鄧?yán)?，郝學(xué)財(cái)，劉娜

（天津春發(fā)生物科技集團(tuán)有限公司研發(fā)中心天津市風(fēng)味食品配料企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300300）

呈味肽的制備、純化與鑒定

鄧?yán)颍聦W(xué)財(cái)，劉娜

（天津春發(fā)生物科技集團(tuán)有限公司研發(fā)中心天津市風(fēng)味食品配料企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300300）

采用酶解法以雞肉為原料進(jìn)行雞肉蛋白多肽的制備，通過(guò)葡聚糖凝膠柱層析法對(duì)混合多肽進(jìn)行不同分子質(zhì)量片斷的分離，確定最優(yōu)的分離填料為G25、洗脫液為乙醇-水，在此條件下，分子質(zhì)量＜1 000 u的組分通過(guò)分離富集含量可達(dá)100%、分子質(zhì)量＞5 000 u的組分含量達(dá)78%、分子質(zhì)量1 000～5 000 u的組分含量達(dá)70%。通過(guò)感官評(píng)價(jià)、電子舌分析發(fā)現(xiàn)，不同分子質(zhì)量片段多肽提供的風(fēng)味側(cè)重點(diǎn)不同，分子質(zhì)量＜1 000 u的多肽熱反應(yīng)產(chǎn)物在醇厚感、嗜好性方面最優(yōu)。利用高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)該肽段進(jìn)一步純化與鑒定，找到其中5條呈味肽，并采用固相合成法制備，經(jīng)感官評(píng)價(jià)驗(yàn)證其呈味功能，發(fā)現(xiàn)在清水評(píng)價(jià)中，合成的5條多肽呈味效果以酸、甜、鮮味為主；在雞粉溶液加香評(píng)價(jià)中，呈現(xiàn)鮮味最強(qiáng)的多肽為γ-L-Glu-L-Glu和γ-L-Glu-L-Val-Gly；呈現(xiàn)醇厚感最強(qiáng)的多肽為L(zhǎng)-GSH。

呈味肽；酶解；分離；純化；鑒定

呈味肽是指對(duì)食品風(fēng)味具有一定貢獻(xiàn)的寡肽類(lèi)物質(zhì)，通常分子質(zhì)量＜5 000 u。肽由于含有羧基和氨基兩性基團(tuán)而具有緩沖能力，可賦予食品微妙而細(xì)膩的風(fēng)味。肽不僅可以直接呈味，而且可以與其他風(fēng)味物質(zhì)相互協(xié)同，增強(qiáng)或改變?cè)械奈兜溃部梢宰鳛閾]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體參與美拉德反應(yīng)，形成特殊的芳香化合物[1-2]。

研究表明，肽的呈味功能與其含有的氨基酸種類(lèi)及序列相關(guān)，存在于天然食品中的氨基酸大約有20余種，無(wú)論是單一還是混合的氨基酸，都可以清楚地評(píng)估出其對(duì)食品呈味的作用。然而，肽類(lèi)是由氨基酸排列組合構(gòu)成，其數(shù)量十分龐大，利用現(xiàn)有的分離、分析技術(shù)逐一對(duì)其進(jìn)行分離、純化、鑒定、評(píng)估極其困難。目前，呈味肽的研究在國(guó)內(nèi)尚處于起步階段，國(guó)外不同學(xué)者的研究結(jié)論也存在爭(zhēng)議[3-5]。

