李夢茜 +張振旺

摘要：嗜水氣單胞菌是動物和人類的致病菌，會引起水產(chǎn)動物敗血癥和人類腹瀉病等，對我國已造成了巨大的經(jīng)濟損失。采用細菌的分離、純化和篩選等步驟，獲得對嗜水氣單胞菌引起羅非魚敗血癥有抑制作用的菌株LFJK-11，并對其形態(tài)特征和生理生化特性進行分析。結(jié)果顯示，該菌株屬于鏈霉菌屬。通過對其16S DNA比對及其系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，該菌株與鏈霉菌屬相似性達到100%，該結(jié)果與其形態(tài)特征和生理生化鑒定結(jié)果一致。

關鍵詞：羅非魚；嗜水氣單胞菌；敗血癥；鏈霉菌；篩選；鑒定；形態(tài)特征；生理生化特征

中圖分類號： S943.125.42+9文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0129-02

收稿日期：2016-01-28

基金項目：生物化工廣西重點學科（河池學院）建設基金（201308）；廣西高校中青年教師基礎能力提升項目（編號：KY2016LX286）；河池學院校級重點科研課題（編號：XJ2016ZD001）；廣西壯族自治區(qū)級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練主項項目（編號：201610605079）。

作者簡介：李夢茜（1986—），女，河南周口人，碩士，講師，從事微生物藥物學。E-mail：limengxi66@126.com。

通信作者：張振旺，博士研究生，從事生物技術研究。E-mail：zhenwangzhang@126.com。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）廣泛存在于含水量豐富的土壤、淡水、污水、沼澤和糞便中，一部分是動物和人類的致病菌，會引起水產(chǎn)動物敗血癥和人類腹瀉病等[1-2]。嗜水氣單胞菌一直嚴重危害著水產(chǎn)動物養(yǎng)殖業(yè)和人類健康，已造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年水產(chǎn)動物養(yǎng)殖業(yè)因疾病造成的經(jīng)濟損失超過100億元[4]，可見水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治的任務十分艱巨。運用生物防治的手段篩選和應用嗜水氣單胞菌拮抗菌，應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，減少化學試劑的使用，以減少水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失。

1材料與方法

1.1材料

指示菌為嗜水氣單胞菌HCLF-2，由筆者所在實驗室從患敗血癥的羅非魚中分離得到；以嗜水氣單胞菌HCLF-2為指示菌，從土壤分離篩選獲得拮抗菌株 LFJK-11。

1.2方法

1.2.1拮抗菌株的篩選

采用平板稀釋培養(yǎng)法[5]培養(yǎng)菌株，根據(jù)微生物菌落特征（大小、形狀、邊緣形狀、表面結(jié)構(gòu)、光澤、透明度和顏色）將單菌落挑出并編號。將所獲得的土壤單菌落用PDA 培養(yǎng)基在28 ℃條件下培養(yǎng)4 d，采用抑菌圈法，以嗜水氣單胞菌HCLF-2為指示菌，篩選對嗜水氣單胞菌HCLF-2抑菌作用的菌株并保存。

1.2.2拮抗菌株的培養(yǎng)特征

選擇拮抗性能最佳的菌株，并將其接種于蔗糖察氏、燕麥、無機淀粉、馬鈴薯、葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基中，在28 ℃下培養(yǎng)3～7d，觀察并記錄待測菌在不同培養(yǎng)基上的生長形態(tài)、基內(nèi)菌絲、氣生菌絲及色素。

1.2.3生理生化特征的鑒定

測定纖維素水解、明膠液化、碳源利用、淀粉水解和H2S 產(chǎn)生等試驗[6]。

1.2.4菌株16S rDNA序列的測定及其系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株LFJK-11接種在LB 培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)12～18 h，參照文獻[7]的方法提取基因組DNA。以DNA 組為模板，以16S rDNA基因擴增通用引物進行PCR擴增，擴增出16S rDNA，[JP3]其中引物序列為：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-[JP]3′；1492R。5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。用1% 瓊脂糖凝膠進行電泳分離，用DNA 膠回收試劑盒純化，然后直接寄至上海生工測序部進行測序。將測序結(jié)果在NCBI 上進行比對分析，篩選出9株菌株16S rDNA的全序列，使用ClustalW軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌株篩選結(jié)果

經(jīng)拮抗檢測篩選到1 株對嗜水氣單胞菌HCLF-2有較強拮抗作用的菌株，編號為LFJK-11，抑菌圈直徑平均為156 mm（圖1）。如表1 所示，LFJK-11菌株對蘇云金桿菌、金黃色葡萄球菌、黑霉菌、大腸桿菌也有一定的拮抗作用，且該菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌效果最強，對黑霉菌抑菌效果最弱；發(fā)酵液稀釋30～60 倍后對這幾種病原菌仍有拮抗作用，可見該菌株發(fā)酵性能良好。

