黎 星，霍 聰，劉 艷，許 榮，夏躍勝，賈 新，王曉明

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科，西安 710032)

大量研究表明心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷、擴(kuò)張型心肌病、糖尿病心肌病、心力衰竭等諸多心臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理生理過程[1-5]，因此減少心肌細(xì)胞凋亡仍是臨床治療、減緩和逆轉(zhuǎn)心臟疾病首要考慮的方法，所以尋找方便、經(jīng)濟(jì)、簡單的心肌保護(hù)藥物顯得尤為重要。

姜黃素類化合物是姜黃、莪術(shù)等傳統(tǒng)中藥植物中提取的天然成份，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等重要作用。主要成份有姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin, BDMC)。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在心肌缺血再灌注損傷和心力衰竭中能減輕心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[6,7]。但是姜黃素天然衍生物BDMC的心肌保護(hù)作用尚未被報道。因此本研究通過經(jīng)典的線粒體途徑凋亡誘導(dǎo)劑星型孢菌素(staurosporine, STS)建立細(xì)胞凋亡模型， 探討B(tài)DMC對心肌細(xì)胞凋亡的影響及在凋亡過程中與細(xì)胞存活率和細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的關(guān)系，為BDMC能夠進(jìn)入臨床使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

0～2 d的C57BL/6J小鼠乳鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)。5-溴-2-核苷尿嘧啶(BrdU；MP公司，美國)。BDMC(慕頤生物科技有限公司，上海)，二甲基亞砜(DMSO)、STS(Sigma-Aldrich公司，美國)，CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒、ROS活性檢測試劑盒(恩晶生物科技有限公司，南京)。原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)凋亡檢測試劑盒(GeneCopoeia公司，美國)。Caspase-3酶活性檢測試劑盒(Thermo公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 75%乙醇消毒小鼠乳鼠身體，取出心臟，冰PBS清洗3次。Ⅱ型膠原酶(1 g/L)消化6～7次，每次5 min。收集消化后的細(xì)胞懸液，加入新鮮培養(yǎng)液終止消化，以800轉(zhuǎn)/min離心6 min后棄上清，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，200目濾網(wǎng)過濾后接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2差速貼壁1 h除去成纖維細(xì)胞。將含10%胎牛血清的DMEM與10 mmol/L的BrdU以1∶100的比例混合加入細(xì)胞，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，然后繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞同步搏動待用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分4組：對照組、STS組、BDMC預(yù)處理+STS組和 BDMC組。對照組：采用單純培養(yǎng)液，不給予任何藥物；STS組：培養(yǎng)液中加入終濃度為 4 μmol/L 的STS； BDMC 預(yù)處理+STS組：培養(yǎng)液中加入終濃度為100 μmol/L的BDMC預(yù)處理1 h，再加入終濃度為4 μmol/L的STS；BDMC 組：培養(yǎng)液中單獨(dú)加入終濃度為 100 μmol/L的BDMC。

1.2.4 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種至放有蓋玻片的24孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞搏動后按照分組加藥處理6 h，吸棄培養(yǎng)液，加入4%的多聚甲醛 500 μl，4℃孵育30 min，冷PBS清洗3次，每次5 min。吸棄PBS，用含0.2%TritonX-100的PBS進(jìn)行通透處理，室溫孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min。每孔加100 μl TdT反應(yīng)液，使其全部覆蓋待測樣本，室溫孵育10 min。按說明配制TdT反應(yīng)混合液，棄TdT反應(yīng)緩沖液，每個樣本滴加50 μl TdT反應(yīng)混合液，置于密閉濕盒內(nèi)，37℃孵育60 min，含3%BSA的PBS清洗3次，每次5 min。吸棄PBS，100 μl Andy FluorTM488-Streptavidin染色液覆蓋每個樣本，室溫孵育30 min后，3%BSA-PBS清洗3次，每次5 min。10 mg/L DAPI染核10 min，PBS清洗3次，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照，每組隨機(jī)選5個視野計(jì)算凋亡比例。

1.2.5 Caspase-3酶活性檢測 將細(xì)胞接種至 96孔板，按照試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)體系，每組設(shè)10個副孔。每孔細(xì)胞加入25 μl裂解液(每106個細(xì)胞加入50 μl裂解液)，于-80℃冰箱反復(fù)凍融3次，每次5 min。按照說明書配制caspase-3底物反應(yīng)混合液，每孔加入25 μl混勻，37℃孵育60 min。采用342 nm/441 nm波長檢測各孔熒光值，其熒光強(qiáng)度與caspase-3活性成正比。

