALP基因在不同組織中的表達(dá)水平具有差異性。ALP是有一個多基因家族編碼, 在動物的早期發(fā)育時期存在多種類型, 對于ALP在凡納濱對蝦發(fā)育時期是否存在其他種類, 有待進(jìn)一步研究。ACP同樣是生物體內(nèi)分布很廣的磷酸酶類, 從低等生物大腸桿菌、酵母到高等動植物體液、組織到人類肝臟、前列腺等都廣泛存在[25]。但是目前的研究也多集中在ALP方面, 對于水生動物的ACP表達(dá)分布研究較為匱乏, 本研究表明, 與ALP一樣, ACP在對蝦肝胰腺、肌肉、胃、腸道和鰓中都普遍存在, 是組織非特異性的磷酸酶, 但是在不同組織中ACP的表達(dá)水平是不同的并且存在差異性, 至于在發(fā)育時期是否和ALP一樣存在多種類型, 需要進(jìn)一步的實驗。

3.2 鹽度調(diào)控對ALP基因和ACP基因的影響

ALP和ACP是生物代謝的重要酶類, 參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)以及對蝦體內(nèi)能量的收支平衡, 當(dāng)機(jī)體處于耗能狀態(tài)時, ALP和ACP參與機(jī)體內(nèi)的能量代謝并且釋放能量, 來滿足機(jī)體生命活動的需要。

當(dāng)機(jī)體處于高鹽環(huán)境時, 凡納濱對蝦需將體內(nèi)多余的鹽分排出體外, 在較低的鹽度條件下又需要補(bǔ)入鹽分, 這個過程中, 凡納濱對蝦要消耗體內(nèi)儲存的能量進(jìn)行滲透調(diào)節(jié), 來維持機(jī)體內(nèi)正常的水分[26]。有研究認(rèn)為凡納濱對蝦的最適生長鹽度在14~22[10], 當(dāng)機(jī)體處于這一鹽度下, 維持滲透壓所需要消耗的能量較少, 鹽度低于10和高于26時, 因為自身存在較大的滲透壓差, 蝦體為維持自身的滲透壓平衡, 消耗更多的能量, 并且有研究認(rèn)為肌肉、胃、腸和鰓作為機(jī)體的排鹽器官[27], 在機(jī)體機(jī)體調(diào)節(jié)滲透壓的過程中起著十分重要的作用。本次試驗過程中, ALP基因在肌肉、胃、鰓和腸4個組織中在16的鹽度中表達(dá)量最低, ACP基因在以上4個組織中也具有相同的表達(dá)規(guī)律, 可能是因為當(dāng)對蝦處于16的環(huán)境時, 更接近它的等滲點(diǎn)(25)和最適生長鹽度(14~22), 用于維持滲透壓所需要的的能量較少, 從而使ALP和ACP在排鹽器官中的表達(dá)量相對于原環(huán)境31的表達(dá)量有所減少, 當(dāng)機(jī)體處于3時, 推測在耗能的過程可能刺激了ALP和ACP在排鹽器官中的表達(dá), 參與能量的代謝過程, 釋放出能量, 以維持機(jī)體對能量的需求。

在甲殼動物所有組織中, ACP作為一種參與機(jī)體代謝和免疫的酶類, 廣泛分布于動物組織中, 在人體主要存在于肝臟、脾臟、紅細(xì)胞和骨髓等部位[28]。ACP不僅參與磷酸酯代謝, 在酸性條下催化磷酸單酯水解, 在代謝調(diào)節(jié)、能量轉(zhuǎn)化及信號傳導(dǎo)上起著重要作用。同時, 作為溶酶體標(biāo)志酶, 參與消化生物大分子以維持細(xì)胞的正常代謝活動, 參與清除衰老或死亡的細(xì)胞和細(xì)胞器。參與識別、吞噬和降解入侵的病原體, 在免疫防護(hù)方面起重要作用[19], 同時肝胰腺是對蝦重要的器官之一, 是眾多生命大分子的主要合成場所, 在合成和分解代謝等方面具有重要功能[29], 組織細(xì)胞中的離子水平穩(wěn)定性對其完成正常生理功能非常重要[30]。不同鹽度養(yǎng)殖后, 肝胰腺中ACP基因在3和16兩組鹽度中表達(dá)量相對較高, 與其他組織的表達(dá)規(guī)律不同, 可能與凡納濱對蝦的機(jī)體的免疫狀態(tài)和機(jī)體器官有關(guān)系, 有關(guān)低鹽養(yǎng)殖中ACP在不同組織中的表達(dá)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

