李曉冉,薛耀明
· 論著 ·
醋酸敏感的G蛋白耦聯(lián)受體FFAR2調(diào)控胰島素分泌機制的研究
李曉冉1,薛耀明1
目的 探討對醋酸敏感的G蛋白耦聯(lián)受體-短鏈脂肪酸受體2(FFAR2)及其配體對胰島素分泌的影響和相關(guān)機制。方法 使用以C57BL/6J為背景的野生型(WT)小鼠(n=17)和敲除編碼受體基因Ffar2的轉(zhuǎn)基因(KO)小鼠(n=15),分別于第6周和第26周測定體重、空腹血糖及胰島素水平。提取小鼠胰島細胞,隨機分組分別給予不同濃度葡萄糖和FFAR2配體物質(zhì)(SCA14、SCA15、CPTB和CMTB)刺激,并使用ELISA方法測定胰島素分泌量。結(jié)果 不同基因型小鼠的體重、空腹血糖及胰島素水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。體外胰島β細胞胰島素分泌實驗中,KO型胰島細胞在低濃度葡萄糖刺激下胰島素分泌量與WT型無差別,高濃度葡萄糖刺激下KO型胰島細胞胰島素分泌量少于WT型,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。類似生理濃度的醋酸鹽(1mM)刺激胰島素分泌,在WT型胰島細胞中,胰島素分泌量是無醋酸鹽時的2倍以上,在KO型胰島細胞中,促進作用減弱。FFAR2配體物質(zhì)SCA14、SCA15在WT型同樣促進胰島素分泌,而在KO型胰島細胞中則無類似作用。另一類FFAR2配體物質(zhì)CMTB、CPTB在WT型和KO型胰島細胞中均抑制胰島素分泌。結(jié)論 敲除Ffar2不影響小鼠的生長發(fā)育。FFAR2可調(diào)控胰島素分泌,并具有血糖依賴性。作為FFAR2的主要配體,醋酸可刺激胰島素分泌且具有受體依賴性。其他FFAR2配體中,SCA14、SCA15與醋酸作用類似,但CPTB和CMTB抑制胰島素分泌且不依賴受體產(chǎn)生作用。
心血管疾?。惶悄虿?;FFAR2;醋酸鹽;小鼠
糖尿病是心血管疾病的重要伴發(fā)疾病,冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊叩奶谴x異常率(包括糖尿病及糖尿病前期)約為80%[1]。常用的促胰島素分泌劑通過K+通道產(chǎn)生作用,由于其非選擇性,關(guān)閉胰島β細胞上K+通道的同時對心血管系統(tǒng)亦起作用,導(dǎo)致不同程度的心血管疾病風(fēng)險[2]。研究表明,醋酸可以影響一系列代謝活動,新近發(fā)現(xiàn)了一種對醋酸敏感的G蛋白耦聯(lián)受體—短鏈脂肪酸受體2(FFAR2),F(xiàn)FAR2的基因Ffar2在多個器官中均有發(fā)現(xiàn),并在人體一系列代謝活動中起重要調(diào)控作用[3-6]。然而,醋酸和FFAR2對胰島素分泌的具體影響仍不明確。為此,本實驗試圖探究包括醋酸在內(nèi)的不同F(xiàn)FAR2配體對胰島素分泌的影響和其影響是否具有受體依賴性,為藥物開發(fā)尋找新途徑。
1.1 實驗動物 使用以C57BL/6J為背景的人Ffar2雜合子小鼠(Ffar2+/-)獲取Ffar2野生型(WT)及完全敲除編碼受體基因Ffar2的轉(zhuǎn)基因型小鼠(KO),應(yīng)用文獻PCR技術(shù)方法[3]測定小鼠的基因型。小鼠飼養(yǎng)條件為普通飲食,明暗周期12 h(8:00~20:00),溫度控制在23±2℃。
1.2 實驗試劑及儀器 葡萄糖、胰島素測定ELISA試劑盒(ALPCO)、RNA提取試劑盒及DNase I試劑(Applied Biosystems)、醋酸鈉(Sigma)、丙炔酸(SCA14,Sigma)、丁炔酸(SCA15,Sigma)、CMTB(Tocris Bioscience)、CPTB(Millipore)、酶標(biāo)儀(Bio-Rad)、血糖儀(ACCU-CHEK Integra型,羅氏)。
1.3 方法
1.3.1 空腹葡萄糖、胰島素測量及葡萄糖耐量測定(GTT) 飼養(yǎng)小鼠至第6周、24周時,實驗前一晚小鼠禁食(20:00~次日8:00),第2 d取尾靜脈血,使用血糖儀檢測血糖,并使用ELISA方法測量血胰島素。上述同一批小鼠飼養(yǎng)至第24周,進行GTT,實驗前一晚小鼠禁食12 h(20:00~次日8:00),后進行腹腔注射糖耐量試驗(IPGTT)。注射葡萄糖劑量為2 g/kg,注射葡萄糖后0、15、30、60、120 min取尾靜脈血,使用血糖儀檢測血糖。
1.3.2 胰島細胞分離及培養(yǎng) 按照文獻[7]方法,使用膠原酶分解并分離小鼠胰島細胞。主要步驟為通過胰島管向胰臟注射3 ml膠原酶(濃度為0.8 mg/ml,使用HBSS溶解)。隨后,胰臟被分離,在37℃條件下培養(yǎng)17 min并通過400 μm的篩孔網(wǎng)過濾。分解結(jié)束后,使用4℃ HBSS清洗胰島細胞,并使用密度梯度離心法分離獲得胰島細胞,在37℃培養(yǎng)液(RPMI 1640,10%牛血清,1%谷氨酰胺,1%青霉素/鏈霉素)中培養(yǎng)過夜,第2 d用于實驗。
