馬文典，張 坤，王 弘，李 雪，郝良純

急性免疫性血小板減少癥患兒NK細(xì)胞、NK樣T細(xì)胞數(shù)量變化及槐杞黃聯(lián)合糖皮質(zhì)激素療效探討

馬文典，張 坤，王 弘*，李 雪，郝良純

目的 探討NK樣T細(xì)胞及NK細(xì)胞數(shù)量變化對(duì)兒童急性免疫性血小板癥(ITP)發(fā)病的影響，觀察槐杞黃口服聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對(duì)兒童ITP療效的影響。方法 采用前瞻性對(duì)照研究的方法，收集2016年1-12月于我科確診并住院治療的70例ITP患兒及門診健康體檢的30例正常兒童資料，均在未接受任何治療時(shí)采集外周血，檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群、NK樣T細(xì)胞數(shù)值并進(jìn)行分析比較。將70例ITP患兒隨機(jī)分成觀察組和對(duì)照組，每組35例。實(shí)驗(yàn)組在常規(guī)的糖皮質(zhì)激素治療方法基礎(chǔ)上加用槐杞黃口服，對(duì)照組則僅為激素方法治療。治療期間觀察兩組患兒臨床情況，定期于清晨空腹采血，記錄血小板計(jì)數(shù)，同時(shí)采用流式細(xì)胞儀技術(shù)，檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群、NK樣T細(xì)胞的表達(dá)率。結(jié)果 ITP兒童外周血中NK細(xì)胞(6.2%±1.37%)、NK樣T細(xì)胞的數(shù)量(0.98%±0.41%)較健康兒童(15.92%±3.84 %,3.56%±0.78 %)明顯下降，總B細(xì)胞數(shù)量則明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組的有效率為94.3 %，顯著高于對(duì)照組的85.7 %，平均住院治療時(shí)間縮短；治療后，ITP患兒外周血NK細(xì)胞、NK樣T細(xì)胞的表達(dá)率均顯著升高(P<0.05)；治療期間觀察組血小板計(jì)數(shù)恢復(fù)正常范圍及NK細(xì)胞和NK樣T細(xì)胞數(shù)量上升較對(duì)照組明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 NK細(xì)胞及NK樣T細(xì)胞數(shù)量下降可能與兒童ITP發(fā)病相關(guān)，槐杞黃聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療兒童ITP，可能通過(guò)改善免疫功能紊亂，提升NK細(xì)胞、NK樣T細(xì)胞數(shù)量，加快血小板計(jì)數(shù)的恢復(fù)，進(jìn)而縮短療程。

免疫性血小板減少癥；槐杞黃；NK細(xì)胞；NK樣T細(xì)胞

0 引言

免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia,ITP)是兒童中最常見的獲得性自身免疫性出血性疾病，由于機(jī)體免疫系統(tǒng)功能紊亂造成血小板破壞增加、數(shù)目減少，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚黏膜、內(nèi)臟出血。1～6歲為小兒高發(fā)年齡段，發(fā)病率為小兒群體的4/10萬(wàn)～6/10萬(wàn)，該時(shí)期兒童免疫系統(tǒng)功能仍未建全，處于不斷完善的過(guò)程[1]。體液免疫、細(xì)胞免疫在ITP的發(fā)病中具有重要作用，然而其詳細(xì)機(jī)制尚不明確，有待于不斷深入探索研究。近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞、NK樣T細(xì)胞在人體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中起著重要作用，其數(shù)量的改變通常會(huì)造成機(jī)體免疫機(jī)制的紊亂，在成人中已得到廣泛研究[2]，并且極可能參與了兒童ITP的發(fā)生。與此同時(shí)，糖皮質(zhì)激素聯(lián)合調(diào)節(jié)免疫機(jī)制藥物治療兒童ITP也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本研究旨在探究在兒童ITP發(fā)病及治療過(guò)程中NK細(xì)胞、NK樣T細(xì)胞、總B細(xì)胞數(shù)量的變化及作用，進(jìn)一步觀察槐杞黃聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對(duì)ITP患兒療效的影響。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 2016年1-10月于我院兒科門診體檢的健康兒童30例，男15例，女15例，年齡2～8歲，平均年齡(5.3±2.1)歲，同時(shí)收集相同年齡段在血液病房確診并住院治療的ITP患兒70例，男32例，女38例，平均年齡(5.3±2.7)歲，納入兒童均符合2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，并符合采用一線藥物糖皮質(zhì)激素治療的患兒，除外血小板計(jì)數(shù)<20×109/L及有大量活動(dòng)性出血需立即輸注血小板或應(yīng)用丙球的患兒。所有患兒均在未予任何相關(guān)治療前采集外周血送檢。同時(shí)，將參與研究的患兒隨機(jī)分成觀察組和對(duì)照組，每組35例。觀察組男16例，女19例，平均年齡(5.4±2.2)歲；對(duì)照組男17例，女18例，平均年齡(5.2±2.1)歲，兩組患兒一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治療 兩組患兒均按一線的ITP治療方案即糖皮質(zhì)激素治療，甲潑尼龍琥珀酸鈉2～3 mg/(kg·d)靜脈點(diǎn)滴，激素在病情好轉(zhuǎn)時(shí)，按常規(guī)予以減量停用，觀察組在此基礎(chǔ)上，同時(shí)加用槐杞黃口服(國(guó)藥準(zhǔn)字B200020074，啟動(dòng)蓋天力藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，2～3歲，5 g/次，2次/d；3～8歲，10 g/次，2次/d，總療程2個(gè)月。

