胡宇豪，李戴陽，汪超，高冰，李冬生，徐寧，胡勇*

（湖北工業(yè)大學(xué)工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430068）

耐受乙醇巴氏醋桿菌ZJ-25培養(yǎng)基的優(yōu)化

胡宇豪，李戴陽，汪超，高冰，李冬生，徐寧，胡勇*

（湖北工業(yè)大學(xué)工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430068）

以中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵醋醅中分離得到的1株耐受12%vol乙醇的巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）ZJ-25為出發(fā)菌株，以產(chǎn)酸量為評價指標(biāo)，采用單因素試驗和正交試驗設(shè)計對培養(yǎng)基配方進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基組合為葡萄糖3%、酵母粉3%、乙醇5.5%、乙酸0.12%。在此最佳培養(yǎng)基條件下，菌株ZJ-25的產(chǎn)酸量由常規(guī)培養(yǎng)基條件下的32.5 g/L提高至44.3 g/L。

醋酸菌；耐乙醇；培養(yǎng)基；優(yōu)化

醋酸菌是釀醋工業(yè)的核心菌種。在釀醋工業(yè)中，最常用于釀醋的醋酸菌是醋桿菌屬（Acetobacter），其中菌株的優(yōu)劣直接影響成醋的產(chǎn)量、質(zhì)量及風(fēng)味[1-3]。巴氏醋酸菌能夠更為高效轉(zhuǎn)化酒精生成醋酸，同時其含有豐富的氧化酶系，不僅能夠?qū)⒕凭D(zhuǎn)化為醋酸，還能氧化形成琥珀酸、檸檬酸等有機酸，對醋的風(fēng)味形成有較大影響[4-5]。醋酸菌在食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)有著較為廣泛的應(yīng)用，在葡萄糖酸和二羥基丙酮的微生物合成中有著重要的作用，該類菌株還具有固氮作用，能用于細菌纖維素的生產(chǎn)[6-8]。

醋酸菌是一類好氧的產(chǎn)酸細菌，乙醇是醋酸發(fā)酵的底物，并且為醋酸菌生長代謝提供能量，溫度和pH是影響醋酸菌生長和代謝的重要因素，是醋酸菌氧化酒精生成乙酸的重要條件[9-10]。大多數(shù)醋酸菌株可用六碳糖作為碳源，并且在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物CO2、醋酸、乳酸、丙酸以及丙酮等。關(guān)于培養(yǎng)基的相關(guān)研究已經(jīng)表明，醋酸桿菌發(fā)酵的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母粉[11-13]，此外，外源乙醇和乙酸也是發(fā)酵培養(yǎng)基中常添加的成分[14-15]。

本研究以中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵醋醅中分離得到的1株巴氏醋桿菌（Acetobacterpasteurianus）ZJ-25為出發(fā)菌株，碳源選用葡萄糖，氮源選用酵母粉，同時添加不同濃度的乙醇和乙酸，對培養(yǎng)基配方進行正交試驗優(yōu)化，這將為菌種的進一步研究提供理論依據(jù)，為菌種的工業(yè)應(yīng)用打下堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巴氏醋桿菌（Acetobacterpasteurianus）ZJ-25：由本實驗室分離自中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的醋醅，可耐受體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇溶液。

1.1.2 試劑

無水乙醇、氯化鈉、葡萄糖：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：上?；瘜W(xué)試劑有限公司；碳酸鈣：德興市明緣化工材料有限公司；酚酞：天津市北辰方正試劑廠；酵母浸粉：安琪酵母股份有限公司；瓊脂：華順生物技術(shù)有限公司；鹽酸：西隴化工股份有限公司。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR323C電子天平：奧豪斯儀器公司；DZ-101C磁力加熱攪拌器：鞏義市予華儀器有限公司；FE20數(shù)顯式酸度計、DZF-6050電熱恒溫培養(yǎng)箱、HH4-電熱恒溫水浴鍋、DHG-9070A恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DXO 7771大龍移液槍：大龍新創(chuàng)實驗儀器有限公司；I8雙光束紫外可見分光光度計：濟南海能儀器有限公司；HNY-2112B柜式全溫震蕩培養(yǎng)箱：天津歐諾儀器儀表公司；FY50高壓蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；TGL-20臺式高速離心機：武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；SW-CJ凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高耐受性醋酸桿菌培養(yǎng)基單因素試驗

