羅琳，王其慧，趙海霞，張殿朋，劉婭*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆巴音郭勒蒙古自治州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，新疆庫爾勒841100；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院植保所，北京100097）

葡萄灰霉病生防菌株的篩選及其拮抗機(jī)理初探

羅琳1，王其慧1，趙海霞2，張殿朋3，劉婭1*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆巴音郭勒蒙古自治州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，新疆庫爾勒841100；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院植保所，北京100097）

以新疆哈密瓜、蟠桃及紅棗中分離出的59株內(nèi)生細(xì)菌為出發(fā)菌株，采用離體實(shí)驗(yàn)和活體實(shí)驗(yàn)，從中篩選出11株對(duì)葡萄灰霉菌具有較好抑制作用的菌株；經(jīng)低溫作用、農(nóng)藥耐受性及致病菌廣譜性等復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，從紅棗中獲得1株性能優(yōu)良的目標(biāo)菌株T2，該菌在0℃條件下對(duì)葡萄灰霉菌的抑菌率可達(dá)58.43%，農(nóng)藥耐受性達(dá)68.2%～98.4%，對(duì)致病菌具有廣譜抗性，其中桃褐腐病菌和草莓灰霉菌的病原菌菌落直徑均小于30 mm，葡萄炭疽菌病原菌菌落直徑小于50 mm。經(jīng)過形態(tài)、生理生化和16S rDNA同源性分析，確定菌株T2為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），該菌主要依靠菌體本身和重寄生作用對(duì)葡萄灰霉菌發(fā)揮拮抗作用。

葡萄灰霉病；生物防治；內(nèi)生菌；篩選；拮抗機(jī)理

葡萄灰霉?。╣raymold）是由灰葡萄孢（Botrytiscinerea）侵染引發(fā)的一類葡萄病害[1]，果實(shí)采后因貯藏條件相對(duì)濕度較大、溫度適宜，易大面積發(fā)病，導(dǎo)致每年葡萄采后的腐爛損失率高達(dá)30%[2]。二氧化硫、硫化物等化學(xué)保鮮劑和吡咯類[3]、甲氧基丙烯酸酯類[4]等化學(xué)殺菌劑[5]都是在生產(chǎn)上常用的防治采后灰霉病害的方法，但其使用中產(chǎn)生的病原菌抗藥性、化學(xué)試劑殘留、環(huán)境污染問題日益突出。因此，有必要尋找更安全、環(huán)保、有效的葡萄病害防治方法。

已有研究表明，許多細(xì)菌具有防治灰霉病的效果，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、短體芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）、假單孢菌（Pseudomonassp.）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheni formis）、熒光假單孢菌（Pseudomona fluorescens）、嗜麥芽黃單孢菌（Xanthomonas maltophilia）等，可使番茄、葡萄、辣椒、草莓、蘋果等多種植物免受灰霉病的侵害，拮抗菌的抑制率高達(dá)80%以上[6-9]。現(xiàn)今內(nèi)生拮抗菌已成為植物病害防治中重要的生防因子，有很大的發(fā)展?jié)摿?。研究表明，?nèi)生菌長期存活于宿主植物體內(nèi)，與其協(xié)同進(jìn)化，宿主植物為其提供所需的營養(yǎng)和能量，其又可借助信號(hào)傳導(dǎo)作用或通過自身代謝產(chǎn)物對(duì)宿主植物產(chǎn)生影響[10-11]。目前人們已從水稻、辣椒、馬鈴薯葡萄等多種植物中分離篩選出對(duì)青枯病、白粉病、灰霉病等常見病害具有良好抑制作用的內(nèi)生菌株[12-15]。

鑒于拮抗細(xì)菌具有種類多，繁殖速度快，作用方式廣等優(yōu)勢，加之源自果蔬中的內(nèi)生細(xì)菌具有很高的安全性，因此本研究以哈密瓜、蟠桃及紅棗中分離的內(nèi)生菌為出發(fā)菌株，從中篩選對(duì)葡萄灰霉病具有較好防效的生防細(xì)菌，對(duì)于拓寬葡萄灰霉病生防菌種來源，提高生防菌種安全性具有重要理論意義和實(shí)際研究價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原材料

葡萄：購自新疆石河子143團(tuán)，具體品種包括紅提，維多利亞和巨峰，要求顆粒飽滿、成熟度一致、無病蟲害。

1.1.2 供試菌種

供試出發(fā)菌株：實(shí)驗(yàn)室自主分離的59株植物內(nèi)生細(xì)菌，其中23株源自新疆哈密瓜，23株源自新疆蟠桃，13株源自新疆紅棗。

