張渝，陽倩

· 論著 ·

卡維地洛治療對病毒性心肌炎小鼠心肌組織中細胞因子影響的分析

張渝1，陽倩1

目的 探討卡維地洛治療對病毒性心肌炎小鼠心肌組織中細胞因子的影響。方法 雄性4周齡BALB/c小鼠75只，隨機分為對照組、心肌炎組、心肌炎+卡維地洛治療組，每組各25只。將存活小鼠取血后處死并留取心臟標本。光鏡觀察各組小鼠心肌組織病理改變情況，采用高效液相色譜－電化學法檢測血漿去甲腎上腺素含量，熒光定量實驗檢查心肌組織中白介素-6（IL-6）mRNA表達，Western blot檢測心肌組織中IL-6蛋白表達水平。結果 在治療后的第7 d與第14 d，心肌炎組小鼠的心臟重量（HW）/身體重量（BW）比值、血漿去甲腎上腺素濃度明顯高于對照組，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05），卡維地洛組小鼠的HW/BW比值、血漿去甲腎上腺素濃度明顯低于心肌炎組，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；對照組小鼠未見異常病理變化，而在治療后的第7 d與第14 d，卡維地洛組小鼠的心肌炎癥浸潤、心肌細胞變性壞死較心肌炎組小鼠明顯減輕，其組織評分也低于心肌炎組，有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；在治療后的第7 d心肌炎組小鼠的心肌組織IL-6 mRNA和蛋白的表達明顯高于對照組小鼠，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05），卡維地洛組的小鼠的心肌組織IL-6 mRNA和蛋白的表達較心肌炎組明顯降低，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05），在治療后的14 d，三組小鼠的心肌組織IL-6 mRNA和蛋白的表達無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結論 卡維地洛可以抑制病毒性心肌炎小鼠IL-6的表達，保護心肌組織，具有較好的療效。

病毒性心肌炎；卡維地洛；白介素-6；兒茶酚胺

病毒性心肌炎是一種因病毒感染造成的免疫損傷與心肌壞死，嚴重者可出現(xiàn)心力衰竭、擴張性心肌病，甚至是心源性猝死[1]。心肌出現(xiàn)損傷后，能夠促使腎素-血管緊張素（RAS）與交感-腎上腺素能系統(tǒng)（SAS）活性增加，進而誘導心肌組織中細胞因子白介素-6（IL-6）的表達[2]。IL-6是心肌炎發(fā)病的代表性促炎細胞因子，能夠造成心肌受損，誘導心律失常，導致心肌重構。有報道稱[3]，兒茶酚胺作為一種交感神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛的參與IL-6的調(diào)控，在病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展中扮演極其重要的角色?？ňS地洛是第 3代β受體阻滯劑，不僅可阻斷兒茶酚胺從而抑制炎癥反應，還可以調(diào)控細胞因子水平。因此，本研究觀察卡維地洛治療對病毒性心肌炎小鼠的兒茶酚胺及細胞因子IL-6 水平的影響，以此為臨床診療提供建議。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 雄性BALB/c小鼠75只（由上海實驗動物中心提供），4周年齡，體重150～200 g。小鼠分籠飼養(yǎng)，正常光照，自由飲水和攝食，溫度22℃，相對濕度50%～70%。

柯薩奇病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）Nancy株（由美國ATCC公司提供）經(jīng)Hep2細胞（來自上海生化細胞所）活化增殖，于細胞的病變效應（CPE）》75%（++—+++）時收獲，且滴度控制為107TCID 50/0.1 mL。按簡單完全隨機分組法將小鼠隨機分為對照組、心肌炎組、卡維地洛組，每組25只。其中，心肌炎組與卡維地洛組小鼠于腹腔注射0.1 mL濃度為100 TCID50/0.1 mL的柯薩奇病毒稀釋液，對照組于腹腔注射等量的0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）?？ňS地洛組于病毒接種后的第1 d行灌服卡維地洛，劑量為10 mg·kg-1·d-1，14 d為一個療程，對照組與心肌炎組于同一時間采用同法灌服等量0.1 mmol/L PBS。

