歐惠算，鄧旭銘，張靈枝，張均偉，馬士成，邱瑞瑾

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.梧州中茶茶業(yè)有限公司，廣西 梧州 543001；3.梧州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 梧州 543000；4.梧州市六堡茶研究院，廣西 梧州 543000）

汽蒸前后六堡茶中優(yōu)勢(shì)微生物的分離鑒定

歐惠算1，鄧旭銘1，張靈枝1，張均偉2，馬士成3，4，邱瑞瑾3，4

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.梧州中茶茶業(yè)有限公司，廣西 梧州 543001；3.梧州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 梧州 543000；4.梧州市六堡茶研究院，廣西 梧州 543000）

選取汽蒸前、后六堡茶茶樣，分離純化得到7株優(yōu)勢(shì)菌，采用傳統(tǒng)方法觀察菌落特征、利用光學(xué)顯微鏡觀察菌株的形態(tài)，結(jié)合分子生物學(xué)水平對(duì)菌株進(jìn)行DNA序列分析，通過(guò)ITS序列進(jìn)行同源性搜索比對(duì)、對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。結(jié)果共鑒定出六堡茶汽蒸前的優(yōu)勢(shì)菌為塔賓曲霉、黑曲霉、膠紅酵母、LB3青霉、灰黃青霉、鞘氨醇單胞菌以及阿姆斯特丹散囊菌。而在汽蒸后的六堡茶里沒(méi)有塔賓曲霉以及黑曲霉，說(shuō)明其在高溫汽蒸時(shí)已被殺死，而其余5種微生物因耐高溫而保留下，對(duì)六堡茶的陳化起到重要作用。

六堡茶；優(yōu)勢(shì)微生物；分離；鑒定

六堡茶，因原產(chǎn)于廣西省梧州市蒼梧縣六堡鄉(xiāng)而得名，屬于黑茶類(lèi)。我國(guó)著名的茶學(xué)教授莊晚芳先生根據(jù)南北朝時(shí)期的《桐君錄》考證：六堡茶的歷史可以追溯到1 500多年前。《蒼梧縣志》記載：“茶產(chǎn)多賢鄉(xiāng)六堡，味醇隔宿而不變，茶色香味俱佳”［1］。六堡茶與其他黑茶相比，其加工過(guò)程中的特殊之處為兩次“渥堆”和兩次高溫汽蒸，其傳統(tǒng)加工工藝分為兩步：六堡初制加工與六堡茶精制加工，即毛茶和成品茶加工，精制加工流程為：六堡毛茶—加水—翻拌—高溫汽蒸—渥堆—高溫汽蒸—裝簍—陳化—六堡茶［2］。該獨(dú)特的工藝使得六堡茶具有獨(dú)特的檳榔香味和“紅、濃、陳、醇”的品質(zhì)特征。在渥堆過(guò)程中，有大量微生物生成，溫志杰等［3］分析了六堡茶渥堆發(fā)酵中微生物的變化，檢測(cè)到其中存在數(shù)量巨大的細(xì)菌、酵母、霉菌。廖慶梅［4］發(fā)現(xiàn)六堡茶后期陳化的六堡茶有許多金黃色的“金花”，是有益品質(zhì)的黃霉菌，它能分泌淀粉酶和氧化酶，可催化茶葉中的淀粉轉(zhuǎn)化為單糖。徐書(shū)澤［5］通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合真菌分子鑒定技術(shù)從中分離鑒定得到黑曲霉、煙曲霉、桔青霉、西弗射盾子囊霉等5屬18種的微生物。汽蒸，是六堡茶加工的關(guān)鍵工藝，汽蒸前后的微生物類(lèi)群，決定了六堡茶后期陳化的品質(zhì)，渥堆后的六堡茶，通過(guò)高溫汽蒸，將不耐高溫的微生物殺死，提高茶葉的安全性。本試驗(yàn)以第2次汽蒸前后的六堡茶為樣品，分離純化其中的優(yōu)勢(shì)菌，用光學(xué)顯微鏡觀察菌落形態(tài)，再結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)進(jìn)行DNA測(cè)序，在分子水平上對(duì)六堡茶汽蒸前后的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行鑒定，為提高六堡茶的渥堆技術(shù)及安全性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

