龔勇 仝巧云 鄭世華

·論著·

WT1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義

龔勇 仝巧云 鄭世華

目的 檢測WT1在結(jié)腸癌中的表達(dá)并探討其臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組化及半定量RT-PCR技術(shù)檢測WT1在48例結(jié)腸癌及14例正常結(jié)腸組織中的表達(dá)情況，分析其與結(jié)腸癌患者的臨床病理特征及預(yù)后等關(guān)系。結(jié)果 WT1在結(jié)腸癌中的陽性表達(dá)率明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；WT1的表達(dá)與患者的年齡、性別和分化程度無關(guān)(P>0.05)；而與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)；生存分析顯示W(wǎng)T1陽性表達(dá)組患者的生存期與陰性組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論WT1的高表達(dá)可能在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，設(shè)想以WT1為靶點(diǎn)進(jìn)行基因治療，有可能為結(jié)腸癌的治療提供新途徑。

WT1；結(jié)腸癌

結(jié)腸癌是消化道中常見的惡性腫瘤之一，多發(fā)生于40歲以上的男性患者，在我國發(fā)病率和病死率較高，由于結(jié)腸癌早期癥狀隱匿，易被忽視，多數(shù)患者確診時(shí)已至中晚期，預(yù)后較差，因此對(duì)于結(jié)腸癌的早期診斷及判斷預(yù)后有重要意義[1]。Wilms腫瘤基因(Wilms’ tumor gene,WT1)是最早發(fā)現(xiàn)的與Wilms腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)的一類基因,其編碼的WT1蛋白通過識(shí)別、結(jié)合下游靶基因，產(chǎn)生激活或抑制等多種不同的生物學(xué)效應(yīng)，在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、組織器官的發(fā)育及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。WT1在肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，學(xué)者對(duì)WT1在白血病中的研究報(bào)道較多，但在結(jié)腸癌中的表達(dá)研究相對(duì)較少。我們采用免疫組化及RT-PCR等技術(shù),檢測結(jié)腸癌及正常結(jié)腸組織中WT1的表達(dá)，分析其與結(jié)腸癌患者的臨床病理特征及預(yù)后等關(guān)系，為研究結(jié)腸癌發(fā)生的分子機(jī)制及預(yù)防治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年1月至2015年12月湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院病理科存檔石蠟包埋的結(jié)腸標(biāo)本62例：結(jié)腸癌組織48例,其中男30例，女18例；平均年齡(54.7±11.7)歲。正常結(jié)腸組織14例,其中男9例，女5例；平均年齡(57.5±13.1)歲。 患者術(shù)前均未行放化療,術(shù)后均有明確的病理學(xué)診斷。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)/國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)對(duì)48例結(jié)腸癌標(biāo)本行TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期28例； 組織學(xué)分級(jí)高中分化29例，低分化19例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無轉(zhuǎn)移30例。2組在性別、年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。WT1鼠抗人抗體、SP免疫組化染色試劑盒購于賽信通(上海)生物試劑有限公司；總RNA提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；引物由NCBIprimer-BLAST軟件設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1SP免疫組化:按試劑盒說明進(jìn)行，WT1抗原采用酶消化修復(fù)，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，已知的陽性片作陽性對(duì)照。以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒定義為WT1陽性染色。每例隨機(jī)計(jì)數(shù)1 000個(gè)清晰的癌細(xì)胞,記錄陽性染色細(xì)胞數(shù)，以(陽性染色細(xì)胞數(shù)/1 000)×100%≥15%定為染色陽性，即過度表達(dá)。

1.2.2 總RNA的提?。孩購闹氨４嬖?80℃冰箱中取出組織塊重量約100mg，放在EP管中后研磨至勻漿狀，加入1mlTlrizol試劑，室溫靜置5min； ②加入200μl氯仿 ，振蕩15s，室溫靜置5min，離心(4℃、12 000r/min、15min)；③吸取上層液體，加入500μl異丙醇，混勻后室溫靜10min，離心(4℃、12 000r/min、15min)； ④棄上清，加入1ml75%乙醇，離心(4℃、7 500r/min、15min)棄上清；⑤加入RNasefreewater溶解RNA沉淀。

1.2.3cDNA合成：取2μl已提取的RNA，加入到98μl經(jīng) 0.1%DEPC滅活RNA酶的去離子水中，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.4RT-PCR引物及擴(kuò)增反應(yīng)：引物由Invitrogen公司合成:WT1上游引物：5’-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3’、下游引物：5’-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3；β-actin內(nèi)參上游引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’；下泳引物：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。擴(kuò)增取cDNA1μl依次加入10×緩沖液、4種dNTP、20pmol的WT1引物(β-actin引物為10pmol)、Taq聚合酶2U、25mmol/LMgCl28μl。擴(kuò)增條件：94℃變性1min、64℃退火1min、72℃延伸2min、共40個(gè)循環(huán)。