1.2 主要試劑 卡維地洛片（12.5mg，寧波天衡藥業(yè)股份有限公司）；IL-6Mrna檢測試劑盒（Epitomics公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IL-6抗體及相關染色試劑（重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限公司）；去甲腎上腺素（NE）標準品（江蘇蘭健藥業(yè)有限公司）。

1.3 標本留取 各組小鼠于治療第7 d時，隨機從各組選取10只小鼠，取血后經(jīng)斷頸處死，用眼科剪將小鼠心臟沿左室中線切為兩半，1/2心臟組織行細胞因子的測定，余下的1/2心臟組織固定于4%多聚甲醛溶液，行病理組織學檢查。于一個療程結束時，隨機選取各組余下小鼠中剩余的10只并處死，方法與目的同第7 d。

1.4 小鼠心臟重量（HW）/身體重量（BW）比值的測定 分別于治療第7 d及一個療程結束時測定小鼠HW及BW，并計算HW/BW。

1.5 心肌組織病理學檢查 將固定于4%甲醛溶液中的心臟組織，常規(guī)脫水，再用10%EDTA脫鈣。進行石蠟包埋、常規(guī)切片，控制厚度為5μm，HE染色后于光鏡下查看心肌的病理改變。判斷標準為：出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，每張心臟切片中心肌壞死＜25%（+）作為1分，25%～50%（++）作為2分，51%～75%（+++）作為3分，＞75%作為4分[4]。

1.6 小鼠血漿去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）水平檢測 采用高效液相色譜－電化學法檢測[5]，準備Zorbax CB-Aq反相色譜柱（150 mm ×3 mm，3.5μm），制備對照品溶液后，添加0.1mol/L的高氯酸于血漿樣本中，并采取置冷凍離心機（＜4℃）以18 000 r/min，分離15 min，留取上清液后繼續(xù)以18 000 r/min，分離15 min，留取上清液，用0.22 μm的濾膜進行過濾，繪制標準曲線后計算NE含量。

1.7 心肌組織IL-6 mRNA的表達 Trizol法提取心肌總RNA并測定其濃度及純度。根據(jù)IL-6 mRNA序列設計熒光定量PCR引物：上游5’-CAAGAC CATTGCACGAGAGG-3’，下游5’-CCCGAAG GCAGAAGTGAAG-3’，退火溫度59℃，共40個循環(huán)。內(nèi)參IL-6熒光定量PCR引物序列：上游5’TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游5’-CTA AGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，退火溫度為59℃，共40個循環(huán)。取同一樣本總RNA 1μL進行RT-PCR反應。

1.8 Western blot測定小鼠心肌組織中IL-6蛋白的含量 取小鼠心肌組織至離心管，加500μl裂解液，5μl蛋白磷酸酶抑制劑混合物，剪碎組織，高速機械勻漿器破碎組織。將組織勻漿1.5 ml轉移至離心管，加3 ml抽提試劑及5 μl蛋白磷酸酶抑制劑混合物混勻，3℃靜置15 min。10 000r/min離心8 min，取上下液體中間的蛋白膜，加入2% SDS水溶液，90℃煮15 min。用IL-6蛋白檢測試劑盒在多功能酶標儀上檢測蛋白濃度，結果采用EXCEL 軟件制圖。

1.9 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用例數(shù)（構成比）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組小鼠HW/BW比值的對比 在治療后的第7 d與第14 d，心肌炎組小鼠的HW/BW比值明顯高于對照組，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；卡維地洛組小鼠的HW/BW比值明顯低于心肌炎組，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表1）。

2.2 心肌的病理組織學改變 對照組小鼠未見異常病理變化（圖1），而在治療后的第7 d與第14 d，卡維地洛組小鼠的心肌炎癥浸潤、心肌細胞變性壞死較心肌炎組小鼠明顯減輕，其組織評分也低于心肌炎組，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表1）。