2.2拮抗菌株培養(yǎng)特征觀察

用劃線法將菌株分別接種在蔗糖察氏、燕麥、無機淀粉、馬鈴薯、葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基上，于28 ℃下培養(yǎng)7 d，結(jié)果如表2所示，葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基上的菌株生長最好，生長速度較快，菌落較大，邊緣呈放線狀向外擴散，表面干燥有突起，孢子呈圓形，具有土腥味。馬鈴薯培養(yǎng)基菌株生長優(yōu)良，向外擴散能力較強，且在培養(yǎng)3 d時菌落中出現(xiàn)金黃色疣，孢子呈鏈狀且菌落緊實不易挑取，培養(yǎng)7 d時顏色逐漸變深表面出現(xiàn)粉狀。

2.3菌絲特征

2.3.1MS培養(yǎng)基

應用插片法觀察菌絲特征，即分別在培養(yǎng)7、25 d后從MS培養(yǎng)基上取出插片，放在載玻片上滴加清水，放入40倍光鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示，LFJK-11菌株菌絲較細，無隔膜，呈垂直直線狀，分枝較多，如樹枝般相互緊密交叉。待氣生菌絲成熟后，逐漸分化成圓形孢子。菌絲顏色由淺色至深黑色。

2.3.2種子培養(yǎng)基

洗下MS培養(yǎng)基上的LFJK-11菌株菌落[CM（25]，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，于30[KG*3]℃、150[KG*3]r/min下培養(yǎng)3、7、[CM）]

[FK（W9][TPLMQ2.tif][FK）]

9 d，[JP2]再分別用結(jié)晶紫染色后在40倍光鏡下觀察，結(jié)果如表3所示，菌株菌絲細長，生長旺盛，呈放射狀向外生長并逐漸縮短增粗，致密交聯(lián)在一起，最終菌絲團松散、斷裂并向四周擴散。

2.4LFJK-11菌株生理生化特性

多種生理生化試驗結(jié)果如表4所示，LFJK-11菌株產(chǎn)淀粉水解酶、H2S，可以液化明膠，但不產(chǎn)纖維素酶，葡萄糖是比較理想的可利用的碳源。

2.5LFJK-11菌株16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

LFJK-11菌株基因組測序所得16S rDNA 堿基序列，于 NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST上進行比對，選取12株同源性高的菌株，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖3 所示，LFJK-11菌株以100% 的同源性屬于鏈霉菌屬。

3結(jié)論與討論

菌株的拮抗菌，經(jīng)鑒定為鏈霉菌。通過抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，LFJK-11菌株發(fā)酵液抑菌效果強，可以運用其發(fā)酵液來防治水產(chǎn)病原物。本試驗對LFJK-11菌株的生長特征、生理生化特征及其菌絲和基質(zhì)特征進行研究，并對其進行16S rDNA測序比對并構(gòu)建生物樹，最終確定該菌株為鏈霉菌屬菌株，所得結(jié)果與常規(guī)生理生化鑒定結(jié)果一致。

本試驗屬首次對LFJK-11菌株生長特征進行研究，且其發(fā)酵產(chǎn)物對于嗜水氣單胞菌HCLF-2菌株拮抗作用顯著，是一種較好的拮抗菌，對水產(chǎn)動物病原菌有較強的抑制活性，起抗病能力。此研究對于探尋水產(chǎn)動物及人類腸道病原物的生物防治以及水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著十分重要的作用。

[HS2]參考文獻：

[1]陸承平. 致病性嗜水氣單胞菌綜述[J]. 水產(chǎn)學報，1992，16（3）：282-286.[HJ1.95mm]

[2]陳懷青. 氣單胞菌研究進展[J]. 魚類病害研究，1997，19（3）：18-33.

[3]Hanninen M L.Phenotypic characteristics of the three hybridization groups of Aeromonas hydrophila complex isolated from different sources[J]. Journal of Applied Bacteriology，1994，76：455-462

[4]陳愛平. 2005年中國水產(chǎn)養(yǎng)殖病害監(jiān)測報告（一）[J]. 科學養(yǎng)魚，2006（8）：48-49.

[5]朱麗梅，侯建文，羅鳳霞，等. 百合灰霉病的診斷及其病原物的分離純化[J]. 金陵科技學院學報，2009，25（3）：59-63.

[6]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：370-398.

[7]沈萍，陳向東. 微生物學實驗[M]. 4版.北京：高等教育出版社，2007：149-152.

趙萬樂，李艷玲，朱松波，等. 稀釋液中添加L-半胱氨酸對雞精液室溫保存的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（3）：131-133.