1.3.3 體外胰島細胞胰島素分泌量測定 分別從WT型及KO型小鼠體內(nèi)提取25個胰島細胞(每組重復(fù)4次),在Krebs Ringer緩沖液(130 mM NaCl,4.7 mM KCl,0.5 mM NaH2PO4,0.5 mM MgSO4,1.5mM CaCl2,10mM HEPES,0.1% BSA,pH 7.4)中培養(yǎng)30 min,然后移入葡萄糖濃度為2.8 mM的KRB緩沖液并在37℃培養(yǎng)60 min。隨后在顯微鏡下挑選大小均等的胰島細胞,以5個為一組移入1 ml含有葡萄糖和不同刺激物的KRB緩沖液中,在37℃、以45轉(zhuǎn)/min晃動速率下培養(yǎng)60 min。葡萄糖濃度包括:2.8 mM、5.6 mM、11.2 mM、16.7 mM,刺激物包括:1 mM醋酸鈉,100μM丙炔酸,100μM丁炔酸,100μM CMTB,100μM CPTB。培養(yǎng)結(jié)束后,取定量的上清液并使用ELISA方法測定胰島素濃度。
1.3.4 體外胰島細胞內(nèi)胰島素總量測定 分別從WT型及KO型小鼠體內(nèi)提取25個胰島細胞(每組重復(fù)4次),移入酸性酒精溶液(70%酒精,0.18 M鹽酸)中,使用超聲裂解細胞并在4℃下過夜,第2 d使用ELISA法測定胰島素含量。
1.3.5 RT-PCR檢測FFAR2 mRNA的表達 按照試劑盒說明提取RNA,同時使用DNase I去除DNA污染,用 Super Script II逆轉(zhuǎn)錄酶生成cDNA。FFAR2引物上游序列:5’-GGCTTCTACAGCAGCATCT A-3’,下游:5’-AAGCACACCAGGAAATTAA G-3’;采用β-actin為內(nèi)參照,內(nèi)參引物上游序列:5’-AGGTCATCACTATTGGCAAC-3’,下游:5’-ACTCATCGT- ACTCCTGCTTG-3’。擴增程序依據(jù)文獻[8]進行。
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 16. 0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,計量資料以(±s)表示,多組間比較采用方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 不同基因型小鼠體重、血糖及胰島素水平比較 通過RT-PCR確定KO基因型小鼠的Ffar2表達相較于WT基因型小鼠顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。飼養(yǎng)KO型小鼠15只、WT型小鼠17只至26周,生長狀態(tài)良好。結(jié)果顯示,小鼠體重、空腹血糖及胰島素水平在Ffar2 WT型與KO型之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。進一步對各組小鼠進行IPGTT實驗,結(jié)果顯示,IPGTT在基因型間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(圖2)。
2.2 不同基因型小鼠體外胰島細胞的胰島素分泌水平比較 不同基因型小鼠胰島β細胞內(nèi)胰島素總量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3),且均隨著葡萄糖濃度升高胰島素分泌量增加。當(dāng)葡萄糖濃度較低時(2.8 mM,5.6 mM,11.2 mM),兩種基因型的胰島細胞所分泌胰島素量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。但在高糖濃度下(16.7 mM),KO型胰島細胞分泌胰島素量少于WT型胰島細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4A)。
圖1 不同基因型小鼠Ffar2相對表達水平比較注:WT:野生型;KO:Ffar2基因敲除型;*P<0.05
表1 不同基因型小鼠體重、空腹血糖及空腹胰島素水平比較
圖2 不同基因型小鼠IPGTT血糖水平比較注:WT:野生型,n=17;KO:Ffar基因敲除型,n=15;n.s:差異無統(tǒng)計學(xué)意義
圖3 不同基因型小鼠胰島細胞內(nèi)胰島素含量比較注:WT:野生型,n=17;KO:Ffar基因敲除型,n=15;n.s:差異無統(tǒng)計學(xué)意義
圖4 不同基因型小鼠體外胰島細胞胰島素分泌水平比較注:WT:野生型,n=17;KO:Ffar基因敲除型,n=15;*P<0.05