2.3 血漿NE濃度 在治療后的第7 d和第14 d心肌炎組小鼠的血漿NE濃度明顯高于對照組小鼠，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05），卡維地洛組小鼠的血漿NE濃度較心肌炎組明顯降低，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（圖2）。

表1 各組小鼠HW/BW比值與心肌病理組織學評分比較（±s）

表1 各組小鼠HW/BW比值與心肌病理組織學評分比較（±s）

注：HW：心臟重量；BW：身體重量；與對照組比較，aP＜0.05；與心肌炎組比較，bP＜0.05

項目 對照組（n=10） 心肌炎組（n=10） 卡維地洛組（n=10）HW/BW比值（10-3） 4.24±0.21 4.31±0.23 6.54±0.47a6.79±0.51a5.36±0.37ab5.41±0.28ab炎癥 - - 2.63±0.34 1.82±0.27 1.14±0.21b0.84±0.17b壞死 - - 1.92±0.21 2.66±0.23 1.14±0.14b1.4±0.21b

圖1 各組小鼠心肌病理組織學變化（HE，×200）A：對照組；B：心肌炎組（第7 d）；C：卡維地洛組（第7 d）；D：心肌炎組（第14 d）；E：卡維地洛組（第14 d）

2.4 心肌組織IL-6 mRNA的表達 在治療后的第7 d心肌炎組小鼠的心肌組織IL-6 mRNA的表達明顯高于對照組小鼠，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05），卡維地洛組的小鼠的心肌組織IL-6 mRNA的表達較心肌炎組明顯降低，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。在治療后的14 d，三組小鼠的心肌組織IL-6 mRNA的表達無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖3）。

2.5 心肌組織IL-6蛋白表達水平 在治療后的第7 d心肌炎組小鼠的心肌組織IL-6蛋白的表達明顯高于對照組小鼠，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05），卡維地洛組的小鼠的心肌組織IL-6蛋白的表達較心肌炎組明顯降低，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。在治療后的14 d，三組小鼠的心肌組織IL-6蛋白的表達無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖4）。

圖2 三組小鼠血漿去甲腎上腺素濃度的對比（±s，n=10）注：與對照組比較，aP＜0.05；與心肌炎組比較，bP＜0.05

圖3 三組小鼠心肌組織IL-6mRNA表達的對比（±s，n=10）注：與對照組比較，aP＜0.05；與心肌炎組比較，bP＜0.05

圖4 三組小鼠心肌組織IL-6蛋白表達水平的對比（±s，n=10）注：與對照組比較，aP＜0.05；與心肌炎組比較，bP＜0.05

3 討論

有較多的細胞因子參與病毒性心肌炎的病情發(fā)展中，其中較為典型的是IL-6。另外，有報道稱[6]，在患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺含量較高，其對心肌組織具有一定的毒性作用。目前尚無針對治療病毒性心肌炎的特效藥，臨床上多以保守藥物治療為主。β受體阻滯劑是慢性心衰的首選藥物，因其可抑制慢性心衰患者體內(nèi)的兒茶酚胺含量，從而降低心肌的毒性[7]?？ňS地洛屬于第3代β受體阻滯劑，其廣泛應用于高血壓及心衰患者的治療中，具有廣泛的生物學效應，如抗氧化、抗增殖、抑制心肌細胞凋亡等作用，卡維地洛主要通過降低線粒體內(nèi)鈣超載，從而抑制過氧化氫的表達，抑制細胞凋亡[8]。但有關卡維地洛在治療病毒性心肌炎中的應用尚不多見，本研究通過腹腔接種CVB3制成病毒性心肌炎小鼠模型，來觀察卡維地洛在病毒性心肌炎小鼠中的應用。

