頡旺軍，蒲瑞生，方曉麗，劉丁龍，權可，秦曉光，蘇成紅

甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000

頰針對類風濕關節(jié)炎家兔血漿代謝物表達的影響

頡旺軍，蒲瑞生，方曉麗，劉丁龍，權可，秦曉光，蘇成紅

甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000

目的 觀察頰針和體針對類風濕關節(jié)炎模型家兔血漿代謝組學的影響，探尋與頰針和體針作用機制有關的代謝物。方法 選取大耳白兔16只，采用完全弗氏佐劑誘導類風濕關節(jié)炎模型，造模后頰針組取頰針“膝”穴，用13 mm×0.32 mm毫針直刺0.2～0.5 mm，捻轉(zhuǎn)為主，穴位刺激15 s，每日1次。體針組選取“膝眼”“足三里”，用13 mm×0.32 mm毫針直刺2～3 mm，每隔5 min行針1次，采用捻轉(zhuǎn)針法，100次/min，行針15 s，每日1次。連續(xù)治療5 d后應用UPLC-QTOF/MS檢測各組血漿代謝物，采用相似度分析、系統(tǒng)聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）進行研究，通過載荷分析確定有意義的代謝物。結果 相似度分析、HCA及PCA均表明體針組、頰針組、模型組及正常組血漿樣品中內(nèi)源性代謝物存在顯著差異；OPLS-DA能將4組不同處理家兔血漿樣品代謝物在三維象限中完全分開，且各自樣品均聚集在一起；載荷分析表明，頰針組與模型組、體針組與模型組間19種內(nèi)源性代謝物差異有統(tǒng)計學意義；頰針組苯丙氨酸和酪氨酸代謝中N-乙酰-L-苯丙氨酸及2-苯基丙酸均顯著下調(diào)，而體針組則顯著上調(diào)。結論 頰針和體針治療類風濕關節(jié)炎的機理有一定相似性，但也存在差異，N-乙酰-L-苯丙氨酸及2-苯基丙酸是其差異的主要潛在生物標志物。

頰針；體針；類風濕關節(jié)炎；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；代謝組學；兔

頰針是通過針刺面頰部的特定穴位達到治療目的的一種方法，其有效性已被大量臨床實踐所證實，尤其對疼痛性疾病的臨床效果尤為明顯，即時止痛有效率達72.5%[1]。研究表明，頰針即時鎮(zhèn)痛效應優(yōu)于體針，其中樞鎮(zhèn)痛作用的機制可能是促使腦脊液中β-內(nèi)啡肽含量升高和8-肽膽囊收縮素含量向正常水平恢復[2]。但目前的研究仍以少數(shù)常規(guī)的神經(jīng)遞質(zhì)含量變化為指標，未能對機體整體代謝進行系統(tǒng)研究。代謝組學是對生物體因病理、生理刺激或基因改變等所致動態(tài)多參數(shù)代謝應答的定性定量研究，其研究對象更接近生物表型，已成為系統(tǒng)生物學的重要支撐學科之一[3]。此外，代謝組學所強調(diào)的“系統(tǒng)觀”“整體觀”與中醫(yī)思維不謀而合，其與UPLC-QTOF/MS、核磁共振[4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[5]等高靈敏度、強分辨率、快速分離分析的現(xiàn)代儀器分析平臺相結合，能夠為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供重要的技術窗口[6]。本研究引入基于UPLC-QTOF/MS的代謝組學方法，觀察頰針和體針對類風濕關節(jié)炎（RA）模型家兔血漿代謝組學的影響，探尋與頰針和體針作用機制有關的代謝物。

1 材料與方法

1.1 試劑

乙腈（色譜純，德國Merck公司），甲酸（色譜純，德國Merck公司），亮氨酸腦啡肽（美國Sigma公司），甲醇（色譜純，山東禹王試劑公司），超純水（自制），卵蛋白干粉（美國Sigma公司，批號A5253），弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，批號F-5881）。

1.2 儀器

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Xevo G2 QTOF四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司），配有ESI（電噴霧離子源）和Masslynx V 4.2化學工作站；XW-80A旋渦混合器（上海精密儀器有限公司）；微機控制高速冷凍離心機及L-500型低速離心機（湘儀儀器有限公司）；超純水制水機（0.22 μm過濾器，美國 Millipore公司）。