本實(shí)驗(yàn)采用酶解法以雞肉為原料進(jìn)行雞肉蛋白多肽的制備，經(jīng)柱層析實(shí)現(xiàn)不同分子質(zhì)量多肽的分離，利用感官評(píng)價(jià)、電子舌技術(shù)確定最具呈味功能的多肽片斷，再利用高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用儀純化、鑒定出5條呈味肽，而后，采用固相合成法制備并驗(yàn)證了其呈味功能，以期為新型呈味物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、應(yīng)用以及高品質(zhì)香精、調(diào)味品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉：山東鳳翔集團(tuán)；復(fù)合蛋白酶（FH-G-NA-ⅩⅡ）：天津諾奧科技發(fā)展有限公司；葡聚糖凝膠柱填料（G10、G15、G25）：北京索萊寶科技有限公司；甘氨酸、亮氨酸、半胱氨酸（純度均為99%）：日本味之素公司；乙腈、乙醇（純度均為色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、磷酸二氫鈉、苯酚（純度均為99%）：天津市風(fēng)帆化學(xué)試劑科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞色素C、抑肽酶（6 500 U/g）、桿菌肽、甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸、甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸（純度均為99%以上）：美國(guó)Sigma公司；H-CTC樹(shù)脂：天津南開(kāi)和成公司；N，N'-二異丙基碳二亞胺（N,N-diisopropylcarbodiimide，DIC）、1-羥基苯并三唑（Nhydroxybenzotrizole，HOBt）（純度均為99%）：成都西亞化工股份有限公司；乙二硫醇（1,2-ethanedithio，EDT）、茚三酮、六氫吡啶（piperidine，PIPE）、N,N′-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）（純度均為99%）：百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AC1000全自動(dòng)熱反應(yīng)釜：北京世紀(jì)森朗實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；1200高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）（帶餾分收集器）：美國(guó)安捷倫科技有限公司；3100 Mass液質(zhì)聯(lián)用儀（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）：美國(guó)沃特世科技（上海）有限公司；JMS-50膠體磨：頂天輕工機(jī)械有限公司；SJM-FHM-05陶瓷膜過(guò)濾裝置：世杰膜工程有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；BS-100A自動(dòng)部分收集器：上海青浦滬西儀器廠(chǎng)；Astree電子舌：法國(guó)Alpha MOS公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雞肉多肽的制備

取雞肉，先后利用破碎機(jī)、膠體磨處理成雞肉泥，肉泥與水等質(zhì)量充分混合，加入蛋白酶酶解，加酶量為1 000 U/g蛋白質(zhì)，在自然pH，酶解溫度為65℃條件下酶解0.5 h后，于90℃滅酶15 min，降溫后過(guò)陶瓷膜濾去大分子雜質(zhì)。

1.3.2 多肽的分離

將1.3.1中得到的酶解液采用葡聚糖凝膠過(guò)濾柱法進(jìn)行不同分子量多肽的分離。首先以葡聚糖凝膠G25為填料填裝層析柱，以水、乙醇-水、磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer solution，PBS）、NaCl-PBS四種洗脫液分別洗脫，考察得到最優(yōu)的洗脫液種類(lèi)；再分別以G25、G15、G10為填料填裝層析柱，在其他條件不變的情況下，考察得到最適的填料種類(lèi)。實(shí)驗(yàn)利用自動(dòng)餾分收集器進(jìn)行級(jí)分收集，間隔時(shí)間為5 min，洗脫速度為1 mL/min。

1.3.3 分離效果檢測(cè)方法

采用凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定多肽分離效果，實(shí)驗(yàn)儀器為HPLC，色譜柱選用TSK-GELG2000SWXL7.8mm×300mm，色譜條件為柱溫30℃，流動(dòng)相乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1，流速為0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，進(jìn)樣量為10mL。以標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞色素C、抑肽酶、桿菌肽、甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸、甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸做分子質(zhì)量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.4 不同分子質(zhì)量多肽的風(fēng)味評(píng)價(jià)

（1）美拉德反應(yīng)

按照表1基本配方，分別稱(chēng)取1.3.2中得到的不同分子質(zhì)量肽段多肽、未分離多肽、空白對(duì)比樣，與其他美拉德反應(yīng)原料一同投入反應(yīng)釜中，溫度升至99℃時(shí)，開(kāi)始計(jì)時(shí)，保持（100±1）℃，反應(yīng)90 min，冷卻降溫，取樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)及電子舌分析。

表1 反應(yīng)物配方Table1 Formula of reaction substrate

（2）感官評(píng)價(jià)