在本研究中，卡維地洛組的小鼠的HW/BW比值、心肌炎癥壞死以及小鼠存活率都明顯優(yōu)于心肌炎組小鼠（P＜0.05）。這都說明卡維地洛可以有效的保護病毒性心肌炎小鼠的心肌組織，減少心肌受損，提高存活率。這與吳蓉洲的研究結果是一致的[9]。在對各組小鼠的血漿NE含量對比發(fā)現(xiàn)，在治療后的第7 d及第14 d，心肌炎組的血漿NE含量明顯高于對照組小鼠（P＜0.05），說明經(jīng)CVB3感染后的小鼠其體內(nèi)兒茶酚胺含量明顯升高。有研究表明[10]，給心肌炎小鼠體內(nèi)注射NE不僅可以加重心肌損傷，還可以增加促炎細胞因子的含量。在治療后的第7 d及第14 d卡維地洛組小鼠的血漿NE含量較心肌炎組明顯降低（P＜0.05），說明卡維地洛可以降低兒茶酚胺的含量，從而抑制兒茶酚胺的毒性作用。兒茶酚胺可刺激β腎上腺能受體，介導T細胞功能，從而調(diào)控炎癥細胞因子。IL-6就是較為典型的受兒茶酚胺調(diào)控的細胞因子。而IL-6的表達可以促進病毒性心肌炎患者病情的發(fā)展，有研究表明，通過基因敲除來抑制IL-6的表達，可以明顯改善心肌組織的損傷。在本研究中，我們對各組小鼠的心肌組織IL-6 mRNA及IL-6蛋白表達水平進行對比發(fā)現(xiàn)，在治療后的第7 d，卡維地洛組小鼠的心肌組織IL-6 mRNA及IL-6蛋白表達水平均明顯低于心肌炎組小鼠（P＜0.05）。說明卡維地洛可以通過抑制兒茶酚胺的毒性作用來降低心肌組織IL-6 mRNA及IL-6蛋白的表達，避免心肌組織進一步受損，提高存活率。

綜上所述，卡維地洛可以抑制兒茶酚胺的毒性作用，降低IL-6表達水平，保護心肌組織不受損傷，提高存活率，但其機制需進一步研究。

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本文編輯：楊新穎，姚雪莉

Effect of carvedilol on cytokines in myocardial tissue of mice with viral myocarditis

ZHANG Yu*, YANGQian.*Department of pediatrics, Sichuan Provincial People's Hospital, Chengdu 610072, China.

YANG Qian, E-mail: 2500743036@qq.com

Objective To investigate the effect of carvedilol on cytokines in myocardium of mice with viral myocarditis. Methods 4-week-old BALB / c male mice were randomly divided into control group, myocarditis group and myocarditis + carvedilol treatment group, 25 rats in each group. The surviving mice were sacrificed and the heart specimens were taken. The pathological changes of myocardium were observed by light microscope. The plasma norepinephrine content was measured by high performance liquid chromatography-electrochemical method. Fluorescence quantitative test was used to examine the expression of interleukin-6 (IL-6) mRNA in myocardium. Western blot was used to detect the expression of IL-6 protein in myocardium. Results The levels of HW / BW and plasma norepinephrine in the myocarditis group were significantly higher than those in the control group at the 7th and 14th day after treatment (P＜0.05). The ratio of HW / BW and plasma norepinephrine in carvedilol group were significantly lower than those in myocarditis group (P＜0.05). There were no abnormal pathological changes in the control group. On the 7th and 14th day after treatment, the myocardium infiltration and myocardial degeneration and necrosis of the carvedilol group were significantly less than those in the myocarditis group, and the tissue score was lower than that in the myocarditis group (P＜0.05). The expression of IL-6 mRNA and protein in the myocardium of the myocarditis group was significantly higher than that of the control group (P＜0.05). The expression of IL-6 mRNA and protein in myocardial tissue of carvedilol group was significantly lower than that in myocarditis group (P＜0.05). There was no significant difference in the expression of IL-6 mRNA and protein in the myocardium of the three groups (P＞0.05) at 14 days after treatment. Conclusion Carvedilol can inhibit the expression of IL-6 in mice with viral myocarditis and protect the myocardium, which has a good effect.

Viral myocarditis; Carvedilol; Interleukin-6; Catecholamine

R542.21

A

1674-4055(2017)03-0317-04

1610072 成都,四川省人民醫(yī)院兒科

陽倩,E-mail:2500743036@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.03.17