黃 勇, 劉 松, 秦玉坤, 邢榮娥, 李克成, 于華華, 岳 洋, 李 儼, 李鵬程

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殼聚糖堿性氨基酸衍生物的合成及抑菌活性研究

黃 勇1, 2, 劉 松1, 秦玉坤1, 邢榮娥1, 李克成1, 于華華1, 岳 洋1, 2, 李 儼1, 2, 李鵬程1

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所, 山東青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

利用接枝反應(yīng), 采用堿性氨基酸修飾殼聚糖, 制備殼聚糖賴氨酸衍生物、殼聚糖精氨酸衍生物、殼聚糖組氨酸衍生物。通過(guò)紅外(FT-IR)、核磁(1H-NMR)、元素分析(EA)對(duì)其進(jìn)行表征, 并研究了不同殼聚糖氨基酸衍生物的抑菌活性。結(jié)果表明, 殼聚糖賴氨酸衍生物、殼聚糖精氨酸衍生物、殼聚糖組氨酸衍生物、殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為320、160、320、640 μg/mL, 對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為320、320、320、640 μg/mL, 三種殼聚糖氨基酸衍生物的抑菌活性均明顯高于未修飾殼聚糖。通過(guò)引入堿性氨基酸增加殼聚糖的正電荷有利于提高其抑菌活性。

殼聚糖; 堿性氨基酸; 衍生物; 抑菌活性

殼聚糖是甲殼素部分或完全脫乙酰基后的產(chǎn)物, 是自然界中唯一的天然堿性多糖, 具有使用安全、良好的生物相容性、生物降解性和理化性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn), 同時(shí)具有降血脂、絮凝、止血、抗菌等多種生物活性[1]。殼聚糖具有的活潑羥基和氨基, 可以進(jìn)行多種化學(xué)改性, 以改善其溶解性、增強(qiáng)抗菌活性等, 因此在抗菌劑的研究與應(yīng)用方面具有良好的前景。目前, 雖然殼聚糖及其衍生物的抗菌機(jī)理尚沒(méi)有明確的結(jié)論, 但研究者提出了多種可能的殼聚糖抗菌作用機(jī)理, 這些機(jī)理都與殼聚糖的氨基或正電荷有關(guān)[2]。歸結(jié)起來(lái)主要有以下三種: 首先最認(rèn)同的抗菌機(jī)理是帶正電荷的殼聚糖與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞表面的相互作用, 通過(guò)影響細(xì)菌代謝而達(dá)到抑菌效果[3-5]; 第二個(gè)可能的抗菌機(jī)理是殼聚糖穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部, 與DNA結(jié)合阻止了DNA的轉(zhuǎn)錄[6]; 第三個(gè)可能的抗菌機(jī)理是殼聚糖及其衍生物與金屬離子螯合, 抑制微量元素的攝取以及與細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合, 從而達(dá)到抑菌效果[7]。

氨基酸作為生物功能大分子的基本組成單位, 是構(gòu)成動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。而賴氨酸、精氨酸、組氨酸因其側(cè)鏈分別帶氨基、胍基和咪唑基(堿性基團(tuán)), 使其成為帶正電荷的堿性氨基酸[8]。本文利用活性基團(tuán)拼接原理, 通過(guò)接枝反應(yīng), 將這三類堿性氨基酸接枝到殼聚糖上, 理論上可以增加殼聚糖上正電荷, 從而提高其抑菌活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要藥品與試劑

殼聚糖(CS, 相對(duì)分子質(zhì)量1300 KDa, 脫乙酰度85.6%), 購(gòu)于青島云宙生物科技有限公司; 賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His), 嗎啉乙磺酸(MES), 購(gòu)于國(guó)藥試劑集團(tuán)有限公司; 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCl)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS), 購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司, 透析袋(MEMBRA-CEL, 截留分子質(zhì)量為3500 Da)購(gòu)于濟(jì)南邦達(dá)醫(yī)藥公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