2.3 不同F(xiàn)FAR2配體物質(zhì)對胰島素分泌影響的比較 加入類似生理濃度的醋酸鹽(1 mM)對活體外胰島細胞進行刺激后,WT型胰島細胞的胰島素分泌量是無醋酸鹽時的2倍以上,而KO型胰島細胞的分泌量無明顯變化(圖4B)。加入其他幾種選擇性FFAR2激動劑進行實驗,羥酸鹽衍生物(SCA,包括SCA14、SCA15)和苯乙酰胺衍生物(包括CPTB和CMTB)。結(jié)果表明,在WT型胰島細胞中,SCA14、SCA15促進胰島素分泌,CPTB和CMTB則相反。在KO型胰島細胞中,SCA14、SCA15對胰島素分泌無明顯影響,而CPTB和CMTB抑制胰島素分泌(圖4C、圖4D)。
糖尿病作為心血管疾病的重要伴發(fā)疾病,需得到及時的診斷和治療[1]。目前,經(jīng)常使用促胰島素分泌劑治療糖尿病,常用的促胰島素分泌劑通過作用于K+通道產(chǎn)生作用,由于其非選擇性,同時對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生影響,并導(dǎo)致不同程度的心血管疾病風(fēng)險[2]。因此,尋找新的降血糖藥物具有重要的意義。
一直以來,民間醫(yī)學(xué)都有運用食醋治療疾病的傳統(tǒng),很多醫(yī)學(xué)研究證實了食醋的醫(yī)療作用,如可以降低血壓[9,10]、減少脂肪堆積[11]、改善胰島素抵抗[12]等。食醋的主要成分為醋酸[12-14]。在人體血液循環(huán)中有多種短鏈脂肪酸,醋酸是其主要成分,并主要由人體腸道內(nèi)細菌發(fā)酵產(chǎn)生[15]。因此,更多的研究直接作用于醋酸,并證實了醋酸可以影響一系列代謝活動,有助于降低血壓、提高胰島素敏感性、調(diào)節(jié)胰島素分泌等[11,12,16-19],但其作用機制尚不明確。
對醋酸敏感的受體FFAR2的發(fā)現(xiàn),為醋酸的作用機制提供了可能的解釋。FFAR2是一種G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR),表達FFAR2的基因Ffar2在包括胰島在內(nèi)的多種器官組織中均有發(fā)現(xiàn)。盡管FFAR2可以被多種短鏈脂肪酸激活,但其對醋酸鹽的敏感性最高[20]。已有研究證實,F(xiàn)FAR2在人體一系列代謝活動中起重要調(diào)控作用[3-6]。通過基因表達及免疫熒光法證實,胰島β細胞同樣表達Ffar2[6,21,22],在肥胖(ob/ob)和糖尿?。╠b/ db)小鼠模型中,胰島細胞中Ffar2的表達均有上調(diào)[23]。
葡萄糖是胰島細胞分泌胰島素的主要刺激物,其原理稱為葡萄糖依賴的胰島素分泌(GSIS)。我們研究證實,F(xiàn)FAR2缺失會導(dǎo)致高濃度葡萄糖條件下的胰島素分泌功能受損,但在低葡萄糖濃度條件下時,胰島素分泌功能不受FFAR2影響,說明FFAR2可促進胰島素分泌并具有血糖依賴性。作為FFAR2的主要刺激物,生理濃度下醋酸鹽可促進胰島素分泌,并部分依賴FFAR2調(diào)控GSIS功能。但不同F(xiàn)FAR2配體物質(zhì)產(chǎn)生的影響與醋酸鹽并不完全一致,實驗證實,SCA14、SCA15可促進胰島素分泌,并且該作用是FFAR2依賴性的。而對于另一類配體,CPTB及CMTB則抑制胰島素分泌且不是完全依賴于FFAR2的。
因此,醋酸可通過FFAR2對胰島素分泌產(chǎn)生影響,因為這種促胰島素分泌作用為血糖依賴性的,減低了低血糖的可能性,同時由于不通過K+通道促胰島素分泌,降低了對心血管風(fēng)險,這些都揭示了研究成果廣闊的應(yīng)用前景。但同時FFAR2對胰島素分泌影響的雙面性顯示了FFAR2介導(dǎo)的分子通路的復(fù)雜性,也說明胰島β細胞內(nèi)的FFAR2通路亟待更多的研究。
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本文編輯:姚雪莉
Mechanism of acetate-sensitive G protein-coupled receptor-FFAR2 in regulating insulin secretion
LIXiao-ran*, XUE Yao-ming.*Department of Endocrinology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China.
XUE Yao-ming, E-mail: xueyaoming999@126.com