供試植物病原菌：葡萄灰霉菌（grapeBotrytis cinerea），草莓灰霉菌（strawberryBotrytis cinerea），葡萄炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），桃褐腐病菌（Monilinia laxa），均由北京市農(nóng)林科學(xué)院提供。

1.1.3 化學(xué)試劑

瓊脂、牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；次氯酸鈉、氯化鈉、葡萄糖、無水乙醇（均為分析純）：天津盛奧化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，pH 7.2，蒸餾水1 000 mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

X-700型TOMY快速自動(dòng)高壓滅菌儀：南京非同科學(xué)儀器有限公司；LHR-100型低溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；QHR-98A型全溫度振蕩培養(yǎng)箱：太倉市華美生化儀器廠；LGJ-1型真空冷凍干燥機(jī)：北京亞泰隆儀器技術(shù)有限公司；G560E型通用漩渦混勻器：北京科技有限公司；OLRMPUS CX41型顯微鏡：北京悅馳恒業(yè)儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 離體實(shí)驗(yàn)（in vitro）

采用平板對(duì)峙法[16]，同時(shí)以單獨(dú)接種灰霉菌菌餅的平板為對(duì)照，25℃培養(yǎng)7 d，測定菌落直徑[17]，用抑菌帶寬表示病菌菌絲邊緣到細(xì)菌菌落邊緣的距離。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2 活體實(shí)驗(yàn)（in vivo）

將葡萄果粒表面洗凈晾干，放入體積分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min，用無菌水沖洗2遍，常溫下自然晾干，隨機(jī)分組，每組40粒果實(shí)。使用滅菌打孔器在葡萄果實(shí)中間部位打一直徑3 mm、深4 mm的孔，形成一個(gè)傷口。將離體實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)較好的拮抗細(xì)菌制成菌懸液（108CFU/mL），分別接入不同組葡萄的傷口中，每孔注入20μL，以接入20μL無菌水作為對(duì)照組，放置2 h自然晾干后再各接入20 μL病原菌孢子懸浮液（106CFU/mL），放置2 h自然晾干后置于25℃條件下貯藏。5 d后觀察發(fā)病面積大小，使用游標(biāo)卡尺測量病變直徑，并按不同發(fā)病等級(jí)進(jìn)行記錄[18]。使用已經(jīng)證實(shí)了的1到4級(jí)評(píng)定進(jìn)行評(píng)估。1級(jí)為0%，表示沒有可見的發(fā)病癥狀；2級(jí)表示發(fā)病面積占0～35%（不包括0%）；3級(jí)表示發(fā)病面積約占35%～65%；4級(jí)表示發(fā)病面積約占65%～100%[19]。每組實(shí)驗(yàn)做3組平行實(shí)驗(yàn)，記錄平均病情級(jí)數(shù)。并計(jì)算病情指數(shù)及相對(duì)防效。

病情指數(shù)及防治效果的計(jì)算公式如下：

1.3.3 低溫生長實(shí)驗(yàn)

將供試葡萄灰霉菌菌餅（直徑6 mm）接于PDA平板中央，用接種環(huán)在培養(yǎng)的拮抗菌平板上挑取一環(huán)菌，在PDA平板上距葡萄灰霉菌餅中心3 cm的兩側(cè)劃線，置于0℃培養(yǎng)7 d，測量葡萄灰霉菌落直徑，每個(gè)處理做3次重復(fù)。同時(shí)以放置在常溫25℃條件下進(jìn)行相同處理的平板為對(duì)照。

1.3.4 農(nóng)藥耐受性實(shí)驗(yàn)

選取常見殘存于鮮食葡萄中的代森錳鋅、甲霜靈、腐霉利、氯氰菊酯4種農(nóng)藥，以國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)4種農(nóng)藥的最大殘留量要求（用量依次為5mg/kg，1mg/kg，5mg/kg和0.2mg/kg）添加到初篩的拮抗菌菌液中，170r/min振蕩培養(yǎng)48h，以無農(nóng)藥組作為對(duì)照，測定波長600 nm處的菌株OD600nm值，每種農(nóng)藥做3個(gè)重復(fù)。

1.3.5 廣譜抗性實(shí)驗(yàn)