78-1型磁力加熱攪拌器, 常州國(guó)華電器有限公司; PHS-3C型pH計(jì), 上海雷磁公司; TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì), 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司; iMark酶標(biāo)儀, 美國(guó)美國(guó)BIO-RAD公司; FD-1型冷凍干燥機(jī), 北京德天佑實(shí)驗(yàn)儀器有限公司; SARTORIUS 精密分析天平, 德國(guó) SARTORIUS 公司; 博訊立式蒸汽壓力滅菌器, 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司; 紅外光譜儀(Nicolet Magna-Avatar 360), Nicolet Magna公司; 核磁共振光譜儀(JNM-ECP600 NMR spectrometer), 日本JEOL公司; 元素分析儀(Vario EL-Ⅲ elemental analyzer), 德國(guó)元素分析系統(tǒng)公司。

1.3 殼聚糖氨基酸衍生物的合成

參照前期已報(bào)道的制備方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)[9]。稱取0.5 g殼聚糖溶于50 mL0.10 mol/L MES緩沖溶液中(pH=5.5), 待殼聚糖完全溶解, 加入殼聚糖單元物質(zhì)的量3倍的EDCl作縮合劑、殼聚糖單元物質(zhì)的量3倍的NHS作偶聯(lián)劑, 攪拌均勻, 加入殼聚糖單元物質(zhì)的量2倍的氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸), 磁力攪拌, 室溫反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后, 于去離子水中透析3 d, 真空冷凍干燥得樣品CS-L(殼聚糖賴氨酸衍生物), CS-A(殼聚糖精氨酸衍生物), CS-H(殼聚糖組氨酸衍生物)。殼聚糖氨基酸衍生物的合成路線如圖1所示。

1.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌最小抑菌濃度(MIC)采用微量肉湯稀釋法測(cè)定[10]。具體步驟如下:

(1) 用接種環(huán)挑取37℃過(guò)夜培養(yǎng)的MH瓊脂培養(yǎng)皿上的單菌落于無(wú)菌的0.85%生理鹽水中, 校準(zhǔn)為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn), 約含菌數(shù)1×108CFU/mL, 然后用MHB培養(yǎng)基稀釋100倍, 即得到約含菌數(shù)1×106CFU/mL的菌液, 備用。

(2) 將待測(cè)樣品用0.5%乙酸配制成濃度為5 120 μg/mL儲(chǔ)備液。取無(wú)菌的96孔板, 每個(gè)孔中加入100 μL含菌數(shù)1×106CFU/mL的菌懸液, 在A孔中加入100 μL待測(cè)樣品儲(chǔ)備液, 混勻, 從A孔吸取100 μL加入B孔, 混勻, 再?gòu)腂孔吸取100 μL至C孔, 依次類推, G孔吸取100 μL棄去, H孔不加樣品, 只含100 μL菌懸液。此時(shí)各孔藥物濃度依次為: 2 560、1 280、640、320、160、80、40 μg/mL。以只加100μL菌懸液不加待測(cè)樣品作對(duì)照。用酶標(biāo)儀620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定初始吸光度值, 將96孔板于37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24 h后再用酶標(biāo)儀620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值, 兩次測(cè)得的吸光度差δ值代表細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。所測(cè)樣品對(duì)細(xì)菌的抑制率按下式計(jì)算:

抑制率=(δ0–δx)/δ0×100%

其中,δ0為只含菌懸液的空白對(duì)照培養(yǎng)前后吸光度差值,δx為所測(cè)樣品培養(yǎng)前后吸光度差值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜(FT-IR)測(cè)定