1.3 動物及分組

健康日本大耳白兔16只，雌雄各半，6～8月齡，體質(zhì)量（2.0±0.25）kg，蘭州陸軍總院實驗動物中心。飼養(yǎng)于蘭州陸軍總醫(yī)院實驗動物中心，實驗室溫度25℃、濕度50%～55%。將16只家兔隨機分為正常組（ZC）、模型組（MX）、體針組（TZ）和頰針組（JZ），每組4只，分別編號為ZC1～ZC4、MX1～MX4、TZ1～TZ4及JZ1～JZ4。

1.4 造模

[7]方法，將卵蛋白干粉按4 mg/mL與等量弗氏完全佐劑混勻，充分震蕩15 min，待兩者成乳白色膠狀液體即成乳化劑，然后用寵物電推剪去兔背部和雙膝關節(jié)的毛，在模型組、頰針組、體針組家兔肩背部選6個位點，每點皮下注射該溶液0.2 mL，2周后以相同劑量重復皮內(nèi)注射1次。第2次免疫后6 d，在兔雙膝關節(jié)內(nèi)分別注入卵蛋白生理鹽水溶液0.4 mL，濃度為20 mg/mL。1周后觀察到兔進食量減少、活動減少，雙側膝關節(jié)腫脹，測定痛閾明顯降低，表明造模成功。正常組不造模，但在相應部位、時間注射等量生理鹽水。

1.5 針刺方法

1.5.1 穴位選擇 頰針組取頰針“膝”穴[8]。參照人頰針“膝”穴定位標準并以比較解剖學為依據(jù)定位，髖（頰車）與承漿連線的中點處。體針組選取膝眼、足三里，家兔穴位定位參照《實驗針灸學》[9]類比取穴?！跋パ邸保好劰莾?nèi)外側1 cm?！白闳铩保盒⊥缺惩鈧壬?/5折點處，約當腓骨小頭下1.2 cm、脛骨后1 cm處。

1.5.2 處理方法 正常組：于實驗第27日開始，每日用與其他組相同方法固定30 min；模型組同正常組；體針組：于實驗第27日開始，選雙側后肢“膝眼”和“足三里”，用華佗牌13 mm×0.32 mm毫針，直刺2～3 mm，每隔5 min行針1次，采用捻轉(zhuǎn)針法，100次/min，行針15 s，每日1次，連續(xù)針刺5 d；頰針組：于實驗第27日開始，選頰針“膝”穴治療，用13 mm×0.32 mm毫針直刺0.2～0.5 mm，捻轉(zhuǎn)為主，穴位刺激15 s，每日1次，連續(xù)針刺5 d。

1.6 血漿樣本收集及保存

連續(xù)針刺5 d，抽取靜脈血1 mL，EDTA抗凝，3000 r/min離心15 min，-20℃冷凍保存。

1.7 待測樣品儲備液方法

將保存的血漿自然解凍，以90%乙腈進行沉淀，3000 r/min離心10 min，取上清液，重復3次?；旌仙锨逡海谝后w快速混合器中混勻30 s，12 000 r/min離心3 min，取上清液，以甲醇定容于25 mL容量瓶中，即得。

1.8 檢測條件

1.8.1 色譜條件 Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序見表1；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃[10]。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）

1.8.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI+；錐孔電壓：45 V；毛細管電壓：3.5 kV；離子源溫度：110℃；脫溶劑氣溫度：330℃；錐孔氣流量：50 L/h；脫溶劑氣流量：600 L/h；萃取錐孔：4.0 V；每0.2 s采集1次；掃描范圍：100～1000 m/z；以亮氨酸-腦啡肽溶液[M+H]+＝556.277 1 Da作為鎖定質(zhì)量。

1.9 數(shù)據(jù)處理與模型建立方法

采用MasslynxV4.2軟件進行峰識別、峰對齊和基線矯正等前處理，三維總離子流（TIC）色譜疊加圖繪制及相似度計算均采用Matlab6.5軟件，系統(tǒng)聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判別分析（OPLA-DA）等模型采用SIMCA-P12.0軟件建立。