六堡茶茶樣取自廣西梧州中茶茶廠，2015 年11月產(chǎn)，蒸前樣為剛渥堆好的發(fā)酵樣；蒸后樣為渥堆好汽蒸后的蒸壓樣，于陰涼避光處保存。

分離培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基；純化鑒定培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)基、20%蔗糖查氏培養(yǎng)基（CZA20S）、改良的20%蔗糖查氏培養(yǎng)基（加2%的六堡毛茶茶湯）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 汽蒸前后六堡茶微生物的分離純化 分離：分別稱(chēng)量10 g蒸前樣、蒸后樣六堡茶于250 mL三角瓶中（含玻璃珠），加入90 mL無(wú)菌水，于振蕩器中振蕩15 min，即制成10-1倍菌懸液，在超凈工作臺(tái)上吸取1 mL10-1倍菌懸液加入到裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，得10-2倍稀釋菌懸液，以此類(lèi)推，依次稀釋至10-7倍菌懸液。分別取1 mL各稀釋濃度的菌懸液置于PDA平板上，用無(wú)菌三角玻璃板均勻涂布，每個(gè)濃度3次重復(fù)，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28℃培養(yǎng)7 d。

純化：選擇生長(zhǎng)適宜的平板用接種針挑取少許菌絲，用劃線(xiàn)分離法在查氏、20%蔗糖查氏、改良蔗糖查氏培養(yǎng)基上進(jìn)行多次分離培養(yǎng)得到純種菌株、編號(hào)，用試管斜面培養(yǎng)，4℃保存。

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察 將保存的菌種取出，于28℃活化培養(yǎng)24 h，用三點(diǎn)接種法將菌株接于PDA培養(yǎng)基、20%蔗糖查氏培養(yǎng)基、改良的20%蔗糖查氏培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，每天觀察菌落的生長(zhǎng)情況并做好記錄。根據(jù)菌株的形態(tài)，初步判定菌株的類(lèi)別，根據(jù)類(lèi)別選擇不同的方法進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。

（1）真菌用插片法觀察：將滅菌的蓋玻片呈45～50°插入查氏和20%蔗糖察氏培養(yǎng)基，待菌絲擴(kuò)展至蓋玻片，取出將其放在載玻片上（粘有菌絲的一面朝上），在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。（2）細(xì)菌用油鏡觀察法：革蘭氏染色后，用油鏡進(jìn)行顯微觀察，拍照記錄。（3）酵母菌用直接觀察法：酵母為單個(gè)細(xì)胞，呂氏美藍(lán)染液染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.3 菌株的DNA序列分析 用劃線(xiàn)法培養(yǎng)菌株5 d后，按照生工真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行菌株DNA的提取，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的DNA基因組，對(duì)成像單一且較亮的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

（1）真菌PCR擴(kuò)增。引物：ITS1F（5′-CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）；ITS4（5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′）。

反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板1.5 μL；ExTaq酶（TaKaRa）12.5 μL；IFS1F引物（10 μmol/L）各0.5 μL；ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

（2）細(xì)菌PCR擴(kuò)增。引物：27F（5′-AG AGTTT-GATCCTGGCTCAG-3′）；1492R （5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′）。

反應(yīng)體系（50 μL）：2×Premix Taq （TaKaRa） 25 μL，引物（10 μmol/L） 各2 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸3 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10 min，

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，成像系統(tǒng)拍照。將PCR純化產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中使用Blastn 軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，通過(guò)MEGA6 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。選用鄰位相連法（Neighbor-joining）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，用自展檢驗(yàn)（Bootstrap ）做驗(yàn)證的進(jìn)化樹(shù)分析，隨機(jī)搜索設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

