王 威,唐 偉,張 軍,遲海濤

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001;2.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院,遼寧 大連 116021)

電針對短暫性腦缺血發(fā)作大鼠神經(jīng)元形態(tài)學(xué)及細(xì)胞凋亡的影響

王 威1,唐 偉2△,張 軍2,遲海濤2

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001;2.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院,遼寧 大連 116021)

目的：探討電針對短暫性腦缺血發(fā)作大鼠神經(jīng)元形態(tài)學(xué)及細(xì)胞凋亡的影響。方法：Wistar雄性大鼠32只隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、針刺組，每組8只。采用四血管阻斷法建立短暫性腦缺血發(fā)作大鼠模型。正常對照組、假手術(shù)組、模型組不給予任何治療。針刺組造模后給予電針治療，術(shù)后1周取材。尼氏染色觀察神經(jīng)元損傷情況，透射電鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)；原位末端標(biāo)記法檢測(TUNEL染色)大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡。結(jié)果：神經(jīng)元尼氏染色結(jié)果:模型組染色較淺，神經(jīng)元尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)較少。而電針組較模型組神經(jīng)元尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)。電鏡觀察結(jié)果:模型組大腦皮層、海馬CA1區(qū)見神經(jīng)細(xì)胞腫脹，核周間隙擴(kuò)張或消失,染色質(zhì)凝集成塊或溶解，線粒體嵴斷裂;電針組電鏡下觀察線粒體腫脹輕微，毛細(xì)血管水腫少見,胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，結(jié)構(gòu)完整。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果:正常對照組大腦皮層、海馬CA1區(qū)假手術(shù)組凋亡陽性細(xì)胞較少見，模型組大腦皮層、海馬CA1區(qū)可見較多凋亡細(xì)胞，針刺組與模型組比較，凋亡細(xì)胞明顯減少，具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：電針可以減輕短暫性腦缺血發(fā)作大鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷，抑制神經(jīng)元凋亡。

電針；短暫性腦缺血發(fā)作；細(xì)胞凋亡；超微結(jié)構(gòu)

短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)是腦血管病變引起的短暫性、發(fā)作性腦功能障礙，主要表現(xiàn)肢體功能障礙、語言障礙等，發(fā)作可持續(xù)數(shù)分鐘至1 h，多在24 h內(nèi)恢復(fù)，不遺留神經(jīng)功能缺損癥狀和體征，是急性腦梗死最主要的危險因素之一，具有可逆性、反復(fù)性特點。發(fā)作越頻繁，進(jìn)展腦梗死可能性越大[1]。短暫性腦缺血發(fā)作具有一定腦損傷，能夠引起短暫的認(rèn)知障礙，核磁彌散加權(quán)成像的研究發(fā)現(xiàn)，超過30%的TIA患者腦內(nèi)存在細(xì)胞毒性水腫[2]。研究表明電針治療可以減輕TIA患者腦損傷，具有腦保護(hù)作用，但機(jī)理不明[3,4]。本研究利用全腦缺血TIA動物模型，從神經(jīng)元形態(tài)學(xué)、腦組織超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡角度探討針刺治療效應(yīng)，研究其可能機(jī)制，為臨床電針治療短暫性腦缺血發(fā)作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

Wistar大鼠，雄性，清潔級，體質(zhì)量為(230±30)g，購自大連醫(yī)科大學(xué)動物中心[合格證編號為SY(遼)2013101]。動物飼養(yǎng)條件：SPF級，室溫為20℃～25℃，濕度保持50%～60%，晝夜12 h明暗光照循環(huán)。實驗大鼠32只，隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、電針組，每組8只，實驗處置符合小動物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1．2 主要儀器及試劑

KWD-808Ⅱ型脈沖電療儀(中國常州武進(jìn)長城醫(yī)療器械有限公司)；JEM-1220型透射電子顯微鏡(日本電子公司)；OLYMPUS BH-2型顯微光鏡(日本電子公司)；BMJ-1型生物組織包埋機(jī)(天津天利航空機(jī)電有限公司)；Leiz型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國Leica)； LKB-V超薄切片機(jī)(瑞典 LKB公司生產(chǎn))；原位末端凋亡檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；一次性無菌針灸針(蘇州針灸用品有限分司)。