Objective To investigate the influence of acetate-sensitive G protein-coupled receptor (GPCR)-free fatty acid receptor 2 (FFAR2) its ligands on insulin secretion and relative mechanism. Methods The wild-type (WT) mice with C57BL/6J background (n=17) and Ffar2-knockout (KO) mice (n=15) were chosen, and the levels of weight, fasting blood glucose (FBG) and insulin level were detected on the 6th w and 26th w respectively. The islet cells were collected from mice, and divided randomly into groups. All groups were, respectively, given glucose in different doses and stimulation of FFAR2 ligands (SCA14, SCA15, CPTB and CMTB), and insulin secretion level was detected by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results The difference in weight, FBG and insulin level had no statistical significance in mice with different genotypes (all P>0.05). In the test of in vitro insulin secretion of pancreatic β cells, insulin secretion level stimulated by low-dose glucose had no difference in KO islet cells and WT islet cells, and that stimulated by high-dose glucose was lower in KO islet cells than that in WT islet cells (P<0.05). Acetate in the dose similar to physiological dose (1mM) stimulated insulin secretion. The insulin secretion level was 2 times more than that without acetate stimulation in WT islet cells, and this stimulating effect decreased in KO islet cells. SCA14 and SCA15 stimulated insulin secretion in WT islet cells, and had no similar effect in KO islet cells. CPTB and CMTB stimulated insulin secretion in both WT islet cells and KO islet cells. Conclusion The knockout of Ffar2 has no effect on mouse growing development. FFAR2 can regulate insulin secretion and has blood glucose dependency. Acetate, as a main ligand of FFAR2, can stimulate insulin secretion and has receptor dependency. Among other ligands of FFAR2, SCA14 and SCA15 have the similar effect as acetate, and CPTB and CMTB can inhibit insulin secretion and have no receptor dependency.
Cardiovascular diseases; Diabetes; Free fatty acid receptor 2; Acetate; Mice
R587.1
A
1674-4055(2017)03-0293-04
1510515 廣州,南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院內(nèi)分泌科
薛耀明,E-mail:xueyaoming999@126.com
10.3969/j.issn.1674-4055.2017.03.11