通過(guò)對(duì)汽蒸前后兩個(gè)六堡茶茶樣微生物的分離培養(yǎng)（圖1，封三），得到的菌株根據(jù)其形態(tài)特征初步歸類(lèi)劃分，依次編號(hào)為L(zhǎng)B1～LB7，六堡茶汽蒸前的優(yōu)勢(shì)菌為7株，汽蒸后的樣品中沒(méi)有檢測(cè)到LB5菌株和LB7菌株，說(shuō)明高溫汽蒸使這兩株菌致死，而剩余的5株菌，由于耐高溫而存活下來(lái)。將LB1、LB2、LB5、LB6、LB7分別接種于PDA與查氏培養(yǎng)基上，LB3接種于查氏與改良的20%蔗糖查氏培養(yǎng)基上，LB4接種于查氏與20%的蔗糖查氏培養(yǎng)基上，進(jìn)行菌落形態(tài)，以及光學(xué)顯微鏡觀察，結(jié)合真菌鑒定手冊(cè)對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。

2.1.1 LB1菌株形態(tài) 菌落在PDA上易生長(zhǎng)，菌落小，直徑約1.2 cm，圓形或者橢圓形，表面濕潤(rùn)光滑，呈黃色，中凸，粘稠，不透明，后期濕潤(rùn)菌落易散開(kāi)。根據(jù)上述對(duì)該菌菌落及顯微鏡觀察結(jié)果，初步鑒定該菌株為細(xì)菌（圖2，封三）。

2.1.2 LB2菌株形態(tài) 菌落呈圓球，中央隆起，邊緣整齊，濕潤(rùn)不透明，膠狀，表面具有光澤，直徑約1.2 cm。正面呈深紅色，背面呈粉紅色。光學(xué)顯微鏡下，用呂氏美藍(lán)染液染色觀察，細(xì)胞呈球形或卵圓形，直徑約4 μm，單個(gè)、成對(duì)或成鏈。根據(jù)上述對(duì)該菌菌落及顯微鏡觀察結(jié)果，結(jié)合《中國(guó)真菌志》及《真菌鑒定手冊(cè)》該菌株初步鑒定為酵母屬（圖3，封三）。

2.1.3 LB3菌株形態(tài) LB3菌株在PDA上長(zhǎng)得很慢，在20%蔗糖查氏上長(zhǎng)得較快，在加了2%六堡毛茶茶湯的20%蔗糖查氏培養(yǎng)基上長(zhǎng)得最快，最茂盛，菌落呈蘑菇狀，菌絲為白色，絨絲狀，菌落底部有較硬的褐色梗，菌落背面有裂紋，成熟后為深褐色，菌絲分布較雜亂，菌絲交叉處有紅褐色近球形或橢圓形子囊，無(wú)孢子。根據(jù)上述對(duì)該菌菌落及顯微鏡觀察結(jié)果，結(jié)合《中國(guó)真菌志》及《真菌鑒定手冊(cè)》該菌株初步鑒定為：青霉屬（圖4，封三）。

2.1.4 LB4菌株形態(tài) 菌落在察氏瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，在20%蔗糖察氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)較快，其生長(zhǎng)速度為75 mm/14d，菌落為絨狀，中間微隆起，整體呈金黃色，有同心環(huán)紋路，中間部位較邊沿更黃，黃色閉囊殼豐富，成熟后為黃褐色，菌落中心部位有長(zhǎng)放射性脊，菌絲有隔，呈不對(duì)稱(chēng)分枝，培養(yǎng)5 d左右其上分布暗灰綠色的分生孢子頭，分生孢子梗莖較長(zhǎng)，分生孢子串生，為球形或者近球形，尺寸為4.5～4.9 μm，表面粗糙，培養(yǎng)7 d，有大量成熟的分生孢子脫落在菌絲周?chē)?。菌落背面呈棕褐色，衰老后顏色變深，無(wú)脊光滑。結(jié)合《中國(guó)真菌志》及《真菌鑒定手冊(cè)》該菌株初步鑒定為散囊菌屬（圖5，封三）。