1.3 模型制作方法

采用四血管阻斷法建立短暫性腦缺血發(fā)作大鼠模型[5]。術(shù)前12 h禁食不禁水。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠；碘伏消毒，鋪無菌洞巾，在后頸背正中切1 cm長的切口，逐層分離組織，找到頸椎兩側(cè)橫突孔，橫突孔下為雙側(cè)椎動脈走行， 用直徑0.5 mm電凝針插入橫突孔約2 mm，致雙側(cè)椎動脈成永久閉塞， 觀察無活動性出血，縫合切口；動物取仰臥，消毒頸前正中皮膚，在頸前正中切口，逐層分離皮下組織，鈍性分離出雙側(cè)頸總動脈(CCA)，用絲線標(biāo)記，注意保護(hù)迷走神經(jīng)，雙側(cè)頸總動脈(CCA)同時用動脈夾夾閉缺血3 min，間隔60 min，再次給予3 min/次缺血，總共3次，制作大鼠短暫性腦缺血發(fā)作的動物模型。

1.4 干預(yù)方法

正常對照組：只作腹腔注射麻醉，不進(jìn)行手術(shù);假手術(shù)組：只進(jìn)行模型組手術(shù)步驟，不發(fā)生雙側(cè)椎動脈、頸總動脈缺血，僅暴露4根血管;電針組：給予針刺治療，造模后24 h后進(jìn)行。

1.5 針刺穴位選擇與針刺方法

百會：取穴雙耳連線與正中線交點，位于顱頂骨正中；用0.25 mm×25 mm毫針，向后沿皮斜刺2 mm。曲池(雙側(cè))：前肢橈骨近端，肘關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中;直刺進(jìn)針4 mm，用0.25 mm×40 mm毫針。足三里( 雙側(cè))：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處;直刺進(jìn)針5 mm，用0.25 mm×40 mm毫針?！鞍贂毖ㄩg歇5 min捻轉(zhuǎn)1次，平補(bǔ)平瀉。針刺每日1次，時間30 min，雙側(cè) “足三里”“曲池”穴連接電療儀，強(qiáng)度以肢體輕微抖動為度，頻率1 Hz，電壓2 V，治療7天斷頭取腦。

1．6 取材及指標(biāo)檢測方法

1．6．1 灌注固定 麻醉后，將大鼠仰臥固定于固定架上，手術(shù)暴露心臟。用16號針頭向左心尖刺入左心室，剪開左心耳，0.9%氯化鈉注射液250 ml快速沖洗血液，再用4%多聚甲醛快速加壓靜推，直至使大鼠全身顏色變白，全身僵硬，尾巴翹起為止。

1．6．2 實驗取材 雙側(cè)大腦迅速放入4%的多聚甲醛固定24 h后，用切刀前額極向后至枕極平分為5等份，取含有海馬、皮層腦片，室溫下經(jīng)酒精梯度脫水，用石蠟包埋，以備切片。

1．6．3 尼氏染色觀察神經(jīng)元損傷 石蠟切片、片子厚度約為4 μm，裱于干凈載玻片上，脫蠟，入預(yù)熱60℃1%甲苯胺藍(lán)40 min，蒸餾水洗3次，95%乙醇分化，脫色，至背景清楚為止，無水乙醇、二甲苯，封片顯微鏡下觀察大腦皮層與海馬CA1區(qū)尼氏染色陽性神經(jīng)元數(shù)目。

1．6．4 原位末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測細(xì)胞凋亡 每只大鼠取相同部位連續(xù)切片5張，實驗步驟按原位末端凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，在顯微鏡下(10×40倍)對大腦皮層、海馬CA1區(qū)凋亡陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，凋亡神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志為細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者。

1.6.5 電子顯微鏡下觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化 每組取2只大鼠，腹腔注射麻醉，暴露心臟，先灌注生理鹽沖洗血液，再灌注3%戊二醛，取腦，分離并留取額葉皮層與海馬CA1區(qū)， 在1 min內(nèi)投入2.5%戊二醛固定液4℃固定，四氧化鋨固定，逐級丙酮脫水，Epon812包埋液，半薄切片，定位后，超薄切片，切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上，脫水至70%乙醇，丙酮配制的飽和醋酸鈾溶液中染色時間2 h，電子顯微鏡下觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。