取上述美拉德反應(yīng)后的樣品，用55℃純凈水稀釋100倍后，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)小組由8名訓(xùn)練有素的感官評(píng)價(jià)員組成，每評(píng)價(jià)一個(gè)樣品后需用清水漱口。

感官評(píng)價(jià)指標(biāo)包括雞肉特征、鮮味、醇厚感、持續(xù)性、嗜好性，每個(gè)指標(biāo)按照強(qiáng)度的由弱到強(qiáng)，在0～9分范圍內(nèi)評(píng)分。

（3）電子舌分析

本實(shí)驗(yàn)所用電子舌設(shè)備的傳感器系統(tǒng)包括酸味（sourness，SRS），甜味（sweetness，SWS），苦味（bitterness，BRS），咸味（saltiness，STS），鮮味（umami，UMS），綜合1（GPS）綜合2（SPS）共7根傳感器，選擇Ag/AgCl作為參比電極。傳感器經(jīng)活化、校正后測(cè)樣。

樣品處理方法為取上述美拉德反應(yīng)后的樣品1 g，加入100 mL蒸餾水溶解、過(guò)濾后，添加于專(zhuān)用的25 mL燒杯中檢測(cè)。

1.3.5 呈味肽的純化

利用反相高效液相色譜對(duì)1.3.4中風(fēng)味評(píng)價(jià)效果最優(yōu)的肽段中的混合多肽進(jìn)一步純化。高效液相色譜法的分離純化條件為色譜柱XDB C18；流動(dòng)相采用A：0.05%TFA-水、B：0.05%TFA-乙腈洗脫；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm；柱溫30℃。

1.3.6 呈味肽的鑒定

利用液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)1.3.5中純化后的多肽進(jìn)行進(jìn)一步分離、鑒定其氨基酸序列。質(zhì)譜檢測(cè)條件為模式ESI+/ESI-，電離電壓3.2 kV，離子源溫度120℃，霧化溫度350℃，霧化氣流速600 L/h，錐孔氣流速50 L/h，錐孔電壓30 V。

1.3.7 呈味肽的合成[6-27]

根據(jù)1.3.6中鑒定出的多肽序列，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的氨基酸、多肽呈味效果，選擇其中5條最有可能具有呈味貢獻(xiàn)的多肽進(jìn)行固相合成。合成、純化方法如下：

采用手動(dòng)固相Fmoc法，以H-CTC樹(shù)脂（取代值為1.0 mmol/g）為起始原料，從C端向N端方向合成。用2倍當(dāng)量Fmoc-AA-OH/DIPEA與樹(shù)脂進(jìn)行接枝引入C端第一個(gè)氨基酸殘基，反應(yīng)時(shí)間2 h。而后，用25%六氫吡啶/DMF（體積比）去除N端Fmoc保護(hù)基使N端成為自由氨基。用3倍當(dāng)量Fmoc-AA-OH/DIC/HOBt與樹(shù)脂反應(yīng)以接枝第二個(gè)氨基酸殘基。如此反復(fù)依次連接各個(gè)氨基酸殘基以完成整條多肽的合成。以上每步反應(yīng)后都需用DMF洗滌樹(shù)脂6次以上，并且都通過(guò)Kaiser Test檢測(cè)來(lái)對(duì)反應(yīng)進(jìn)行控制，若某個(gè)氨基酸縮合反應(yīng)不完全，重復(fù)縮合一次，直至得到所需的目標(biāo)肽段。切割及去側(cè)鏈保護(hù)，使用切割試劑（三氟乙酸∶1,2-乙二硫醇∶苯甲硫醚∶苯酚∶H2O∶三異丙基硅烷=68.5∶10∶10∶5∶3.5∶1，V/V）將目標(biāo)多肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)并除去側(cè)鏈保護(hù)基（30℃條件下切割3h）。濾液加入到大量冷的水/乙醚中進(jìn)行萃取，水相凍干即得到多肽粗品。