2.1.5 LB5菌株形態(tài) LB5菌落在查氏瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃條件下培養(yǎng)7 d，直徑達(dá)4.8 cm，菌絲體白色，質(zhì)地絲絨狀，菌落灰褐色；有同心圓，無(wú)滲出液；菌落反面為淡灰黃色。分生孢子近球形，結(jié)構(gòu)較密，易產(chǎn)分生孢子，分生孢子近球形，直徑3 μm，壁近光滑。菌落在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌絲茂盛，灰黑色，菌落有同心圓，背面為灰色，培養(yǎng)5天即可產(chǎn)生大量孢子，孢子成近球形。根據(jù)上述對(duì)該菌菌落及顯微鏡觀察結(jié)果，結(jié)合《中國(guó)真菌志》及《真菌鑒定手冊(cè)》該菌株初步鑒定為曲霉屬，塔賓曲霉（圖6，封三）。

2.1.6 LB6菌株形態(tài) LB6菌落在查氏培養(yǎng)基上于28℃條件下培養(yǎng)7 d直徑1.2 cm，生長(zhǎng)快，菌落近圓形，正面為深綠色，邊緣白色，質(zhì)地平坦，背面呈黃綠色，每枝的末端細(xì)胞分裂成串的分生孢子，形成掃帚狀，分生孢子梗壁近光滑。分生孢子一般呈藍(lán)綠色，孢子較多，易脫落，成熟后隨風(fēng)飛散，遇適宜環(huán)境，萌發(fā)成菌絲。根據(jù)上述對(duì)該菌菌落及顯微鏡觀察結(jié)果，結(jié)合《中國(guó)真菌志》及《真菌鑒定手冊(cè)》該菌株初步鑒定為：青霉屬，灰黃青霉（圖7，封三）。

2.1.7 LB7菌株形態(tài) LB7菌落在查氏瓊脂培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)迅速，于28℃條件下培養(yǎng)7 d，直徑達(dá)4.8 cm，菌絲質(zhì)地絲絨狀，長(zhǎng)滿(mǎn)黑色分生孢子，表面呈暗褐色或炭黑色，正面有同心圓，菌落反面呈灰褐色。分生孢

了頭為球形，直徑約50 μm，分生孢子梗壁光滑，分生孢子近球形，直徑約3 μm。分生孢子成熟后易脫落。根據(jù)上述對(duì)該菌菌落及顯微鏡觀察結(jié)果，結(jié)合《中國(guó)真菌志》及《真菌鑒定手冊(cè)》該菌株初步鑒定為：曲霉屬，黑曲霉（圖8，封三）。

2.2 分子鑒定結(jié)果

將以ITS1F與ITS4為引物擴(kuò)增得到的序列片段在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST工具中進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用MEGA6軟件構(gòu)建發(fā)育樹(shù)，確定菌株的歸屬，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 六堡茶分離菌株的基因組DNA純度檢測(cè)以及ITS-PCR產(chǎn)物電泳圖

基于序列相似性達(dá)到97%以上的基因克隆子才能定義為同一種物質(zhì)，而分離出的LB3菌株的相似性只有88%，所以只能確定該菌株為青霉屬。經(jīng)過(guò)大量的文獻(xiàn)查閱以及反復(fù)驗(yàn)證得出：該菌株可能是茶葉中特有的菌種，目前尚未有相關(guān)的分子鑒定報(bào)道，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有相應(yīng)的序列記錄，所以比對(duì)的相似性比較小。由于LB1分子序列在Blast上的比對(duì)結(jié)果中，前十幾種都為鞘氨醇單孢菌，且相似性均在99%以上，所以沒(méi)有進(jìn)行發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，確定LB1為鞘氨醇單孢菌（Sphingomonas sp.，表1）。