1．7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠體質(zhì)量、手術(shù)時間及手術(shù)肛溫比較

為了除外環(huán)境因素影響，筆者對實驗中大鼠體質(zhì)量、手術(shù)時間及手術(shù)肛溫進(jìn)行了比較，結(jié)果表明各組無顯著性差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、手術(shù)時間及手術(shù)肛溫比較

2.2 神經(jīng)元尼氏染色結(jié)果

正常對照組、假手術(shù)組大腦皮層、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏體豐富，神經(jīng)元尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)較多。模型組神經(jīng)元丟失明顯，染色較淺，神經(jīng)元尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)目明顯較少。而電針組較模型組神經(jīng)元尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)增多，有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 神經(jīng)元尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)比較 (個)

注：與模型組比較,*P<0.05

2.3 電鏡觀察結(jié)果

①大腦皮層、海馬CA1區(qū)正常對照組、假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞核呈卵圓形,線粒體呈橢圓形、圓形，線粒體嵴清晰可見，胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，結(jié)構(gòu)完整,見圖1，可見高爾基體分布。②模型組大腦皮層、海馬CA1區(qū)見神經(jīng)細(xì)胞腫脹，核膜內(nèi)陷，鋸齒樣變，線粒體嵴斷裂，染色質(zhì)凝集成塊或溶解,見圖2，核周圍細(xì)胞器減少、消失見圖3。③電針組大腦皮層、海馬CA1區(qū)電鏡下觀察毛細(xì)血管輕微水腫見圖1,線粒體稍腫脹，未見有核膜內(nèi)陷，線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整,見圖4，胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，結(jié)構(gòu)完整。

圖1 電針組海馬CA1區(qū) TEM×30000

圖2 模型組海馬CA1區(qū) TEM×12000

圖3 模型組大腦皮層TEM×30000

圖4 電針組大腦皮層TEM×30000

2.4 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果(TUNEL染色)

大腦皮層、海馬CA1區(qū)模型組可見大量凋亡陽性細(xì)胞。正常對照組、假手術(shù)組大腦皮層、海馬CA1區(qū)凋亡陽性細(xì)胞少見。電針組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目較模型組明顯減少，模型組與電針組比較有顯著性差異(P<0.05)。見表3。

表3 凋亡陽性細(xì)胞數(shù)比較 (個)

注：與模型組比較*P<0.05

3 討論

TIA患者發(fā)生卒中的概率明顯高于一般人群，7天內(nèi)發(fā)生卒中的風(fēng)險為4%～10%,為中風(fēng)先兆，與中醫(yī)文獻(xiàn)中記載的“小中風(fēng)”極為相似。中醫(yī)認(rèn)為病因病機(jī)主要為氣虛血瘀，肝陽上亢，痰濕阻絡(luò)，腦絡(luò)瘀阻[6]。

本研究選取穴位，百會為督脈經(jīng)穴，位居巔頂，有祛風(fēng)醒腦、宣閉開竅、升提陽氣功效,對整個經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)有統(tǒng)帥作用。曲池穴、足三里均是陽明經(jīng)合穴，陽明氣血旺盛，“正氣存內(nèi)，邪不可干”[7]，百會、曲池穴、足三里諸穴合用具有醒腦開竅、協(xié)調(diào)陰陽、疏通經(jīng)絡(luò)之功效。