2 結果

2.1 血漿樣品UPLC-QTOF/MS分析

本研究以指認出的峰個數(shù)及總信號強度為指標，通過對色譜、質(zhì)譜檢測條優(yōu)化，以選定方法對16份血漿樣品進行分離分析。為方便比較，將16份血漿樣品的TIC色譜圖繪制在同一個三維坐標中，見圖1?？芍?，UPLC-QTOF/MS在一個分析流程內(nèi)可同時檢測到家兔體內(nèi)多種不同的內(nèi)源性代謝物。直觀分析可知，不同組家兔血漿樣品的TIC色譜圖在保留時間、峰高低及峰個數(shù)均具有一定差異。但直觀分析難以對不同組樣品TIC色譜圖的差異進行量化的精確表達，故本研究對16份血漿樣品TIC色譜圖進行相似度分析[11]。

圖1 各組家兔血漿TIC色譜圖

2.2 血漿樣品色譜圖相似度分析

本研究分別以16份血漿樣品TIC色譜圖的均譜（即TIC色譜圖共有模式）、正常組4份血漿樣品TIC色譜圖的均譜及模型組4份血漿樣品TIC色譜圖的均譜作為對照圖譜，采用“CORREL函數(shù)”計算16份血漿樣品TIC色譜圖與3種對照圖譜的相似度，3種相似度分別以S1、S2及S3表示，見表2?？梢钥闯?，除JZ1相似度S1、S2和JZ3相似度S2、S3接近0.9外，其余相似度均＞0.9，說明不同處理組家兔血漿樣品TIC色譜圖非常相近，即不同處理組家兔血漿內(nèi)源性代謝物種類及含量較為相近。

但是，不同處理組的家兔血漿樣品TIC色譜圖3種相似度也表現(xiàn)出明顯的特點。首先，正常組4份家兔血漿樣品均與正常組樣品TIC色譜圖的均譜相似度（S2）最大，而模型組4份家兔血漿樣品均與模型組樣品TIC色譜圖的均譜相似度（S3）最大，這說明未給予針刺家兔血漿中內(nèi)源性代謝物變化不顯著。其次，體針組與頰針組血漿樣品均較正常組與模型組血漿樣品的3種相似度小，這說明RA模型家兔給予針刺后，其血漿中內(nèi)源性代謝物發(fā)生了變化。

2.3 血漿樣品色譜圖系統(tǒng)聚類分析

為了對血漿樣品TIC色譜圖相似度分析的結果進行驗證，本研究以TIC色譜的峰強度為變量，對16份血漿樣品TIC色譜數(shù)據(jù)進行HCA。聚類采用歐氏距離（Euclidean distance）系數(shù)，以類間平均鏈鎖（Within-groups linkage）法進行聚類[12]，見圖2?？芍?，在歐氏距離為20以內(nèi)，16份血漿樣品可聚為4類，第Ⅰ、Ⅱ類分別為模型組與正常組血漿樣品，2組樣品可根據(jù)TIC色譜圖被聚為完全不同的2類；第Ⅲ類為體針組血漿樣品，但頰針組樣品JZ4也被聚在了第Ⅲ類，但在歐氏距離為20以內(nèi)，頰針組樣品JZ4未與第Ⅲ類聚在一起；第Ⅳ類為頰針組血漿樣品。上述分析表明，模型組、正常組、體針組及頰針組血漿樣品TIC色譜圖存在顯著差異。

表 2 各組家兔血漿樣品TIC色譜圖的相似度分析

圖2 各組家兔血漿樣品TIC色譜圖聚類分析樹狀圖

2.4 血漿樣品代謝物主成分分析

為了考察模型組、正常組、體針組及頰針組家兔血漿樣品代謝物的變化規(guī)律，本研究采用PCA對4組家兔血漿TIC代謝譜數(shù)據(jù)進行模式識別[13]。PCA共提取出特征根＞1的2個主成分，包含了TIC代謝譜數(shù)據(jù)84.27%的信息量，PCA二維模式投影圖見圖3。可知，在較大的二維空間內(nèi)4組家兔血漿樣品代謝物無明顯區(qū)別，但在較小的二維空間內(nèi)基本可區(qū)分。這說明PCA難以精準地對不同組別家兔血漿中內(nèi)源性代謝物的變化差異進行放大與區(qū)別，因此不能分析4組家兔不同處理后代謝物變化的生物標志物。