采用平板對(duì)峙法，測試初步篩選出的細(xì)菌對(duì)草莓灰霉菌、葡萄炭疽菌、桃褐腐病菌三種病原真菌菌絲生長的拮抗作用。同時(shí)以單獨(dú)接種病原菌菌餅的平板為對(duì)照，置于25℃培養(yǎng)7 d，觀察抑制效果，每個(gè)處理做3次重復(fù)[20]。

1.3.6 目標(biāo)菌株T2的鑒定

形態(tài)觀察：將T2菌株在NA培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)[21]。挑取菌株進(jìn)行革蘭氏染色，并用顯微鏡于高倍鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.3.7 分子生物學(xué)鑒定

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法對(duì)T2菌株的16S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：模板10×PCRbuffer5μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L）4 μL、模板2 μL、TapDNA聚合酶1μL、引物各1μL，補(bǔ)充去離子水至50μL。反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃30 s，48℃30 s，72℃1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃10 min[22]。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳進(jìn)行分析后送往北京市理化分析測試中心進(jìn)行序列的測定。獲得菌株序列后，進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，尋找具有較高同源性的16S rDNA序列。并利用MEGA4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[23]。

1.3.8 T2拮抗機(jī)理抗生作用的研究

將已培養(yǎng)24 h的T2菌株接種于PDB液體培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)3～4 d后，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min、時(shí)間20 min的條件下進(jìn)行離心分離，收集上清液待用。將分離的菌體于28℃條件下干燥，收集菌體。采用濾紙片法[24]進(jìn)行拮抗離體實(shí)驗(yàn)，將葡萄灰霉菌菌餅（直徑6 mm）放于PDA平板中央，然后在平板上接入四個(gè)沾有T2菌液的圓濾紙片，接種點(diǎn)距離平板中心3cm，并以沾有無菌水調(diào)配菌體的濾紙片做對(duì)比，25℃培養(yǎng)7 d，觀察現(xiàn)象[25]。每個(gè)處理做3次重復(fù)。

1.3.9 拮抗細(xì)菌對(duì)葡萄灰霉菌菌絲生長的影響

采用生長速率法[26]進(jìn)行檢測。取菌株T2的發(fā)酵液，用無菌水分別稀釋至5倍、50倍和500倍。然后每個(gè)梯度各取1 mL于平皿內(nèi)，倒入9 mL融化好的無菌PDA培養(yǎng)基，待凝固后在平板中央接種葡萄灰霉病菌菌餅（6 mm），以加入等量無菌水的培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。25℃培養(yǎng)7d后測量菌落直徑，計(jì)算不同濃度的T2發(fā)酵液對(duì)葡萄灰霉菌菌絲的生長抑制率，計(jì)算公式如下：

1.3.10 重寄生作用的觀察

分別在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基和酪蛋白培養(yǎng)基平板上，使用濾紙片法接入待測菌株，每種培養(yǎng)基平板重復(fù)3次，于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。觀察菌株在以上3種培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈的情況，測量水解圈直徑大小[27]。

將直徑為6mm的葡萄灰霉菌菌餅放于PDA平板中央，然后等距離3 cm接T2菌株，置于培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)7 d，挑取病菌菌落邊緣的菌絲置于事先滴有無菌水的載玻片上，壓片后在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。以只接灰霉病菌為對(duì)照。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2003和SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的篩選

經(jīng)離體實(shí)驗(yàn)和活體實(shí)驗(yàn)，以抑菌帶寬為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從59株新疆植物內(nèi)生菌中初篩得到11株對(duì)葡萄灰霉菌具有較好抑制作用的細(xì)菌，結(jié)果見表1和表2。

表1 內(nèi)生菌的離體抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1In vitroantibacterial experiments results of endophytic bacteria

表2 內(nèi)生菌對(duì)不同品種葡萄果實(shí)的拮抗作用結(jié)果Table 2 Antagonistic experiments results of endophytic bacteria on different varieties of grapes

對(duì)11株菌進(jìn)行低溫作用、農(nóng)藥耐受性及廣譜抗性的考察，結(jié)果見圖1、圖2及表3。經(jīng)復(fù)篩獲得1株性能最優(yōu)的目標(biāo)菌株T2，該菌源自紅棗，0℃下對(duì)葡萄灰霉的抑菌率達(dá)58.43%?？紤]到鮮食葡萄表面殘留的農(nóng)藥會(huì)影響菌株生長，因此希望拮抗菌對(duì)農(nóng)藥具有一定抗性。實(shí)驗(yàn)證明T2能耐受葡萄中常見的4種農(nóng)藥代森錳鋅、甲霜靈、腐霉利、氯氰菊酯，農(nóng)藥耐受性達(dá)到68.2%～98.4%，說明菌株T2對(duì)農(nóng)藥具有較好耐受性。該菌對(duì)桃褐腐病菌、葡萄炭疽菌、草莓灰霉菌均有良好的抑制效果。

