王亞萍，王修清，孫建華，2，馮欣，2，孟慶恒，2*

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

菌株Sr18殺線蟲代謝物的規(guī)模發(fā)酵及殺線效果研究

王亞萍1，王修清1，孫建華1，2，馮欣1，2，孟慶恒1，2*

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

實驗以菌株Sr18（Syncephalastrum racemosum）為發(fā)酵對象，以殺線蟲活性為考察指標，在5 L、30 L發(fā)酵研究基礎上，進行了200 L和5 t發(fā)酵罐水平上的規(guī)模發(fā)酵實驗。結果顯示，200 L罐發(fā)酵工藝參數為接種量4%，發(fā)酵溫度26℃，罐壓0.05～0.12 MPa，空氣流量4～9 m3/h，轉速120～198 r/min，發(fā)酵周期48 h；5 t罐發(fā)酵參數為接種量4%，發(fā)酵溫度26℃，罐壓0.03 MPa，空氣流量65～80 m3/h，轉速80～90 r/min，發(fā)酵周期40 h。在此發(fā)酵條件下，200 L和5 t罐的1倍稀釋發(fā)酵液的殺線蟲活性均可達到100%，表明實驗所設定的發(fā)酵參數適用、可控。

菌株Sr18；殺線蟲代謝產物；規(guī)模發(fā)酵；殺線蟲活性

根結線蟲在世界范圍內分布廣泛，侵染作物后植物根部形成根結，嚴重影響植物對養(yǎng)分和水分等物質的吸收和利用，造成了嚴重的農業(yè)經濟損失[1]。線蟲的防治措施中，生物防治由于其環(huán)境相容性好、二次污染小等優(yōu)點而受到廣泛關注，其中真菌生防制劑的關注度更高，已有淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）和厚垣普奇尼亞菌（Pochonia chlamydosporia）制成的殺線劑在我國實現商業(yè)應用[2-3]，更多的相關研究正在積極的進行當中[4-8]。

菌株Sr18（Syncephalastrum racemosum）即是一株研究較為深入的殺線蟲真菌。前期研究表明，菌株Sr18代謝物具有廣譜殺線作用，對南方根結線蟲（Meloidogyn incognita）、松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）和大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines Ichinohe）均有很強的毒力作用，尤其是對根結線蟲，處理24h后校正死亡率達100%[9]，并具有快速擊倒和殺死效應，藥效隨時間的延長而增加[10]。進一步的溫室黃瓜栽培實驗發(fā)現，該菌代謝物可通過提高黃瓜植株體內抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxyde dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性，以及提升保護酶如多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）的含量，提高植株對線蟲的抗性，實現對宿主的保護作用[11]。田間試驗結果還發(fā)現，菌株Sr18代謝物不僅可使蟲口密度明顯減退，而且增產顯著，效果高于益舒豐和滅蟲靈[12]。理化性質研究結果表明，其代謝物活性組分具有分子質量小、耐熱、水溶性好、環(huán)境相容性好等優(yōu)點[13]，顯示出良好的開發(fā)應用前景。

本研究以前期5 L和30 L發(fā)酵工藝參數為參照[14]，對200 L和5 t發(fā)酵罐條件下規(guī)模發(fā)酵進行了有益的嘗試，以驗證動態(tài)參數在規(guī)模發(fā)酵過程中工藝條件的可控性，旨在為今后菌株Sr18代謝物的大規(guī)模生產提供實驗依據。目前，對菌種實施大規(guī)模發(fā)酵技術的研究已成為生防制劑開發(fā)應用的瓶頸，導致生防制劑雖然研究眾多，但只有少數生防菌株被開發(fā)為商業(yè)化制劑，大部分仍停留在實驗室階段[2]，而進行5 t罐規(guī)模發(fā)酵的研究更不多見，這也是本研究在初期小容積發(fā)酵技術的基礎上進行200 L和5 t罐規(guī)模發(fā)酵試驗的關鍵所在，對于該菌株從實驗室研究階段，順利過度到大規(guī)模發(fā)酵生產階段具有重要意義[15-17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種及線蟲

菌株Sr18（Syncephalastrum racemosum）：天津師范大學生命科學院微生物實驗室；松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）：中國林科院森保所。

1.1.2 化學試劑

蔗糖、麥芽精（生化試劑）：天津市化學試劑一廠；瓊脂（生化試劑）：天津市化學試劑三廠；次氯酸鈉（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基采用馬鈴薯蔗糖瓊脂（potato sucrose agar，PSA）培養(yǎng)基：20 g/L蔗糖，2 g/L麥芽精，20 g/L瓊脂，溶于1 L土豆汁中（300 g/L），pH自然。0.1 MPa滅菌20 min。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基（200 L）：土豆48 kg，蔗糖3.0 kg，麥芽精0.50 kg，泡敵少許，pH自然。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基（5 t）：土豆1 000 kg，蔗糖65.8 kg，麥芽精6.58 kg，泡敵適量，pH自然。