多肽的純化及表征，采用HP1200型反相高效液相色譜儀對(duì)合成肽粗品進(jìn)行純化。色譜柱型號(hào)：uiso C18（10 μm，100?，50mm×250mm），色譜操作條件：流動(dòng)相A為含0.05%三氟乙酸，2%乙腈的水溶液，流動(dòng)相B為90%乙腈/水，流速25 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。反復(fù)凍干去除溶劑后即得多肽純品。純度由分析型高效液相色譜儀給出。

1.3.8 呈味肽的呈味功能驗(yàn)證

（1）清水評(píng)價(jià)方法：將合成的多肽配制成0.1%濃度的水溶液，評(píng)價(jià)其風(fēng)味強(qiáng)度、和諧性并進(jìn)行整體風(fēng)味特征描述，以了解多肽的基本味覺(jué)特性。并與目前報(bào)道中呈醇厚感最佳的谷胱甘肽作對(duì)比評(píng)價(jià)。

（2）雞粉溶液加香評(píng)價(jià)方法：將合成的多肽配制成含0.05%肽、0.5%雞粉、0.2%NaCl的水溶液，與空白、谷胱甘肽對(duì)比評(píng)價(jià)其在肉味、鮮度、醇厚感、酸味方面的呈味效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽的分離

2.1.1 柱分離洗脫液種類(lèi)考察

將1.3.1中得到的酶解液，采用葡聚糖凝膠過(guò)濾柱法進(jìn)行不同分子質(zhì)量多肽的分離。以葡聚糖凝膠G25為填料填裝層析柱，分別采用水、乙醇-水、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、NaCl-PBS四種洗脫液洗脫，單因素考察不同洗脫液的分離效果。利用自動(dòng)餾分收集器進(jìn)行級(jí)分收集，間隔時(shí)間為5 min，將收集到的不同級(jí)分經(jīng)凝膠過(guò)濾色譜測(cè)定，將分子質(zhì)量相近的級(jí)分合并，得到分子質(zhì)量由高到低三個(gè)片段，記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，再進(jìn)行分子質(zhì)量測(cè)定，評(píng)估分離效果，結(jié)果見(jiàn)表2。

本實(shí)驗(yàn)采用的葡聚糖凝膠填料Sephadex屬于凝膠過(guò)濾層析填料，主要依據(jù)多肽的分子大小和形狀進(jìn)行分離，通常大分子物質(zhì)先被洗脫出來(lái)，而后小分子被洗脫。由表2結(jié)果可知，4種洗脫液洗脫得到的Ⅲ組分分子質(zhì)量均＜1000u，分離效果理想；組分Ⅰ中5 000 u以上部分含量增加較多，增加最多的（乙醇-水洗脫）可以由原液的39.2%提升至77.9%；組分Ⅱ中1 000～2 500 u和2 500～5 000 u含量較低，但1 000～5 000 u總體可達(dá)70%?？梢?jiàn)，樣品流經(jīng)葡聚糖凝膠柱可以實(shí)現(xiàn)不同分子質(zhì)量多肽的有效分離。從不同洗脫液的分離結(jié)果看，乙醇-水分離效果最優(yōu)。

表2 不同洗脫液分離樣品分子質(zhì)量分布測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of the molecular mass distribution separated by different eluents

2.1.2 柱分離填料考察

分別以G25、G15、G10為填料填裝層析柱，在其他條件不變的情況下，單因素考察得到最適的填料種類(lèi)。利用自動(dòng)餾分收集器進(jìn)行級(jí)分收集，間隔時(shí)間為5 min，將收集到的不同級(jí)分經(jīng)凝膠過(guò)濾色譜測(cè)定，將分子質(zhì)量相近的級(jí)分合并，得到分子質(zhì)量由高到低三個(gè)片段，記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，再進(jìn)行分子質(zhì)量測(cè)定，評(píng)估分離效果，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同填料層析柱分離樣品分子質(zhì)量分布測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of the molecular mass distribution separated by different packing chromatographic column