1.2.5PCR產(chǎn)物的分析：取PCR產(chǎn)物5μl，在2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5μg/ml溴化乙錠)，經(jīng)凝膠圖像分析儀對(duì)電泳條帶亮度分析拍照，采用成像分析系統(tǒng)處理。以β-actin作為內(nèi)參照，計(jì)算WT1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌及正常結(jié)腸組織中WT1的表達(dá) 在臨床和病理雙盲的情況下，由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師對(duì)所有切片在顯微鏡下觀察WT1的染色結(jié)果，WT1的陽性表達(dá)表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞核呈棕黃色染色。WT1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)率為87.50%(42/48)，明顯高于其在正常結(jié)腸組織中的表達(dá)率21.43%(3/14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 結(jié)腸癌組織WT1蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系WT1的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)；WT1在TNM分期Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期的陽性表達(dá)率分別為70.00%、100.00%；在高中分化組、低分化組的陽性表達(dá)率分別為72.22%、96.67%，WT1的表達(dá)隨腫瘤分期而升高、細(xì)胞分化降低而升高,2組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 WT1的表達(dá)及與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3WT1mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況WT1基因和β-actin內(nèi)參基因共同擴(kuò)增，對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，可以看出WT1基因mRNA條帶亮度及產(chǎn)量明顯高于正常結(jié)腸組織，分析儀分析電泳條帶亮度并進(jìn)行灰度值結(jié)果顯示W(wǎng)T1mRNA在結(jié)腸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為(2.08±0.44)，與正常組織的相對(duì)表達(dá)量(0.23±0.37)相較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 第1泳道：空白對(duì)照；第2泳道：癌旁組織；第3、4、5泳道：癌組織

2.4WT1蛋白表達(dá)與患者術(shù)后生存期分析 對(duì)48例結(jié)腸癌患者術(shù)隨訪，6例WT1蛋白表達(dá)陰性的結(jié)腸癌患者術(shù)后 4年累積生存率為70.12%，中位生存期38個(gè)月；42例WT1蛋白表達(dá)陽性的患者術(shù)后4年累積生存率為41.02%，中位生存期24個(gè)月，2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 WT1蛋白陰、陽性表達(dá)的患者術(shù)后生存曲線

3 討論

Wilms腫瘤基因是MaxWilm等于1989年從兒童腎母細(xì)胞瘤(Wilm's瘤)染色體11p13分離出來的腫瘤基因，含有10個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄mRNA產(chǎn)物長約3kb[3]。WT1基因有多種不同的RNA剪切方式，其編碼的蛋白為一多功能調(diào)控調(diào)節(jié)因子，主要功能是識(shí)別、結(jié)合某些生長因子基因的啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF2)、集落刺激因子Ⅰ(CSF-Ⅰ)、癌基因Bcl2、抑癌基因P53、NDRG2等[4-6]。因此WT1在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長、分化、凋亡以及腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用[7]。

國內(nèi)外學(xué)者對(duì)WT1進(jìn)行深入研究，WT1在白血病細(xì)胞、胰腺癌、肺癌、和甲狀腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)[8,9]。近來研究發(fā)現(xiàn)WT1的表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，國外學(xué)者Koesters等[10]應(yīng)用RT-PCR及Westernblot檢測分析了一系列人結(jié)腸癌細(xì)胞株WT1mRNA及其編碼蛋白的表達(dá)情況，并通過序列分析確定WT1基因鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)突變部位，結(jié)果結(jié)果示W(wǎng)T1mRNA在SW707、SW480 、SW948三類細(xì)胞株中高表達(dá)；在Colo320、KM12、LS180、Lovo、CX1、HT29、HCT116 等七類細(xì)胞株中也存在較高表達(dá)，而在LS174T和SW48兩類細(xì)胞株及來自人正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞中不表達(dá)；同時(shí)對(duì)15例原發(fā)性結(jié)腸癌組織中WT1mRNA水平進(jìn)行檢測，結(jié)果陽性表達(dá)率達(dá)86.68%(13/15),而在正常結(jié)腸黏膜組織中WT1mRNA的表達(dá)卻很低。使用人類白細(xì)胞抗原肽對(duì)WT1特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)誘導(dǎo)活化，活化的CTLs不僅溶解外源性同源肽，也抑制了結(jié)腸腫瘤細(xì)胞WT1的表達(dá)。這些研究結(jié)果證實(shí)了WT1基因表達(dá)產(chǎn)物的高表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用。