腦組織幾乎無葡萄糖和氧儲備，對缺血缺氧十分敏感，不同部位對缺氧敏感性不同，大腦皮質(zhì)(第3、4層)、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元最為敏感[8]，這是本實驗選取這二個部位作為研究對象的原因。正常對照組、假手術(shù)組大腦皮層、海馬CA1區(qū)尼氏染色神經(jīng)細(xì)胞排列整齊緊密，形態(tài)完整，尼氏體豐富。電鏡下大腦皮層、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞器豐富，核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布，核膜結(jié)構(gòu)清晰光滑，說明了手術(shù)創(chuàng)傷與麻醉藥對腦組織形態(tài)學(xué)沒有改變。模型組光鏡下尼氏染色可見神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，尼氏體減少。電鏡下可見神經(jīng)細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞固縮或腫脹，核膜內(nèi)陷，鋸齒樣變。說明了短暫性腦缺血發(fā)作對腦組織有一定損傷[9]。而電針組光鏡下尼氏染色示神經(jīng)元數(shù)目較多，尼氏體較豐富，電鏡下毛細(xì)血管水腫少見，線粒體腫脹輕微，結(jié)構(gòu)完整，說明電針對短暫性腦缺血發(fā)作具有一定保護(hù)作用，能減輕缺血后神經(jīng)元損傷。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞核在一定條件下，通過內(nèi)源DNA內(nèi)切酶的激活，啟動其自身內(nèi)部機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過程。短暫性腦缺血發(fā)作神經(jīng)元缺血程度并非是完全性腦缺血，而是一個短暫反復(fù)多次缺血的過程，因此局部神經(jīng)元的死亡方式不是一種急性壞死，而是一種緩慢發(fā)生的程序化過程——凋亡。本實驗TUNEL法檢測大腦皮層、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，正常對照組、假手術(shù)組見少許凋亡陽性細(xì)胞，模型組可見較多凋亡陽性細(xì)胞，表明細(xì)胞凋亡是短暫性腦缺血發(fā)作腦損傷一種方式。電針組大腦皮層、海馬CA1區(qū)凋亡陽性細(xì)胞較模型組明顯減少，此結(jié)果說明電針可以減輕短暫性腦缺血發(fā)作腦損傷，減少神經(jīng)元凋亡，從而證實抑制短暫性腦缺血發(fā)作大鼠神經(jīng)元凋亡，可能是電針發(fā)揮腦保護(hù)作用的一種途徑，其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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Effect of Electroacupuncture on the Morphology and Apoptosis of Neurons in Rats with Transient Ischemic Attack

WANG Wei1,TANG Wei2△,ZHANG Jun2,CHI Hai-tao2

(1.TheAffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China;2.TheAffiliatedXinhuaHospitalofDalianUniversity,Dalian116021,China)

Objective：To investigate the effect of electroacupuncture on the morphology and apoptosis of neurons in rats with transient ischemic attack.Methods：Thirty-two male Wistar rats were randomly divided into a normal control group,a sham operation group,a model group and an acupuncture group, with 8 rats in each group. A rat model of transient ischemic attack was established by four vessel occlusion. Normal control group, sham operation group and model group were not given any treatment, and electroacupuncture group was given electroacupuncture treatment. Nissl bodies were observed by Nissl's staining. The ultrastructure of neurons was observed by the electron microscope, and neuronal apoptosis was detected by in situ cell apoptosis (TUNEL staining) in the cerebral cortex and hippocampus CA1 area.Results：The number of positive cells in the electroacupuncture group was more than that in the model group (P<0.05). The result of electron microscope showed that swelling of the nerve cells, the expansion or disappearance of the nuclear gap, chromatin condensation into blocks or dissolution and mitochondrial crest fracture were found in the cerebral cortex, hippocampal CA1 area in the model group. But slight swelling of mitochondria and capillary edema, abundant and complete structure of cytoplasmic organelles were found in electroacupuncture group. TUNEL staining showed that apoptosis cells were rare in the cerebral cortex and hippocampus CA1 area in the normal control group and sham operation group. Compared with the model group, the apoptosis cells in the electroacupuncture group were reduced, and there was a significant difference between two groups (P<0.05).Conclusion：Electroacupuncture can allieviate neuronal damage and inhibit neuronal apoptosis in cerebral cortex and hippocampus CA1 area in rats with transient ischemic attack.

Electroacupuncture;Transient ischemic attack;Apoptosis;Ultrastructure

王威(1979-)，女，副主任醫(yī)師,主要從事中醫(yī)針灸研究。

△通訊作者：唐偉(1972-)，男，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科研究。

R246.6

A

1005-0779(2017)04-0061-04

2016-10-26