Sephadex填料是由葡聚糖通過(guò)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀凝膠顆粒，商品化的Sephadex填料，按交聯(lián)度不同，用Sephadex G加一個(gè)數(shù)字來(lái)區(qū)別型號(hào)，數(shù)字越小，表示介質(zhì)交聯(lián)度越大，分級(jí)范圍越小，反之亦然。由表3結(jié)果也可證實(shí)，G15、G10的分級(jí)范圍較小，僅能區(qū)分1 000 u以下的組分，對(duì)1 000～5 000 u之間組分的分離效果不佳，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選取G25填料作為多肽分離填料。

2.2 不同分子量多肽的風(fēng)味評(píng)價(jià)

2.2.1 感官評(píng)價(jià)

按照表1中基本配方，分別稱(chēng)取3.1中得到的＜1 000 u、1 000～5 000 u、＞5 000 u分子質(zhì)量片段多肽以及未分離多肽、空白對(duì)比樣，與其他原料一同進(jìn)行美拉德反應(yīng)，取樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)及電子舌分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 肽粉反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of reaction products of peptide powder

表4中評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，3#樣品（分子質(zhì)量＜1000u多肽的熱反應(yīng)產(chǎn)物）在醇厚感、嗜好性方面優(yōu)于其他樣品；2#樣品（分子質(zhì)量1 000～5 000 u多肽的熱反應(yīng)產(chǎn)物）在鮮度方面表現(xiàn)突出；1#樣品（分子質(zhì)量＞5 000 u多肽的熱反應(yīng)產(chǎn)物）在燉煮雞肉香味方面表現(xiàn)更接近于未分離的混合多肽樣品?？梢?jiàn)，不同分子質(zhì)量片段多肽提供的風(fēng)味側(cè)重點(diǎn)不同，其中分子質(zhì)量＜1 000 u以下部分嗜好性最優(yōu)，故將其作為下一步實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.2.2 電子舌分析

圖1 電子舌主成分分析Fig.1 Principal component analysis of electronic tongue

由圖1可知，第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了99.654%，能很好地反映樣品的實(shí)際情況。且全部樣品的主成分分析的識(shí)別指數(shù)為91，說(shuō)明不同樣品能夠很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)。5#清水樣出現(xiàn)在圖中最左側(cè)，4#未分離酶解液樣品出現(xiàn)在圖中最右側(cè)，1～3#樣分布于其中，彼此差異明顯，即5個(gè)樣品風(fēng)味差異較大。

表5 電子舌滋味強(qiáng)度分析Table 5 Analysis of taste intensity of electronic tongue

由表5可知，5個(gè)樣品的鮮味、甜味、酸味強(qiáng)度普遍較高，咸味和苦味強(qiáng)度普遍較低；其中2#樣品的鮮度最高，5個(gè)樣品的鮮度強(qiáng)度排序?yàn)?#＞4#＞3#＞1#＞5#，與感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致。3#樣品的酸度最高；2#樣品的甜度最高。即1 000～5 000 u肽段的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物鮮度、甜度最優(yōu)；小于1 000 u肽段的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物酸度最優(yōu)，適宜的酸度可以增加肉味感，這可能是小于1 000 u肽段在感官評(píng)價(jià)中嗜好性最優(yōu)的因素之一。

2.3 呈味肽的純化

利用反相高效液相色譜對(duì)嗜好性最優(yōu)（分子質(zhì)量＜1000u）的混合多肽樣品進(jìn)一步純化，得到液相色譜圖見(jiàn)圖2，各峰保留時(shí)間及面積百分比見(jiàn)表6。

圖2 混合多肽樣品液相色譜圖Fig.2 LC chromatogram of mixed polypeptide samples

表6 各吸收峰保留時(shí)間及面積百分比Table 6 Retention time and area percentage of each absorption peak

由表6可知，多肽含量最多的色譜峰為5#、6#峰，利用高效液相色譜儀自帶的餾分收集器對(duì)5#、6#色譜峰進(jìn)行收集，凍干后感官評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，6#峰在嗜好性、和諧性方面明顯優(yōu)于5#峰，因此，以收集到的6#峰為研究對(duì)象，進(jìn)一步進(jìn)行分離與鑒定。