1.2 儀器與設備

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；SW-CJ-1F型凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；200 L、5 t自動發(fā)酵罐、FPC-2000型發(fā)酵過程集散控制系統(tǒng)：江蘇綠環(huán)生化工程成套裝備有限公司；RPN-P100、RPN-P 300型真空濃縮鍋：陜西三原宏達實業(yè)公司輕工設備廠；L-100型噴霧塔：新星獸藥廠；SX500型全自動高壓蒸汽滅菌鍋：日本Tomy Digital Biology公司；DB型電熱恒溫干燥箱：天津市華北實驗儀器有限公司；LDZ5-2型雷勃爾離心機：北京雷勃爾離心機有限公司；XTB-A 5538型體視顯微鏡：桂林光學儀器廠；k-25血球計數板：上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 200 L罐發(fā)酵培養(yǎng)

菌種的活化培養(yǎng)：將保藏的菌株Sr18接入斜面活化培養(yǎng)基，26℃條件下靜置培養(yǎng)5～7 d。

孢子懸液的制備：活化培養(yǎng)兩代的菌株Sr18，用接種環(huán)挑取3～5環(huán)孢子至無菌水中，k-25血球計數板測定菌濃度，備用。

一級種子制備：50 L罐，裝液量46%，接種量16%，培養(yǎng)24 h，備用。

200 L發(fā)酵培養(yǎng)：裝液量63%，接種量4%，培養(yǎng)48 h。發(fā)酵過程中每隔4 h取樣，待測。

1.3.2 5 t罐發(fā)酵培養(yǎng)

一級種子制備：500 L罐，裝液量50%，接種量15%，培養(yǎng)24 h，備用。

5t發(fā)酵培養(yǎng)：裝液量66%，接種量4%，發(fā)酵時間為40 h。發(fā)酵過程中每隔4 h取樣，待測。

1.3.3 生物量的測定

采用菌體干質量法：將發(fā)酵液用已稱質量的干燥濾紙進行真空抽濾，然后將菌體和濾紙置于干燥皿內，置于105℃烘箱內，烘干至前后兩次稱質量不變，計算菌體干質量。

1.3.4 殺線蟲活性測定

松材線蟲由灰葡萄孢（Botrytiscinerea）培養(yǎng)保種，通過大麥仁培養(yǎng)基大量培養(yǎng)后，經過貝爾曼漏斗法收集，用無菌水清洗3次，離心分離后，用無菌蒸餾水調制成1 500條/mL的線蟲懸浮液。

取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入發(fā)酵液100 μL以及線蟲懸浮液100μL，25℃條件下保濕培養(yǎng)，每個處理重復3次，設滅菌水為空白對照（CK）。在5d后進行檢測計數，向有死蟲的孔中加入一滴1mol/L的NaOH溶液，30s內從直線狀變成彎曲狀判定為活蟲[9]，計算松材線蟲的死亡率（即殺線蟲活性）。

2 結果與分析

2.1 200 L發(fā)酵培養(yǎng)及動態(tài)分析

200 L罐發(fā)酵參數動態(tài)變化如圖1所示。由圖1可知，0～12 h菌體干質量整體呈現逐漸增加的趨勢，但菌體干質量增加較緩慢，處于適應新的發(fā)酵環(huán)境的延遲期；12～28 h菌體快速生長，干質量大幅增加，表現出對數生長期的特點；28～40 h為穩(wěn)定期，菌體干質量呈小幅波動變化，進入生產的收獲期。

圖1200 L罐發(fā)酵過程中動態(tài)曲線Fig.1 Dynamic curve of fermentation in 200 L fermenter

pH值整體上呈現逐漸下降的趨勢，28 h后由初始的6.46下降到2.00，之后基本維持穩(wěn)定，與生物量呈負相關。殺線蟲活性測定結果顯示，發(fā)酵24h取樣處理松材線蟲5 d，殺線蟲活性達到98%以上，且與菌體的生長呈正相關，表明活性產物的發(fā)酵類型應屬于菌體生長相關的偶聯(lián)型。

2.2 5 t發(fā)酵培養(yǎng)及動態(tài)分析

5 t罐發(fā)酵過程中各參數動態(tài)變化如圖2所示。由圖2可知，與200 L罐的生長曲線相似，菌體干質量整體呈逐漸增加的趨勢，延遲期菌體生長緩慢，生物量最高為0.647 g/L，12 h后進入對數生長期，生物量快速增加，40 h時5 t罐取樣的菌體干質量可達4.242 g/L。

圖25 t罐發(fā)酵過程中動態(tài)曲線Fig.2 Dynamic curve of fermentation in 5 t fermenter

發(fā)酵濾液的pH值同樣呈逐漸下降的趨勢，這與菌株Sr18代謝物中有機酸的生成有關[18]，發(fā)酵40 h時pH值降到1.86，此時已不適宜菌株生長和繼續(xù)生產代謝產物，因此pH值可作為發(fā)酵終止的重要參數。發(fā)酵濾液的殺線蟲活性整體上呈現逐漸增加的趨勢，發(fā)酵的前20 h發(fā)酵濾液殺線蟲活性較低，可能是受到了生物量偏低的影響。20h以后，隨著菌體生成量的增加，殺線蟲活性迅速上升，由28.27%增加至89.28%，增加了大約3倍，36 h發(fā)酵濾液的殺線蟲活性可達到100%。