（1）葡萄糖添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響：取500mL三角瓶，設(shè)置5個處理，葡萄糖添加量分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，其他成分為酵母粉3%、乙醇6%、乙酸0.1%，用少量水溶解，并加水定容至150 mL，移至三角瓶中，121℃滅菌15 min；在以下條件下進行揺瓶發(fā)酵，將4%醋酸菌液體菌種接種已滅菌的三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度38℃、pH 5.0、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵時間6 d[16]的條件下每個處理組重復(fù)3次，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量。

（2）酵母粉添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響：取500 mL三角瓶，設(shè)置5個處理，酵母粉添加量分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，其他成分為葡萄糖3.0%、乙醇6.0%、乙酸0.1%，加水配制成150 mL的培養(yǎng)基，滅菌后接種，按照1.3.1（1）的條件進行揺瓶發(fā)酵。

（3）乙醇添加量對產(chǎn)酸量的影響：取500 mL三角瓶，設(shè)置5個處理，乙醇添加量分別為4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%，其他成分為葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙酸0.1%，配制成150 mL的培養(yǎng)基，滅菌后接種，按照1.3.1（1）的條件進行揺瓶發(fā)酵。

（4）乙酸添加量對產(chǎn)酸量的影響：取500 mL三角瓶，設(shè)置5個處理，乙酸添加量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，其他成分為葡萄糖添加量3.0%、酵母粉添加量3.0%、乙酸添加量0.1%，配制成150 mL的培養(yǎng)基，滅菌后接種，按照1.3.1（1）的條件進行揺瓶發(fā)酵。

1.3.2 高耐乙醇醋酸桿菌培養(yǎng)基配方正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取葡萄糖、酵母粉、乙醇和乙酸的添加量等4個因素，采用4因素3水平的正交試驗對巴氏醋桿菌ZJ-25的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，正交試驗因素與水平見表1。以發(fā)酵結(jié)束后的產(chǎn)酸量為評價指標(biāo)，確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

表1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for medium formula optimization

1.3.3 菌株產(chǎn)酸量的測定

精密量取3.0 mL樣品于250 mL錐形瓶中，加50 mL水，滴加1～2滴酚酞試劑，放入磁力攪拌子并置于磁力攪拌器上攪拌，邊攪拌邊滴入氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進行滴定。當(dāng)溶液由無色變?yōu)榉凵珪r停止滴加，讀取氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液消耗的體積。具體測定方法參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高耐受性醋酸桿菌培養(yǎng)基單因素試驗

2.1.1 葡萄糖添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響

葡萄糖添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響見圖1。由圖1可知，當(dāng)葡萄糖添加量為2.0%～3.0%時，隨著葡萄糖添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量逐步升高，其中葡萄糖添加量為3.0%時，產(chǎn)酸量最高，為36.9 g/L；葡萄糖添加量＞3.0%時，隨著葡萄糖添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量呈明顯下降趨勢；當(dāng)葡萄糖添加量過少時，碳源不足，醋酸菌的數(shù)量少，產(chǎn)酸量偏低，當(dāng)葡萄糖的添加量過多時，消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)酸量過低。因此，葡萄糖的最宜添加量為3.0%。

圖1 葡萄糖添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.1 Effect of glucose addition on acid yield of strains

2.1.2 酵母粉添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響

圖2 酵母粉添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.2 Effect of yeast powder addition on acid yield of strains

酵母粉添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響見圖2。由圖2可知，當(dāng)酵母粉添加量為2.0%～3.0%時，隨著酵母粉添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量逐步升高，其中酵母粉添加量為3.0%時，產(chǎn)酸量最高，為37.3 g/L；酵母粉添加量＞3.0%時，隨著酵母粉添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量呈明顯下降趨勢。當(dāng)酵母粉添加量過少時，氮源不足，醋酸菌的數(shù)量少，產(chǎn)酸量偏低，當(dāng)酵母粉的添加量過多時，消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)酸量過低。因此，酵母粉的最宜添加量為3.0%。