2.4 呈味肽的鑒定

利用液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)呈味肽進(jìn)一步進(jìn)行分離及成分鑒定，可檢測(cè)到多種多肽，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的氨基酸、多肽呈味效果，選擇其中5條最有可能具有呈味貢獻(xiàn)的多肽進(jìn)行下一步固相合成。5條多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)分別為γ-L-Glu-L-Glu、γ-L-Glu-L-Asp、γ-L-Glu-L-Val、γ-L-Glu-L-Val-Gly、α-L-Glu-L-Val-Gly，其質(zhì)譜鑒定結(jié)果如圖3所示。

圖35 條呈味肽質(zhì)譜圖Fig.3 Mass chromatogram of five flavor peptides

2.5 呈味肽的合成

目前，較為常用的多肽合成方法包括固相合成和液相合成法。相比于液相合成，固相合成法具有合成方便、迅速、純度高等優(yōu)勢(shì)，已成為多肽合成的首選方法，為此，本實(shí)驗(yàn)采用固相合成法進(jìn)行呈味肽合成。

采用反相高效液相色譜儀對(duì)合成肽粗品進(jìn)行純化，復(fù)凍干去除溶劑后即得多肽純品，純度由分析型高效液相色譜儀給出，均＞98%，產(chǎn)物可作為下一步風(fēng)味驗(yàn)證試驗(yàn)的樣品。

2.6 呈味肽的呈味功能驗(yàn)證

將合成的5條呈味肽以及目前報(bào)道中呈醇厚感最佳的谷胱甘肽（glutathione，GSH）進(jìn)行清水評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，合成的5條多肽，呈味效果基本以酸、甜、鮮味為主，這可能與其都以L(fǎng)-谷氨酸為氮端相關(guān)，而L-谷氨酸是典型的呈現(xiàn)酸味、鮮味的氨基酸。其中，γ-L-Glu-LVal-Gly與α-L-Glu-L-Val-Gly，這兩條多肽的氨基酸序列完全相同，其區(qū)別僅為谷氨酸與纈氨酸之間形成肽鍵的羧基位置不同，但兩者的呈味效果產(chǎn)生明顯差異，表現(xiàn)為γ位的L-Glu-L-Val-Gly酸度高，略鮮甜、入口后唇舌感受到明顯的收斂，而α位L-Glu-L-Val-Gly僅呈現(xiàn)較弱的酸味。由此可知，多肽的呈味功能不僅與其氨基酸序列相關(guān)，還與肽鍵的形成位置等空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。而化合物的空間結(jié)構(gòu)直接影響其與味覺(jué)受體的結(jié)合與味覺(jué)響應(yīng)，從而影響味感。

表76 種多肽感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 7 Sensory evaluation results of six poly peptides

由于不同呈味物質(zhì)間的協(xié)同作用對(duì)呈味效果影響較大，單純的清水評(píng)價(jià)無(wú)法充分體現(xiàn)物質(zhì)味味相乘的作用，因此配置雞粉溶液加香評(píng)價(jià)。合成的5條呈味肽與空白、谷胱甘肽對(duì)比評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表8。

表86 種多肽的雞粉溶液加香評(píng)價(jià)結(jié)果Table 8 Sensory evaluation results of six poly peptides in chicken powder solutions