1.2.6 心肌細(xì)胞內(nèi)ROS檢測 將細(xì)胞接種至 96孔板,每組設(shè)8個副孔。BDMC預(yù)處理組加入BDMC預(yù)處理1 h后加入STS，培養(yǎng)7 h，余各組加藥后培養(yǎng)相同時間。按照ROS檢測試劑盒加入ROS熒光探針，使其終濃度為10 μmol/L，孵箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h。使用全波長酶標(biāo)儀500 nm/530 nm檢測各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平，其含量與熒光強(qiáng)度成正比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 BDMC對STS處理后原代心肌細(xì)胞生存率的影響

相比對照組，STS組和STS+BDMC組的心肌細(xì)胞生存率降低(P<0.05)。BDMC組的心肌細(xì)胞生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相比STS組，BDMC預(yù)處理+STS組的心肌細(xì)胞生存率明顯升高(P<0.05，圖1)。

圖1 心肌細(xì)胞存活率比較Figure 1 Comparison of survival rate of cardiomyocytes

2.2 BDMC能抑制STS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

相比對照組，STS組和TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖2)。隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率。相比STS組，BDMC預(yù)處理+STS組TUNEL陽性的凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量顯著下降(P<0.05，圖3)。

2.3 BDMC預(yù)處理能降低STS處理后的心肌細(xì)胞caspase-3活性

相比對照組，STS組和BDCM預(yù)處理+STS組caspase-3酶活性顯著增加(P<0.05，圖4)。相比STS組，BDMC預(yù)處理+STS組caspase-3酶活性降低(P<0.05，圖4)。

2.4 BDMC預(yù)處理對STS處理后的心肌細(xì)胞ROS水平的影響

相比對照組，STS組和BDMC預(yù)處理+STS組的ROS水平增高(P<0.05，圖5)。相比STS組，BDMC預(yù)處理+STS組ROS水平下降(P<0.05，圖5)。

3 討 論

姜黃素類化合物是傳統(tǒng)中藥姜黃的主要成分，其主要成分姜黃素在心肌梗死后能減輕心肌缺血再灌注損傷，改善心臟功能[8]，減弱心肌梗死后心肌纖維化[9]。同樣能減輕糖尿病性心肌損傷[10]。但其易被氧化， 對光穩(wěn)定性差。 而另一種天然單體成分BDMC，在體內(nèi)生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性強(qiáng)于姜黃素[11]。研究表明BDMC能抑制血小板衍生生長因子誘導(dǎo)的血管平滑肌遷移和增殖[12]。攝食BDMC能抑制脂肪細(xì)胞形成，改善高脂飲食導(dǎo)致的C57小鼠肥胖[13]。而且BDMC預(yù)處理會減輕叔丁基過氧化氫造成的細(xì)胞老化[14]。BDMC兼有姜黃素類化合物對心血管疾病的治療及保護(hù)作用，又有穩(wěn)定的藥理學(xué)特性，本研究探討了它的抗心肌凋亡作用和可能的機(jī)制。

圖2 BDMC預(yù)處理對STS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of BDMC pretreatment on the myocardial apoptosis induced by STS (TUNEL staining ×200)

圖3 TUNEL陽性凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量比較Figure 3 Comparison of TUNEL positive myocardial

圖4 Caspase-3酶活性比較Figure 4 Comparison of caspase-3 activity

圖5 心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較Figure 5 Comparison of ROS level in the cardiomyocytes

STS是已知經(jīng)典的線粒體途徑凋亡誘導(dǎo)劑。本研究應(yīng)用課題組前期已構(gòu)建的、成熟的 STS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型[15]，給予100 μmol/L BDMC預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)BDMC能夠顯著提高STS刺激后的細(xì)胞生存率。TUNEL染色及caspase-3活性檢測結(jié)果均顯示，BDMC可以抑制STS誘導(dǎo)的心肌凋亡性死亡的發(fā)生；為探討可能的機(jī)制，我們檢測了對細(xì)胞損傷最重要的損傷因子，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激ROS的水平，結(jié)果顯示STS刺激心肌細(xì)胞后，胞內(nèi)ROS水平增加，而給予BDMC預(yù)處理后心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加受到明顯抑制。該結(jié)果與其他研究報道結(jié)果相一致，即無論是姜黃素還是BDMC都具有很好的抗氧化作用，能減輕細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平[16，17]。綜上所述，我們首次觀察到BDMC預(yù)處理心肌細(xì)胞能夠顯著減少STS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平，明顯抑制凋亡瀑布信號執(zhí)行者caspase-3酶的活性，抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而達(dá)到保護(hù)受損心肌細(xì)胞的作用，該研究結(jié)果為臨床新藥開發(fā)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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