圖3 PCA二維模式投影圖

2.5 血漿樣品代謝物正交偏最小二乘判別分析

OPLS-DA能夠先對UPLC-QTOF/MS信號進正交信號校正，對影響偏最小二乘分析的“臟數(shù)據(jù)”信號進行剔除，便于找出4組不同處理家兔血漿樣品的代謝物的區(qū)別及其生物標志物[14]。以參數(shù)R2Y（表示模型的擬合程度）及Q2（表示模型的可預測程度）考察模型的有效性，本研究所建模型的R2Y和Q2分別為0.943 4和0.843 5，表明該模型較為可靠。OPLS-DA的三維模式投影圖及載荷圖分別見圖4、圖5。由圖4可知，基于OPLS-DA模型，4組不同處理家兔血漿樣品代謝物在三維象限中完全分開，且模型組、正常組、體針組及頰針組各自4份樣品都聚集在一起，說明4組間血漿樣品代謝物差異有統(tǒng)計學意義，造成這種差異的代謝物即為潛在的生物標志物。

潛在生物標志物的選擇可通過OPLS-DA模型的載荷圖進行鑒定與分析。OPLS-DA載荷圖表明了變量（波數(shù)）對樣本分類貢獻的大小，距離原點越遠對分離貢獻越大。潛在生物標志物的鑒定方法：首先確定潛在標志物的準分子離子峰，再根據(jù)準確的分子質(zhì)量結合分子式預測工具來預測化合物的元素組成，然后利用文獻及MassBank、ChemSpider及MetFrag數(shù)據(jù)庫進行檢索，初步確認候選代謝物[15]。本研究代謝產(chǎn)物路徑分析采用metPA網(wǎng)絡軟件執(zhí)行。

圖4 OPLS-DA三維模式投影圖

圖5 OPLS-DA二維載荷圖

采用上述鑒定方法對家兔血漿中重要的代謝物進行推斷，共鑒定出19種代謝物，對其2種針刺法處理前后2組家兔間及2種針刺法間差異進行t檢驗[16]，結果見表3。其中，甲基組氨酸、尿苷、肌酸酐、瓜氨酸、偏苯三酚、黃嘌呤、羥苯基甘氨酸、喹哪啶酸、4-羥基醌、哌啶及喹啉在頰針和體針處理后均顯著上調(diào)，泛酸、苯甲酰氨基酯酸、生物素酰胺、壬二酸、吲哚-3-羧酸及4-吡哆酸在頰針和體針處理后均顯著下調(diào)，N-乙酰-L-苯丙氨酸和2-苯基丙酸均為頰針處理后顯著下調(diào)而體針處理后顯著上調(diào)。這些發(fā)生變化的代謝物預示著RA模型家兔在針刺后體內(nèi)多個代謝通路發(fā)生變化，包括嘧啶代謝、嘌呤代謝、脂肪酸代謝、維生素B6代謝、泛酸和輔酶A生物合成及多種氨基酸代謝。除甲基組氨酸、泛酸、壬二酸、吲哚-3-羧酸外，其余代謝物頰針組和體針組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

表 3 鑒定出的重要代謝差異物及代謝通路

3 討論

為獲取更為全面和穩(wěn)定的代謝物檢測譜圖，本研究以檢測峰數(shù)和總信號強度作為評價指標，對血漿樣品的前處理方法、質(zhì)譜條件及流動相均進行了優(yōu)化，并進行了方法學驗證。實驗比較了甲醇、乙腈2種常用的有機溶劑處理血漿樣品的方法，結果表明，當乙腈達到90%（V/V）時，不但沉淀蛋白的效果充分、均勻，同時又保證了檢測的信息量。因為血漿樣品成分復雜，m/z較小的碎片信號強度較大，容易對有用信息造成干擾，故采用m/z范圍在100～1000的正離子全掃描模式，以提高有用信號的信噪比。血漿樣本的代謝組學通常使用乙腈-水體系進行分析，但弱酸性條件有利于ESI+模式下樣品的離子化，故本實驗流動相采用0.1%甲酸水溶液作為A相，并優(yōu)選了不同洗脫梯度。方法學考察顯示，本實驗儀器精密度、血漿樣品穩(wěn)定性及實驗重復性等均符合要求。