殼聚糖(CS)和三類氨基酸修飾殼聚糖(CS-L, CS-A, CS-H)的紅外光譜如圖2所示, 從圖中可以看出, 反應(yīng)后在1 640 cm–1和1 540 cm–1附近出現(xiàn)明顯的吸收峰, 經(jīng)分析可知, 1 640 cm–1和1 540 cm–1附近分別是仲酰胺的酰胺Ⅰ代吸收峰和酰胺Ⅱ代的N-H變形振動(dòng)吸收峰, 而原殼聚糖上1589cm–1的氨基(N-H)譜帶被新生成的酰胺Ⅱ譜帶所掩蓋, 這說(shuō)明反應(yīng)后產(chǎn)物中有酰胺鍵生成[11]。證明三種氨基酸通過(guò)α-羧基與殼聚糖上氨基發(fā)生反應(yīng), 生成酰胺鍵, 氨基酸修飾殼聚糖成功。

2.2 核磁共振譜圖(1H-NMR)測(cè)定

圖3為殼聚糖(CS)和三類氨基酸修飾殼聚糖(CS-L, CS-A, CS-H)的1H-NMR譜圖, 在CS譜圖上, 1.80×10–6處為殼聚糖上未脫乙酰基團(tuán)質(zhì)子吸收峰, 2.93×10–6處為C2上質(zhì)子的吸收峰, 4.65×10–6處為C1上質(zhì)子的吸收峰, 3.47×10–6~3.66×10–6為C3、C4、C5、C6上質(zhì)子的重疊吸收峰[12]。經(jīng)氨基酸修飾的殼聚糖的1H-NMR 除了保持原來(lái)的吸收峰外, CS-L的譜圖在1.25×10–6, 1.54×10–6, 1.71×10–6, 2.52×10–6處出現(xiàn)的吸收峰分別對(duì)應(yīng)C9, C10, C8, C11上質(zhì)子; CS-A的譜圖在1.47×10–6, 1.62×10–6, 2.52×10–6出現(xiàn)的吸收峰分別對(duì)應(yīng)C9, C8, C10上的質(zhì)子; CS-H的譜圖在2.92×10–6處出現(xiàn)的吸收峰對(duì)應(yīng)C8上的質(zhì)子, 在7.00×10–6和8.14×10–6處出現(xiàn)的吸收峰分別對(duì)應(yīng)組氨酸咪唑環(huán)上C10和C9的質(zhì)子吸收峰[13]。CS-L, CS-A, CS-H的C7位上質(zhì)子吸收峰出現(xiàn)在3.40×10–6~ 3.80×10–6, 與殼聚糖骨架上質(zhì)子出峰位置接近, 可能被殼聚糖骨架上質(zhì)子吸收峰所掩蓋, 由此可以判定殼聚糖主鏈中成功引入氨基酸分子, 殼聚糖堿性氨基酸衍生物制備成功。

2.3 元素分析

殼聚糖與三類殼聚糖氨基酸衍生物元素分析結(jié)果如表1所示。根據(jù)C/N比值計(jì)算得出殼聚糖脫乙酰度及氨基酸對(duì)殼聚糖的取代度, 根據(jù)元素分析計(jì)算得到的結(jié)果表明, 在本實(shí)驗(yàn)條件下制得的三類殼聚糖氨基酸衍生物具有相似的取代度, 由于氨基酸分子的引入, N元素含量增加, C/N降低。

2.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

殼聚糖及三類殼聚糖氨基酸衍生物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果如表2所示。CS對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)為640 μg/mL, 三類殼聚糖氨基酸衍生物的抑菌活性均高于殼聚糖原料, 其中CS-A抑菌活性最高, 對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為160 μg/mL, CS-L、CS-H對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性相當(dāng), 其MIC為320 μg/mL。

殼聚糖及三類殼聚糖氨基酸衍生物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果如表3所示, CS對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為640 μg/mL, 三類殼聚糖氨基酸衍生物的抑菌活性相當(dāng), 均高于殼聚糖原料, 其對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為320 μg/mL。

表1 殼聚糖及賴氨酸、精氨酸、組氨酸修飾殼聚糖元素分析

表2 殼聚糖及賴氨酸、精氨酸、組氨酸修飾殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率(%)

表3 殼聚糖及賴氨酸、精氨酸、組氨酸修飾殼聚糖對(duì)大腸桿菌的抑菌率(%)