2.1.3 乙醇添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響

乙醇添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)乙醇添加量為4.5%～5.5%時，隨著乙醇添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量逐步升高，其中乙醇添加量為5.5%時，產(chǎn)酸量最高，為42.5 g/L；乙醇添加量＞5.5%時，隨著乙醇添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量呈明顯下降趨勢。乙醇會氧化為乙酸，當(dāng)乙醇添加量過少時，乙酸產(chǎn)量偏低；乙醇添加量過大時，會抑制醋酸菌產(chǎn)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性，導(dǎo)致乙酸產(chǎn)量的減少。因此，乙醇的最宜添加量為5.5%。

圖3 乙醇添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of ethanol addition on acid yield of strain

2.1.4 乙酸添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響

圖4 乙酸添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of acetic acid addition on acid yield of strain

乙酸添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響見圖4。由圖4可知，當(dāng)乙酸添加量為0.05%～0.10%時，隨著乙酸添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量逐步升高，其中乙酸添加量為0.10%時，產(chǎn)酸量最高，為42.9 g/L；乙酸添加量＞0.10%時，隨著乙酸添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量呈明顯下降趨勢。乙酸會刺激醋酸菌產(chǎn)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶，添加適宜量的乙酸會增加菌株的產(chǎn)酸量。因此，乙酸的最宜添加量為0.10%。

2.2 高耐受性醋酸桿菌培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果

醋酸菌培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for medium formula optimization

由表2可知，從正交試驗各項因素的極差和離差平方和可以看出各因素對醋酸積累的影響強度依次為葡萄糖＞酵母粉＞乙醇＞乙酸。根據(jù)直觀分析可得到的優(yōu)化的菌發(fā)酵培養(yǎng)基組合為A2B2C3D1，此時產(chǎn)酸量為43.8g/L。通過極差分析得到最佳的試驗組合為A2B2C2D3，將得到培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果進行驗證試驗，產(chǎn)酸量為44.5 g/L，通過產(chǎn)酸量的比較，得到最佳的試驗組合是A2B2C2D3，即培養(yǎng)基組分為葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙醇5.5%、乙酸0.12%，將得到的培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果進行3次驗證試驗，平均產(chǎn)酸量為44.3g/L。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

表3的方差分析表明，葡萄糖和酵母粉添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響極顯著（P＜0.01），乙醇添加量對產(chǎn)酸量影響顯著（P＜0.05），添加乙酸添加量對產(chǎn)酸量的影響不顯著。

3 結(jié)論

本研究對中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵醋醅中分離得到的1株高耐受性巴氏醋桿菌ZJ-25的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。通過對培養(yǎng)基中的葡萄糖、酵母粉、乙醇、乙酸的添加量采取正交試驗優(yōu)化，得出該菌的最優(yōu)培養(yǎng)基成分為葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙醇5.5%、乙酸0.12%。在發(fā)酵溫度32℃、轉(zhuǎn)速180r/min、發(fā)酵天數(shù)6d、初始pH6.0的發(fā)酵條件下，巴氏醋桿菌ZJ-25的產(chǎn)酸量由常規(guī)條件下的32.5 g/L提高至44.3 g/L。為巴氏醋桿菌ZJ-25的進一步研究及工業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。參考文獻：

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Optimization of culture medium for ethanol-tolerantAcetobacter pasteurianusZJ-25

HU Yuhao,LI Daiyang,WANG Chao,GAO Bing,LI Dongsheng,XU Ning,HU Yong*
(Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation,Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

UsingAcetobacter pasteurianusisolated from vinegar grains of traditional Chinese solid-state fermentation with 12%vol ethanol tolerance as original strain,using acid yield as evaluation index,the medium formula forA.pasteurianusZJ-25 culture for acid production was optimized by single factor and orthogonal experiments.Results showed that the optimal medium formula was as follows:glucose 3%,yeast powder 3%,ethanol 5.5%,acetic acid 0.12%.Under these conditions,the acid yield of strain ZJ-25 increased from 32.5 g/L to 44.3 g/L.

acetic acid bacteria;ethanol tolerant;culture medium;optimization

TS264.2

0254-5071（2017）04-0118-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.025

2016-11-10

湖北省自然科學(xué)基金（2015CFB678）；湖北省級教育部門青年人才項目（Q20151412）

胡宇豪（1993-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物和發(fā)酵工程。

*通訊作者：胡勇（1980-），男，講師，博士，研究方向為細胞工程。