根據(jù)以上分子序列比對(duì)結(jié)果以及所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)系統(tǒng)（圖10、圖11），鑒定得出5個(gè)屬7種微生物，包括細(xì)菌1種：鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）；酵母屬1種：膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）；散囊菌屬1種：阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）；青霉屬2種：灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）、Capsulatum 青霉；曲霉屬2種：黑曲霉（Aspergillus niger）、塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）。

2.3 菌株最終鑒定結(jié)果分析

菌株的ITS分子鑒定結(jié)果結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，最終得到5個(gè)屬7個(gè)種微生物，其中形態(tài)學(xué)無(wú)法鑒定的LB1、LB2、LB4菌株通過(guò)分子學(xué)方法分別鑒定為鞘氨醇單胞菌、膠紅酵母、阿姆斯特丹散囊菌。而LB3在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果相似性小于97%，只能確定其為青霉屬。本試驗(yàn)用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察法結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)鑒定菌株，使結(jié)果更加科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。試驗(yàn)得出：六堡茶汽蒸前的優(yōu)勢(shì)菌為塔賓曲霉、黑曲霉、膠紅酵母、LB3青霉、灰黃青霉、鞘氨醇單胞菌以及阿姆斯特丹散囊菌；而在汽蒸后沒(méi)有塔賓曲霉以及黑曲霉，說(shuō)明其在高溫汽蒸時(shí)已被殺死，而其余的5種微生物因?yàn)?/p>

耐高溫而保留下來(lái)。所以汽蒸后的優(yōu)勢(shì)菌為膠紅酵母、LB3青霉、灰黃青霉、鞘氨醇單胞菌以及阿姆斯特丹散囊菌。

表1 六堡茶分離菌株的Blastnd的比對(duì)結(jié)果

圖10 菌株LB2、LB3、LB4、LB5、LB6系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖11 菌株LB7系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論與討論

LB3菌株雖然還不能確定到種，但本試驗(yàn)可以肯定其屬于六堡茶中的真菌，因?yàn)樵诜蛛x汽蒸前后的六堡茶優(yōu)勢(shì)菌時(shí)都得到該菌，且在分離過(guò)程中，用玻璃棒涂布平板時(shí)，該菌在PDA中易生長(zhǎng)，菌落較茂密，而純化時(shí)在PDA中卻很難生長(zhǎng)，原因是在涂布時(shí)培養(yǎng)皿上有1 mL茶湯為其提供必需營(yíng)養(yǎng)，鑒于這一現(xiàn)象，本試驗(yàn)改良了20%的蔗糖查氏培養(yǎng)基，加入2%六堡毛茶茶湯，對(duì)LB3菌株進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其在有茶湯的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，白色絨狀菌絲茂盛，可以確定該菌株為六堡茶中的真菌。至于其序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)值較低，原因可能是目前還沒(méi)有該菌的相關(guān)報(bào)道，在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有相應(yīng)的序列記錄，所以目前只能確定LB3菌株為青霉屬。

散囊菌屬真菌是存在于黑茶中的優(yōu)勢(shì)菌種，不同品種茯磚茶有冠突散囊菌、謝瓦散囊菌、肋狀散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌等優(yōu)勢(shì)菌［6］；六堡茶的優(yōu)勢(shì)菌種也包括散囊菌屬。陳慶金等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在六堡茶陳化初期不同階段真菌群落曲霉屬和散囊菌屬為主。本試驗(yàn)從六堡茶中分離純化得到的金花菌株，具有耐高溫性，經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分析結(jié)合ITS 序列同源性搜索比對(duì)確定為阿姆斯特丹散囊菌，這與毛彥等［8］的試驗(yàn)結(jié)果不同，其鑒定六堡茶的金花菌為雪黃散囊菌，與陳然等［9］試驗(yàn)結(jié)果也不同，其選取多家梧州六堡茶龍頭企業(yè)生產(chǎn)的六堡茶產(chǎn)品進(jìn)行真菌分析，結(jié)果得出不同廠家六堡茶產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)菌種包括冠突散囊菌、謝瓦氏散囊菌等散囊菌屬真菌。以上差異可能是由于實(shí)驗(yàn)茶樣來(lái)自不同的茶廠，堆的時(shí)間和溫度不同，導(dǎo)致成品茶中的“金花”菌種不同。由此可見(jiàn)，六堡茶中的“金花”菌也具有多樣性。