圖111 株拮抗菌低溫條件下的離體抑菌率Fig.1 Antibacterial rates of 11 antagonistic strains at low temperature

圖24 種農(nóng)藥對(duì)11株拮抗菌生長的影響Fig.2 Effect of four pesticides on 11 antagonistic strains growth

表311 株拮抗菌對(duì)多種病原菌的抑制效果分析Table 3 Effect of 11 antagonistic strains on inhibition of various pathogenic bacteria

2.2 目標(biāo)菌株T2的鑒定

2.2.1 T2的形態(tài)鑒定和生理生化鑒定

觀察T2在NA固體平板上的菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)菌落為乳白色、不透明、圓形，菌落表面干燥、邊緣整齊。顯微鏡下觀察T2菌體形態(tài)，菌體呈桿狀、革蘭氏染色陽性，可產(chǎn)芽孢[28]。

菌株T2生理生化鑒定結(jié)果顯示，接觸酶反應(yīng)、耐鹽性實(shí)驗(yàn)（7%、17%）、pH5.7生長實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)均呈陽性；石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.2.2 T2的分子生物學(xué)鑒定

通過16S rDNA序列比對(duì)分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。結(jié)合形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，判定該菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[29]。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的拮抗菌T2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain T2 based on 16S rDNA sequences

2.3 T2拮抗葡萄灰霉機(jī)理的初探

2.3.1 抗生作用

圖4 分離后的菌體、菌液對(duì)葡萄灰霉的離體抑制效果Fig.4In vitroinhibition effect of cell and solution onBotrytis cinerea

自然界中大多數(shù)細(xì)菌可以產(chǎn)生對(duì)自身或其他微生物有抑制作用的拮抗物質(zhì)。為了解目標(biāo)菌株T2對(duì)葡萄灰霉的拮抗機(jī)理是否因?yàn)榭股饔?，?duì)菌株T2進(jìn)行菌體及菌液分離后的離體拮抗實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖4。從圖4可以明顯看出，菌體和菌液對(duì)葡萄灰霉均有抑制作用，其中菌體的抑制作用大于菌液的抑制作用，可見T2菌體本身對(duì)葡萄灰霉產(chǎn)生主要抑制作用。

2.3.2 T2對(duì)葡萄灰霉菌菌絲生長的影響

拮抗細(xì)菌T2對(duì)葡萄灰霉菌菌絲生長的抑制作用見表4。從表4可以看出，在生長速率實(shí)驗(yàn)中，各濃度梯度的T2發(fā)酵液均對(duì)葡萄灰霉菌的菌絲生長有不同程度的抑制作用。其中，菌株T2發(fā)酵液原液對(duì)葡萄灰霉菌菌絲生長的抑制率高達(dá)81.9%，后隨稀釋倍數(shù)的增大，抑制作用逐漸減弱，但濃度稀釋至500倍時(shí)仍對(duì)灰霉菌菌絲的生長有31.6%的抑制率。因此推測菌株T2在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，可能產(chǎn)生了能抑制葡萄灰霉病菌生長的抑菌物質(zhì)。

表4 拮抗細(xì)菌T2對(duì)葡萄灰霉菌菌絲生長的抑制作用Table 4 Inhibitory effect of antagonistic strain T2 on mycelium growth ofBotrytis cinerea

2.3.3 重寄生作用的觀察

對(duì)菌株T2產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和蛋白酶的活性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)培養(yǎng)基和酪蛋白培養(yǎng)基上沒有出現(xiàn)水解圈，羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上出現(xiàn)了水解圈（直徑為2.0 mm）。說明該菌不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和蛋白酶，產(chǎn)生纖維素酶但活性較低。

圖5 拮抗菌T2對(duì)葡萄灰霉菌的重寄生作用Fig.5 Mycoparasitism effects of antagonistic bacteria T2 against Botrytis cinerea