3 討論

利用賴氨酸、精氨酸、組氨酸三類帶正電荷的堿性氨基酸修飾殼聚糖, 通過(guò)紅外(FTIR)、核磁(1H-NMR)、元素分析(EA)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定、表征, 結(jié)果表明三類殼聚糖氨基酸衍生物制備成功。對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性的研究結(jié)果表明, 三類殼聚糖氨基酸衍生物均能有效提高殼聚糖的抑菌活性。其中, 殼聚糖賴氨酸衍生物、殼聚糖組氨酸衍生物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性相當(dāng), 均高于殼聚糖但低于殼聚糖精氨酸衍生物。三類殼聚糖氨基酸衍生物對(duì)大腸桿菌的抑菌活性均高于殼聚糖。其原因可能是殼聚糖接枝堿性氨基酸后, 增加了其氨基正電荷, 使其抑菌活性有不同程度的提高。

殼聚糖精氨酸衍生物含有胍基基團(tuán), 而胍基化合物常用作農(nóng)業(yè)殺菌劑和消毒劑及工業(yè)生物殺傷劑中的抗微生物劑等。這是由于胍基化合物中的胍基團(tuán)是有效的活性基團(tuán), 可以與生物體中的基團(tuán)或元素相互作用, 破壞其正常的物質(zhì)和能量代謝[14]; 同時(shí), 精氨酸側(cè)鏈胍基基團(tuán)是具有生物活性最強(qiáng)的有機(jī)堿之一[15], 其pKa=12.48, 而賴氨酸側(cè)鏈氨基pKa= 10.53, 組氨酸側(cè)鏈咪唑基pKa=6.00[8], 就其酸堿性質(zhì)而言, 精氨酸堿性最強(qiáng), 攜帶正電荷的能力也最強(qiáng), 因而賦予殼聚糖精氨酸衍生物更高的抑菌活性。

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Synthesis and antibacterial activities of basic amino acid- modified chitosan derivatives

HUANG Yong1, 2, LIU Song1, QIN Yu-kun1, XING Rong-e1, LI Ke-cheng1, YU Hua-hua1, YUE Yang1, 2, LI Yan1, 2, LI Peng-cheng1

(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

In this study, three basic amino acids were used to modify chitosan to improve its antibacterial activity. Lysine-modified chitosan, arginine-modified chitosan, and histidine-modified chitosan were synthesized, and their structures were characterized using Fourier-transform infrared, magnetic resonance spectra (1H-NMR), and elemental analysis. The results showed that the amino acids were successfully grafted onto chitosan. The antibacterial activities of these derivatives againstandwere investigated. The MIC of lysine-modified chitosan, arginine-modified chitosan, and histidine-modified chitosan onwas 320, 160, 320, and 640 μg/mL, respectively, and the MIC onwas 320, 320, 320, and 640 μg/mL, respectively. All three basic amino acid-modified chitosan derivatives exhibited better antibacterial activity than chitosan.

Chitosan; basic amino acids; derivatives; antibacterial activity

Q503

A

1000-3096(2017)01-0024-06

10.11759/hykx20160408001

2016-04-08;

2016-06-26

中國(guó)科學(xué)院STS計(jì)劃項(xiàng)目(KFJ-SW-STS-143); 國(guó)家海洋公益性項(xiàng)目(201305016-2、201405038-2); NSFC-山東聯(lián)合資助項(xiàng)目(U1406402-5)

黃勇(1990-), 山東濰坊人, 碩士研究生, 研究方向: 海洋活性物質(zhì), 電話: 0532-82898780, E-mail: huangyongno1@163.com; 劉松, 通信作者, 研究方向: 海洋活性物質(zhì), 電話: 0532-82898780, E-mail: sliu@qdio.ac.cn

Apr. 8, 2016

[CAS STS Program, No.KFJ-SW-STS-143; The Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean, No.201305016-2, No.201405038-2; NSFC-Shandong Union project, No. U1406402-5]

(本文編輯: 康亦兼)