2.3 5 t罐條件下溶氧量的變化及控制

發(fā)酵過程中溶氧量變化及控制參數見圖3。由圖3可知，發(fā)酵初始，轉速和空氣流量分別設置為90 r/min、80 m3/h，罐壓為0.03 MPa，此時相對溶氧量設為100%。發(fā)酵過程中，溶氧量整體呈現下降的趨勢，8 h后急劇下降，同時菌體干質量大幅增加，pH值快速降低，說明此時菌體快速生長，產生酸性代謝產物。在28 h后，溶氧量出現輕微的上升趨勢，同時pH值下降速度減緩，菌體干質量出現下降，表明菌體生長已受阻，此時降低轉速和空氣流量分別至80 r/min、65 m3/h，以減少由于攪拌對菌體造成的剪切損傷和氣泡的生成，使菌體在比較適宜的條件下繼續(xù)生長，積累代謝產物。調節(jié)轉速和空氣流量后，菌體干質量開始上升，代謝物殺線蟲活性上升，36 h時達到100%，pH值降至1.91，此時已不適合菌體生長，預示到達發(fā)酵終點。

圖35 t罐發(fā)酵過程中的參數變化Fig.3 Changes of fermentation parameters in 5 t fermenter

2.4 發(fā)酵濾液殺線蟲活性的比較

發(fā)酵終止后，取不同濃度發(fā)酵濾液處理松材線蟲5 d的殺線蟲活性結果見圖4。由圖4可知，200L罐和5t罐的發(fā)酵濾液原液和1倍稀釋液（1/2原液）殺線蟲活性均達到100%，當發(fā)酵濾液稀釋至1/4原液濃度后，200 L罐的殺線蟲活性為85.70%，而5 t罐的殺線蟲活性為88.71%，對松材線蟲的致死效果較好，表明實驗設定的參數和對溶氧的控制對5 t罐的發(fā)酵是適用而有效的。

圖4 發(fā)酵濾液的殺線蟲活性Fig.4 Nematicidal activity of fermentation broth

3 結論

研究結果表明，菌株Sr18代謝物殺線蟲活性隨菌體的生長逐漸增加，表明活性產物的生成與菌體的生長呈正相關，菌株Sr18活性代謝物的發(fā)酵應屬于偶聯(lián)型（I型）發(fā)酵。菌株Sr18殺線蟲代謝物200 L罐的發(fā)酵工藝參數為：發(fā)酵溫度26℃，罐壓0.05～0.12 MPa，空氣流量4～9 m3/h，攪拌速度120～198 r/min，pH自然，發(fā)酵終止時間48 h，在此發(fā)酵條件下，菌株Sr18代謝產物的殺線蟲活性較高，3倍稀釋液的殺線蟲活性仍達85%以上；5 t罐的發(fā)酵工藝參數為：發(fā)酵溫度26℃，罐壓0.03 MPa，空氣流量65～80 m3/h，攪拌速度75～90 r/min，pH自然，發(fā)酵終止時間40 h，在此發(fā)酵條件下，發(fā)酵36 h時代謝產物的殺線蟲活性即達到100%，發(fā)酵終止后，發(fā)酵液稀釋至1/4原液濃度的殺線蟲活性仍能達到88.71%，顯示出良好的殺線蟲活性。菌株Sr18的規(guī)模發(fā)酵研究為今后投入規(guī)?；a應用奠定了基礎。

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Scale-up fermentation and nematocidal efficiency of nematicidal metabolites by strain Sr18

WANG Yaping1,WANG Xiuqing1,SUN Jianhua1,2,FENG Xin1,2,MENG Qingheng1,2*
(1.College of Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China; 2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,Tianjin 300387,China)

Using the nematocidal activity as evaluation index,on the basis of 5 L and 30 L fermentation research,the strain Sr18(Syncephalastrum racemosum)was cultured in the scale of 200 L and 5 t fermenter.The results showed that the fermentation conditions of 200 L fermenter was as follows:inoculum 4%,fermentation temperature 26℃,vessel pressure 0.05-0.12 MPa,air flow rate 4-9 m3/h,rotational speed 120-198 r/min and fermentation cycle 48 h.The fermentation conditions in the scale of 5 t fermenter was as follows:inoculum 4%,fermentation temperature 26℃, tank pressure 0.03 MPa,air flow rate 65-80 m3/h,rotational speed 80-90 r/min and fermentation cycle 40 h.Under the fermentation conditions,the nematicidal activity of one time diluted fermentation broth could reach 100%,which indicated that the fermentation parameters were suitable and controllable.

strain Sr18;nematicidal metabolites;scale fermentation;nematicidal activity

Q939.9；S435.6

0254-5071（2017）04-0054-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.012

2017-01-01

國家自然科學基金（31272019）

王亞萍（1990-），女，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵和植物抗性。

*通訊作者：孟慶恒（1963-），男，副教授，碩士，研究方向為應用微生物。