重寄生作用實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組葡萄灰霉菌菌落邊緣圓滑而整齊，菌落邊緣新生的菌絲比較稀疏，內(nèi)部的菌絲生長較茂密。實(shí)驗(yàn)組葡萄灰霉菌菌落的邊緣同對(duì)照組一樣，圓滑而整齊，但菌絲的生長速度明顯緩慢，生長量也明顯減少，而菌落較對(duì)照組厚且密。挑取兩組病原菌菌落邊緣的菌絲置于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（見圖5），對(duì)照組的菌絲粗細(xì)均勻、舒展而飽滿，而實(shí)驗(yàn)組的菌絲則粗細(xì)不均勻，部分菌絲有膨大、變形甚至出現(xiàn)斷裂的現(xiàn)象，發(fā)生了畸變。經(jīng)推測，菌株T2可能產(chǎn)生具有溶菌作用的活性物質(zhì)，導(dǎo)致了重寄生現(xiàn)象的發(fā)生[30]。

3 結(jié)論

本研究從紅棗中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌T2，在離體實(shí)驗(yàn)和活體試驗(yàn)中均對(duì)葡萄灰霉病具有較好的防效。對(duì)低溫（0℃），農(nóng)藥代森錳鋅、甲霜靈、腐霉利和氯氰菊酯具有一定耐受性，對(duì)其他果蔬病害具有一定廣譜抗性。初探其拮抗機(jī)理，發(fā)現(xiàn)菌株T2本身具有抗生作用，并能通過重寄生作用抑制病害的發(fā)生。菌株T2經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

本實(shí)驗(yàn)分離得到的拮抗細(xì)菌T2對(duì)葡萄灰霉病具有較好的防效，并具有廣譜抗性。接下來將進(jìn)一步深入探討該菌株的拮抗機(jī)理和特性，研發(fā)與制備生防制劑，為我國鮮食葡萄及其他果蔬的采后貯藏保鮮技術(shù)提供新的可能性。

[1]周海蓮.葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）對(duì)灰霉病抑制機(jī)理的探討[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[2]熊艷.草莓灰葡萄孢拮抗菌株的篩選，鑒定及其抗菌活性物質(zhì)研究[D].成都：四川師范大學(xué)，2011.

[3]CAHIL L.Evaluation of the new active fludioxinil in the product maxim 100 FS ftmgicide seed treatlnent[M].Canberra:National Registration Authority for Agricultural and Veterinary Chemicals,2004,1-3.

[4]朱華，王建菊，錢永祥，等.阿米西達(dá)防治茄子灰霉病藥效試驗(yàn)[J].上海蔬菜，2009（1）：66-67.

[5]潘東，楊紅，劉賢進(jìn).葡萄中嘧菌環(huán)胺的氣相色譜分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（5）：1199-1200.

[6]MOLINE H,HUBBARD J E,KARNS J S,et al.Selective isolation of bacterial antagonists ofBotrytis cinerea[J].Eur J Plant Pathol,2004, 28:95-101.

[7]黃曉亞，常永義，崔欣，等.拮抗菌P1，P5對(duì)葡萄灰霉病菌的抑制作用及其抗真菌譜的測定[J].植物保護(hù)，2009，35（4）：134-137.

[8]王偉，李術(shù)娜，李紅亞，等.番茄灰霉病拮抗細(xì)菌的篩選與X-75菌株鑒定[J].園藝學(xué)報(bào)，2010，37（2）：307-312.

[9]胡朋，申琳，范蓓，等.番茄灰霉病拮抗細(xì)菌Bacillus-1的篩選和鑒定[J].食品科學(xué)，2008，29（6）：276-279.

[10]鄭燕玲.石斛蘭（Dendrobium chrysopterum）內(nèi)生菌的分離及其生物防治功能研究[D].廣州：中山大學(xué)，2006.

[11]國輝，毛志泉，劉訓(xùn)理.植物與微生物互作的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（9）：28-33.

[12]阿里瑪斯.辣椒疫病拮抗內(nèi)生放線菌的篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)條件研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

[13]馮金龍.馬鈴薯病原真菌拮抗細(xì)菌鑒定及其生物學(xué)功能研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[14]SUMARAH M W,KESTING J R,MILLER J D,et al.Antifungal metabolites from fungal endophytes ofPinus strobus[J].Phytochemistry,2011,72(14):1833-1837.

[15]田恩琴，常永義，朱建蘭，等.2株拮抗菌的抑菌作用及產(chǎn)酶能力初探[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（6）：41-45.