由表8可知，6條多肽中，谷胱甘肽由于本身含有含硫氨基酸-胱氨酸，相比于其他多肽，其呈現(xiàn)出的肉味最強(qiáng)；呈現(xiàn)鮮味最強(qiáng)的多肽為γ-L-谷谷肽和γ-L-谷纈氨甘肽；呈現(xiàn)醇厚感最強(qiáng)的多肽依次為谷胱甘肽、γ-谷纈甘肽，與文獻(xiàn)報(bào)道中γ-L-谷纈甘肽是L-谷胱甘肽醇厚感的12.8倍，是目前發(fā)現(xiàn)的醇厚感最強(qiáng)的多肽[28]不一致，可能與評(píng)價(jià)基質(zhì)、多肽濃度、溶液pH有關(guān)，有待于今后進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用酶解法以雞肉為原料進(jìn)行雞肉蛋白多肽的制備，通過(guò)葡聚糖凝膠柱層析法對(duì)混合多肽進(jìn)行不同分子質(zhì)量片斷的分離，確定最優(yōu)的分離填料為G25、洗脫液為乙醇-水，在此條件下，分子質(zhì)量＜1 000 u組分含量可達(dá)100%、＞5 000 u含量達(dá)78%、1 000～5 000 u含量達(dá)70%。通過(guò)感官評(píng)價(jià)、電子舌分析發(fā)現(xiàn)，不同分子質(zhì)量片段多肽提供的風(fēng)味側(cè)重點(diǎn)不同，分子質(zhì)量＜1 000 u的多肽熱反應(yīng)產(chǎn)物在醇厚感、嗜好性方面最優(yōu)。利用高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)該肽段進(jìn)一步純化與鑒定，找到其中5條呈味肽γ-L-Glu-L-Glu、γ-L-Glu-L-Asp、γ-L-Glu-L-Val、γ-L-Glu-LVal-Gly、α-L-Glu-L-Val-Gly，并采用固相合成法制備，經(jīng)感官評(píng)價(jià)驗(yàn)證其呈味功能，發(fā)現(xiàn)在清水評(píng)價(jià)中，合成的5條多肽呈味效果以酸、甜、鮮味為主；在雞粉溶液加香評(píng)價(jià)中，呈現(xiàn)鮮味最強(qiáng)的多肽為γ-L-Glu-L-Glu和γ-L-Glu-L-Val-Gly；呈現(xiàn)醇厚感最強(qiáng)的多肽依次為L(zhǎng)-GSH和γ-L-Glu-L-Val-Gly。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)多肽的呈味功能不僅與其氨基酸序列有關(guān)，還與肽鍵的形成位置等空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。多肽的氨基酸組成、序列以及空間結(jié)構(gòu)與呈味之間的構(gòu)效關(guān)系有待于進(jìn)一步深入研究，以便為更多呈味肽的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，以及高品質(zhì)香精、調(diào)味品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

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Preparation,purification and identification of taste peptides

DENG Li,HAO Xuecai,LIU Na
(TianjinKeyLaboratoryofFlavorFoodIngredientsEnterprise,R&DCenter,TianjinChunfaBiotechnologyGroupCo.,Ltd.,Tianjin300300,China)

With chicken as raw material,the chicken protein polypeptides were prepared by enzyme hydrolysis method.According to the different molecular mass fragments,mixed polypeptides were separated by dextran gel column chromatography.The optimal separation filler was G25,the eluent was ethanol-water.Under the conditions,the content of components below molecular mass 1 000 u by separation and enrichment was up to 100%,above molecular mass 5 000 u up to 78%,and molecular mass 1 000-5 000 u up to 70%.The results of sensory evaluation and electronic tongue analysis showed that the polypeptides with different molecular mass fragments provided different taste profiles.The thermal reaction products of peptides that molecular mass was less than 1 000 u were superior in kokumi taste(mellow feeling)and preference.The polypeptides fragments were further purified and identified by HPLC and LC-MS.Five taste peptides were determined,and were prepared by solid-phase synthesis method.Their taste functions were verified by sensory evaluation.Results showed that the taste effect of five taste peptides synthesized was given priority to with sour,sweet and umami taste in the clear water evaluation.The peptides with strongest umami taste were γ-L-Glu-L-Glu and γ-L-Glu-L-Val-Gly,the peptides with strongest kokumi taste(mellow feeling)was L-GSH in the chicken powders solution evaluation

taste peptide;enzymatic hydrolysis;separation;purification;identification

TQ657

0254-5071（2017）04-0142-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.030

2017-01-19

鄧?yán)颍?981-），女，工程師，碩士，主要從事咸味食品香精基礎(chǔ)研究工作。