為探討WT1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)關(guān)系,我們采用免疫組織化學(xué)及RT-PCR分別檢測了WT1在48例結(jié)腸癌及14例正常結(jié)腸組織中的表達(dá)：WT1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)率為87.50%(42/48),明顯高于正常組織21.43%(3/14)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這一研究結(jié)果初步提示：結(jié)腸癌組織中WT1的高表達(dá)可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生。我們進(jìn)一步探討WT1與結(jié)腸癌臨床病理聯(lián)系:WT1有隨腫瘤分期升高、細(xì)胞分化降低而升高的趨勢，但WT1蛋白表達(dá)的高低與結(jié)腸癌患者術(shù)后生存期無明顯關(guān)系,綜合分析認(rèn)為WT1的高表達(dá)與結(jié)腸癌的惡性程度、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與預(yù)后關(guān)系不明,提示W(wǎng)T1的過度表達(dá)可能與結(jié)腸腫瘤的惡性程度有關(guān)，WT1是否可以作為指標(biāo)來反映結(jié)腸癌的臨床病理特征及預(yù)后,有待于進(jìn)一步收集隨訪資料來研究證實(shí)。

作為一個(gè)特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，WTl在多種腫瘤中異常表達(dá)。雖然我們的實(shí)驗(yàn)表明WTl在結(jié)腸癌中發(fā)揮著癌基因的作用，參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移，但WTl的具體生物學(xué)行為以及作用機(jī)制尚未完全清楚，需我們進(jìn)一步研究。WTl的多種生物學(xué)功能表明WTl是一個(gè)非常有前景的腫瘤治療靶點(diǎn)，設(shè)想以WT1基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行基因治療，抑制WT1基因轉(zhuǎn)錄活性，降低WT1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有可能為結(jié)腸癌的治療開辟新途徑。

1SiegelR，NaishadhamD，JemalA.Cancerstatistics,2013.CA:ACancerJournalforClinicians,2013,63:11-30.

2MartínezCH,DaveS,IzawaJ.Wilms’gene.AdvExpMedBiol,2010,685:196-209.

3CallKM，GlaserT，ItoCY,etal.Isolationandcharacterizationofazincfingerpolypeptidegeneatthehumanchromosome11Wilms’tumorlocus.Cell,1990,60:509-520.

4HarutaM,AraiY,SugawaraW.DuplicationofpaternalIGF2orlossofmaternalIGF2imprintingoccursinhalfofWilmstumorswithvariousstructuralWT1abnormalities.GenesChromosomesCancer,2008,47:712-727.

5FurusatoE,HidayatAA,ManYG,etal.WT1andBcl2expressioninmelanocyticlesionsoftheconjunctiva:animmunohistochemicalstudyof123cases.ArchOphthalmol,2009,127:964-969.

6DupontJ,WangX,MarshallDS,etal.WilmsTumorGene(WT1)andp53expressioninendometrialcarcinomas:astudyof130casesusingatissuemicroarray.GynecolOncol2004,94:449-455.

7ZirnB,HartmannO,GesslerM.ExpressionprofilingofWilmstumorsrevealsnewcandidategenesfordifferentclinicalparameters.Cancer,2006,118:1954-1962.

8 龔勇，趙秋,楊芳，等.胰腺導(dǎo)管腺癌組織中WT1,IGF-IR表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系.世界華人消化雜志,2006,14:2810-2814.

9 蒙秋，吳清萍，黃守國.WT1基因在子宮頸癌組織細(xì)胞中的表達(dá)及意義.疑難病雜志,2013，12:614-616.

10KoestersR,LinnebacherM,CoyJF,etal.WT1isatumor-associatedantigenincoloncancerthatcanberecognizedbyinvitrostimulatedcytotoxicTcells.Cancer,2004,109:385-392.

Expression and clinical significance of WT1 in colon cancer

GONGYong,TONGQiaoyun,ZHENGShihua.

DigestiveDiseaseResearchInstituteofSanxiaUniversity,DepartmentofGastroenterology,CentralPeople’sHospitalofYichangCity,Hubei,Yichang443003,China

Objective To observe the expression of WT1 in colon carcinoma, and to explore its clinical significance.Methods The expression levels of WT1 in 48 cases of colon carcinoma and 14 cases of normal colon tissues were detected by immunohistochemistry and semi quantitative RT-PCR.The correlation between the expression of WT1 and clinical pathological features as well as patient's prognosis was analyzed.Results The positive expression rates of WT1 in colon carcinoma were significantly higher than those in normal colon tissues (P<0.05).TheexpressionofWT1wasnotcorrelatedtopatient'sageandsex,differentiationdegreeoftumor(P>0.05),however,whichwasrelatedwithTNMstagingandlymphnodemetastasisoftumor(P<0.05).ThesurvivalanalysisshowedthattherewasnosignificantdifferenceinsurvivaltimebetweenpatientswithWT1positiveexpressionandpatientswithWT1negativeexpression(P>0.05).Conclusion The high expression of WT1 may play an important role in the pathogenesis and development of colon cancer,which may provide an new way for treatment of colon cancer.

WT1; colon cancer

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.015

443003 三峽大學(xué)消化病研究所 湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院消化內(nèi)科

R

A

1002-7386(2017)08-1176-03

2016-09-20)