[16]李燕津，邱服斌，陳美娟，等.駿棗內(nèi)生生防細(xì)菌的分離、篩選與鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（7）：1031-1035.

[17]程凱，江歡歡，沈標(biāo)，等.棉花黃萎病拮抗菌的篩選及其生物防治效果[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2011（1）：166-174.

[18]PARAFATI L,VITALE A,RESTUCCIA C,et al.Biocontrol ability and action mechanism of food-isolated yeast strains againstBotrytis cinereacausingpost-harvestbunchrotoftablegrape[J].Food Microbiol, 2015,47:85-92.

[19]宋開艷，再那吉阿米尼古麗，馮宏祖.南疆葡萄采后致病菌分離鑒定及拮抗菌的篩選[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，48（5）：871-876.

[20]候美玲，辛媛媛，郝志敏，等.玉米內(nèi)生芽胞桿菌的抗菌活性物質(zhì)及其拮抗玉米大斑病菌機(jī)理的初步研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，20（9）：1018-1027.

[21]史忠良.辣椒青枯病生防菌的分離和鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015， 18：128-129.

[22]劉郵洲，陳志誼，梁雪杰，等.番茄枯萎病和青枯病拮抗細(xì)菌的篩選，評(píng)價(jià)與鑒定[J].中國生物防治學(xué)報(bào)，2012，28（1）：101-108.

[23]汪雪靜，卜春亞，靳永勝，等.草莓根腐病菌拮抗細(xì)菌的分離與鑒定[J].園藝學(xué)報(bào)，2011，38（9）：1657-1666.

[24]徐亞軍，趙龍飛.野生艾蒿浸提物對(duì)大腸桿菌的抑制作用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（4）：306-308.

[25]侯啟會(huì).向日葵菌核病根際拮抗菌的篩選，鑒定及其作用機(jī)理的初步研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[26]洪堅(jiān)平，來航線.應(yīng)用微生物學(xué)[M].北京：中國林業(yè)出版社，2011：85-87.

[27]曹明慧，冉煒，楊興明，等.煙草黑脛病拮抗茵的篩選及其生物效應(yīng)[J].土壤學(xué)報(bào)，2011，48（1）：151-159.

[28]QIN X J,XIAO H M,XUE C H,et al.Biocontrol of gray mold in grapes with the yeastHanseniaspora uvarumalone and in combination with salicylic acid or sodium bicarbonate[J].Postharvest Biol Tec,2015, 100:160-167.

[29]CASTORIA R,DE CURTIS F,LIMA G,et al.β-1,3-glucanase activity of two saprophytic yeasts and possible mode of action as biocontrol agents against postharvest diseases[J].Postharvest Biol Tec,1997,12 (3):293-300.

[30]申光輝，薛泉宏，張晶，等.草莓根腐病拮抗真菌篩選鑒定及其防病促生作用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（22）：4612-4626.

Screening of bio-control strain againstBotrytis cinereaand preliminary research on its antagonistic mechanisms

LUO Lin1,WANG Qihui1,ZHAO Haixia2,ZHANG Dianpeng3,LIU Ya1*
(1.College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China;2.Institute of Product Quality Supervision,Bayingol Mongolian Autonomous Prefecture,Kuerle 841100,China;3.Institute of Plant Protection,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097,China)

Using 59 endophytic strains isolated from Xinjiang hami melon,flat peach and red dates as test materials,byin vitroandin vivoexperiments,11 strains which had strong antagonism effects onBotrytis cinereawere screened.Through low temperature antagonism,pesticides tolerance and broad spectrum disease resistance tests,the optimal endophytic strain T2 that isolated from red date was screened.Its antibacterial rate on B.cinereawas 58.43%at 0℃and its pesticide resistance was up to 68.2%-98.4%.Besides,it proved that the endophytic bacteria had good inhibitory effects onMonilinia fructicolaand strawberryBotrytis cinerea(diameter both less than 30 mm)andColletotyichun gloesporioides(diameter less than 50 mm).After morphology identification and 16S rDNA sequence analysis,strain T2 was identified asBacillus amyloliquefaciens.The antagonistic mechanism onB.cinereawas mainly by the bacteria itself and hyperparasitism effect.

Botrytis cinerea;biological control;endophytic bacteria;screening;antagonistic mechanism

TS201.3

0254-5071（2017）04-093-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.020

2016-11-15

兵團(tuán)博士資金專項(xiàng)（2014BB006）

羅琳（1993-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。

*通訊作者：劉婭（1974-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。