PCA是一種非監(jiān)督性學習方法，多用于初步分析不同組樣本間總體分布狀況、自然聚集狀態(tài)的差異以及判斷有無奇異樣本等，其對不同組樣品的鑒別、分組能力不如有監(jiān)督的多維模式識別方法，如PLS-DA及OPLS-DA[17]。OPLS-DA是PLS-DA經(jīng)過正交矯正后的衍生算法。與PCA及PLS-DA相比，OPLS-DA能最大化地凸顯模型內(nèi)部不同組間的差異，達到最好區(qū)分不同處理組樣品的效果[18]。本研究結果表明，基于OPLS-DA模型，4組不同處理家兔血漿樣品代謝物在三維象限中完全分開，分類效果明顯優(yōu)于PCA模型，使分析4組家兔不同處理后代謝物變化的生物標志物及相關代謝通路更加可行和科學。

頰針基于現(xiàn)代生物全息論，是針灸學中微針診療系統(tǒng)的一個新分支。經(jīng)臨床驗證，頰針療效穩(wěn)定、可靠，對疼痛性病癥效果尤為明顯，且對黃種人、黑種人及白種人均有效，具有取穴方便、操作簡單、止疼效果迅速、適應癥及適應人群廣泛等優(yōu)點，便于學習掌握、推廣應用。本研究初步揭示了頰針和體針對RA模型家兔血漿代謝組學影響的共同點及不同點，發(fā)現(xiàn)2種針刺方法對RA模型家兔血漿代謝物影響的變化趨勢基本一致，但2種不同針刺處理組模型家兔之間血漿代謝物的變化具有顯著差異。兩者最顯著的差異表現(xiàn)為苯丙氨酸和酪氨酸代謝中N-乙酰-L-苯丙氨酸及2-苯基丙酸的變化趨勢完全相反，頰針組2種代謝物均顯著下調(diào)，而體針組則顯著上調(diào)，說明頰針和體針對RA的治療機理可能不同。

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Effects of Buccal Acupuncture on Expression of Plasma Metabolites Spectrum of Rabbits with Rheumatoid Arthritis

JIE Wang-jun,PU Rui-sheng,FANG Xiao-li,LIU Ding-long,QUAN Ke, QIN Xiao-guang,SU Cheng-hong
(Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China)

Objective To observe the effects of buccal acupuncture therapy and body acupuncture therapy on plasma metabolomites of rheumatoid arthritis rabbits model;To search for the metabolites related to the mechanism of buccal acupuncture and body acupuncture.Methods Sixteen rabbits were made into rheumatoid arthritis models by complete freund’s adjuvant before the treatment.The buccal acupuncture group was treated by buccal acupuncture on the“knee”acupoint;13 mm×0.32 mm needle straight 0.2–0.5 mm,twist the main points of stimulation 15 s,once a day.The body acupuncture group was treated by body acupuncture on the“Xiyan”and“Zusanli”acupoints;with 13 mm×0.32 mm needle straight 2–3 mm,every 5 min each time,twisting needle method,100 times/min for 15 s, once a day.After the continuous treatment for 5 days,UPLC-QTOF/MS was applied to test metabolite from the plasma sample of all groups.Similarity analysis,hierarchical cluster analysis(HCA),principal component analysis (PCA),orthogonal partial least squares-discriminant analysis(OPLS-DA)were applied in this research;meanwhile load analysis method was used to identify the meaningful metabolites.Results The similarity analysis,HCA and PCA all showed the significant difference of endogenous metabolites in plasma samples among the buccal acupuncture group,the body acupuncture,the model group and the blank group.The 4 groups of different plasma sample metabolite were completely separated in three dimensions by OPLS-DA and all the samples were gathered respectively.The load analysis indicated that there were 19 kinds of endogenous metabolites which showed the significant differences between buccal acupuncture group and model group,and also happened between the body acupuncture group and the model group;N-cetyl-L-phenylalanine and 2-phenyl propionate in metabolism ofphenylalanine and tyrosine decreased significantly in the buccal acupuncture group while significantly increased in the body acupuncture group.Conclusion There are relative similarity on the mechanism of treating rheumatoid arthritis between buccal acupuncture and body acupuncture.However,N-acetyl-L-phenylalanine and 2-phenyl propionate,as the main potential biomarkers of the difference,indicate that the dissimilarity can be significant.

buccal acupuncture;body acupuncture;rheumatoid arthritis;LC-MS;metabolomics;rabbits

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.014

R245

：A

：1005-5304(2017)05-0057-06

2016-06-21）

（

2016-08-25；編輯：華強）

國家自然科學基金（81260559）

方曉麗，E-mail：xwjhgm@163.com