存在于黑茶中的優(yōu)勢(shì)菌黑曲霉能產(chǎn)生酸性蛋白酶、糖苷酶、葡萄糖淀粉酶和乳酸酶等多種酶?？梢詫⒚柚械亩嗵?、脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素等大分子化合物分解為單糖、可溶性碳水化合物、多肽及各種氨基酸等小分子物質(zhì)，可以增強(qiáng)茶湯的滋味及甘滑、醇厚的品質(zhì)特點(diǎn)［5］。酵母菌含有極豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、脂肪、粗纖維素、碳水化合物、礦物質(zhì)及微量元素等，有利于普洱茶形成甜醇、爽滑的品質(zhì)風(fēng)格［10］。散囊菌屬真菌可以產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和果膠酶等多種酶系，能將茶葉中的大分子物質(zhì)分解，使茶葉風(fēng)味提高［10］，其還具有降脂、減肥、促進(jìn)消化、改善人體腸道的功效，其發(fā)酵產(chǎn)物胞外多糖還具有抑制腫瘤的功效［11］，彭曉赟等［12］研究發(fā)現(xiàn)，從冠突散囊菌中提取的化合物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌具有顯著的抑制作用。 Yoshiaki等［13-14］研究發(fā)現(xiàn)，從蠟葉散囊菌NE-1和NE-4兩個(gè)菌株發(fā)酵液中，鑒定出具有較高的抗氧化能力，對(duì)清除DPPH自由基和過(guò)氧化物具有顯著效果的5種化合物。本試驗(yàn)將用單株菌種發(fā)酵六堡毛茶，進(jìn)一步探索這7種優(yōu)勢(shì)菌對(duì)六堡茶品質(zhì)以及功能的影響，以期為六堡茶的加工、利用和發(fā)展奠定一定的理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 白雪娜）

Isolation and identification of dominant microorganisms of Liupao tea before and after steaming

OU Hui-suan1，DENG Xu-ming1，ZHANG Ling-zhi1，ZHANG Jun-wei2，MA Shi-cheng3，4，QIU Rui-jin3，4
（1.College of Horticuture，South China Agricultutal University，Guangzhou 510642，China；2.China Tea （Wuzhou） Co.，Ltd，Wuzhou 543001，China；3.Agricultural Science Research Institute of Wuzhou，Wuzhou 543000，China；4.Wuzhou Liupao Tea Research Institute，Wuzhou 543000，China）

Steaming is the key technology in the process of Liupao tea. seven dominant microorganism strains were separated from Liupao tea samples before and after steaming technology .With the traditional methods to observe the colony strain morphological characteristics，and the optical microscope observation，combined with the molecular biology level of strain for DNA sequence analysis，and through ITS sequence homology search comparisons and analysis of phylogenetic tree，the seven dominant strains from Liupao tea before steaming were identified as Aspergillus tubingensis，A. niger，Rhodotorula mucilaginosa，Penicillium sp，P. griseofulvum，Sphingomonas sp，Eurotium amstelodami. And from the Liupao tea after steaming，A. tubingensis，A. niger，were not detected，they were killed during high temperature steaming，while the rest five microorganisms had high temperature resistance，were important in the aging of Liupao tea.

Liupao tea；dominant microorganisms；isolation；identification

S571.1

A

1004-874X（2017）02-0129-07

2016-11-30

廣東省自然科學(xué)基金（5300-E12237）；梧州市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201501024）

歐惠算（1991-），女，碩士，E-mail：781088344@qq.com

張靈枝（1972-），女，博士，副教授，E-mail：lingzhi@scau.edu.cn

歐惠算，鄧旭銘，張靈枝，等.汽蒸前后六堡茶中優(yōu)勢(shì)微生物的分離鑒定［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（2）：129-135.