目前有關(guān)鹽度對于ALP和ACP影響的研究多集中在酶活方面, 通過鹽度脅迫來觀察酶活力的變化情況。有研究表明在對蝦的組織中, 鹽度為16組的ALP和ACP的活力明顯高于32和4組[31], 在對蝦肝胰腺中30組的ALP和ACP活力高于1.5[27]。李華[31]的研究中, 設(shè)置3個鹽度組(4、18、32)養(yǎng)殖30 d, 在0~15d內(nèi)對蝦必須進(jìn)行不斷的滲透調(diào)節(jié)而達(dá)到新的滲透平衡狀態(tài), 進(jìn)而導(dǎo)致對蝦體內(nèi)(血淋巴組織)免疫生理指標(biāo)發(fā)生了變化, 15~30d時, 各鹽度組對蝦體內(nèi)的免疫生理指標(biāo)(堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶)均趨于穩(wěn)定, 30 d的測定結(jié)果與15 d時相比差異很小, 鹽度32組在整個實驗過程中, 未經(jīng)歷鹽度馴化過程, 各指標(biāo)表現(xiàn)基本穩(wěn)定。結(jié)果表明, 當(dāng)凡納濱對蝦適應(yīng)了新的養(yǎng)殖環(huán)境后, 各項免疫生理指標(biāo)均在鹽度18時最高, 鹽度4時次之, 鹽度32時最低, 鹽度過高和過低都會對其產(chǎn)生不利的影響。梁萌青[28]研究發(fā)現(xiàn), 水體鹽度為30的凡納濱對蝦肝胰臟堿性磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性明顯高于1.5組的養(yǎng)殖對蝦。在本次試驗中凡納濱對蝦經(jīng)過45 d的鹽度脅迫后, ALP和ACP基因的相對表達(dá)量在不同組織中的表達(dá)規(guī)律與現(xiàn)階段報道的酶活力的規(guī)律有所不同, 有研究認(rèn)為鹽度調(diào)控后, ALP和ACP基因在表達(dá)ALP和ACP的過程中的這些不同, 可能與蛋白質(zhì)合成的活性的迅速變化有關(guān)[32]。同時推測這些變化可能與組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及組織特性有關(guān), 在這個過程中發(fā)生的具體變化有待進(jìn)一步的研究。

綜上, 本實驗從凡納濱對蝦中成功克隆到ALP和ACP基因的cDNA全長, 利用RT-PCR研究了不同鹽度下ALP和ACP基因在不同組織中表達(dá)情況, 這些數(shù)據(jù)可以為研究低鹽養(yǎng)殖環(huán)境下凡納濱對蝦的磷酸酶類分子機(jī)制提供參考。

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cDNA cloning and gene expressionin response to salinity of alkaline phosphatase and acid phosphatase from

ZHANG Ming-ming1, 3, WANG Lei2, 3, WANG Bao-jie2, 3, LIU Mei2, 3, ZHAN Wen-bin1, JIANG Ke-yong2, 3

(1. Fisheries College, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 3. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

In this study, alkaline phosphatase (ALP) and acid phosphatase (ACP) genes were cloned fromby the rapid amplification of cDNA endsmethod.The full-length cDNA sequence of ALP was 1 910 bp, encoding 536 amino acids, whereas the full-length cDNA sequence of ACP was 1 544 bp, encoding 439 amino acids.A salinity regulation experiment was performed with three treatments: 31‰ (control), 16‰, and 3‰ salt water.ALP and ACP gene expression was determined in tissues of the hepatopancreas, muscle, stomach, intestine and gills with real-time PCR after 45 days in saline. RT-PCR reveals that the ALP gene was detected in five tissues with the highest expression in the hepatopancreas(<0.05) and the lowestin theintestine (<0.05). The ACP gene was also detected in five tissues, and the gene expression in the hepatopancreas and gills was higher than that in the other tissues (<0.05). After the salinity regulation experiment, the ALP and ACP genes presented different expression patterns among the various tissues. In the stomach and gill tissues, the higher expression level of the ALP gene occurred in the 31‰ saline group compared with the other two salinity groups (<0.05); in the hepatopancreas and intestinal tissues, the expression level of the ALP gene in the 16‰ saline group was significantly lower than that in the other two salinity groups (<0.05); in muscle tissue, the expression level of the ALP gene was the highest in the 31‰ saline group (<0.05) and the lowest in the 16‰ salinegroup (<0.05). Whereas in the hepatopancreas, the expression level of the ACP gene in the 31‰ salinegroup was significantly lower than that in the other two salinity groups (<0.05); in muscle and gill tissues, the expression level of the ACP gene in the 31‰ salinegroup was significantly higher than that in the other two salinity groups (<0.05); in the intestines, the expression of the ACP gene was the highest in the 3‰ salinegroupand was significantly higher than that in the other two groups (<0.05); in the stomach, the expression level of the ACP gene was not significantly different among the three groups. These results provide useful data for the molecular mechanism ofphosphatase metabolism under conditions of low salinity.

; alkaline phosphatase; acid phosphatase; cloning and expression; salinity

S968.22

A

1000-3096(2017)01-0083-13

10.11759//hykx20160112002

2016-01-12;

2016-05-04

國家自然科學(xué)基金項目(41271547, 41401644); 中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(XDA05010400)

張明明(1989-), 女, 山東菏澤人, 碩士研究生, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖工作, 電話: 13075370324, E-mail: zmm15092858971@163.com;蔣克勇, 通信作者, E-mail: jiangkeyong@qdio.ac.cn

Jan. 12, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No.41271547,41401644; Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences, No.XDA05010400]

(本文編輯: 譚雪靜)