1.2.2 淋巴細(xì)胞亞群及NK樣T細(xì)胞測(cè)定 ①標(biāo)本采集：70例ITP患兒在治療前、出院時(shí)、出院后1周、出院后2周，于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周血2 mL,EDTA抗凝。門診健康體檢兒童分別于體檢當(dāng)天清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集標(biāo)本。②儀器與試劑：FACS Calibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2.3 療效觀察 顯效：血小板恢復(fù)正常，無(wú)出血癥狀，持續(xù)2個(gè)月以上；良好：血小板升至100×109/L以上或較原水平上升40×109/L，無(wú)或基本無(wú)出血癥狀，持續(xù)2個(gè)月以上；好轉(zhuǎn)：血小板有所回升，出血有改善，持續(xù)2周以上；無(wú)效：血小板計(jì)數(shù)及出血均無(wú)改善或惡化。有效率=(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)。記錄入院治療時(shí)間，2個(gè)月內(nèi)因ITP多次入院，治療時(shí)間累加。

2 結(jié)果

2.1 ITP患兒與健康兒童外周血淋巴細(xì)胞亞群的比較 治療前,70例ITP患兒外周血中NK細(xì)胞的平均數(shù)量為6.2%±1.37%、NK樣T細(xì)胞的平均數(shù)量為0.98%±0.41%，明顯低于30例健康體檢兒童(P<0.05)。同時(shí)，ITP患兒外周血中總B細(xì)胞平均數(shù)量較健康兒童明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而總T細(xì)胞數(shù)量及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 ITP患兒與健康兒童外周血淋巴細(xì)胞亞 群水平測(cè)定(%)

2.2 兩組療效比較 觀察組總有效率、顯效率明顯高于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，觀察組患兒血小板計(jì)數(shù)回升較迅速，出血點(diǎn)消失較快，入院治療時(shí)間較短。見表2。

2.3 兩組NK細(xì)胞、NK樣細(xì)胞在治療過(guò)程中的變化 隨著治療過(guò)程的進(jìn)展，大部分ITP患兒的NK細(xì)胞數(shù)量及NK樣細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但平均恢復(fù)至正常區(qū)間的時(shí)間遲于患兒出院時(shí)間；同時(shí)，觀察組患兒NK細(xì)胞及NK樣T細(xì)胞數(shù)量上升至正常區(qū)間的例數(shù)較對(duì)照組多，并且總體的上升幅度大，速度快，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、表4。

表2 兩組治療效果比較

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05

表3 兩組CD3-/CD(16+56+) NK細(xì)胞變化情況(%)

表4 CD3+/CD(16+56+)NK樣T細(xì)胞變化(%)

3 討論

ITP作為兒童最常見的出血性疾病之一，以不明原因出現(xiàn)皮膚黏膜出血癥狀伴血小板減少為主要表現(xiàn)。近年來(lái)對(duì)于免疫失調(diào)介導(dǎo)其發(fā)病機(jī)制的研究已成為熱門，然而既往研究大部分集中于T、B淋巴細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子和免疫球蛋白等特異性免疫機(jī)制參與者，關(guān)于NK細(xì)胞、NK樣T細(xì)胞這類非特異性免疫殺傷細(xì)胞數(shù)量的改變對(duì)于ITP發(fā)病及療效影響的研究較少。

NK細(xì)胞是與T、B淋巴細(xì)胞并列的第3類淋巴細(xì)胞，臨床將TCR-、mIg-、CD16+、CD56+即CD3-/CD(16+56+)淋巴樣細(xì)胞鑒定為NK細(xì)胞，是人體固有免疫系統(tǒng)中重要組成部分，其不需要抗原預(yù)先致敏即可殺傷腫瘤細(xì)胞、病毒或寄生菌感染的細(xì)胞，活化后還可分泌一些抗感染及免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，如干擾素(INF-γ)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等，而有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是健康兒童與ITP患兒最有益的變量[4-5]。范秋霞等[6]通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞表達(dá)下降與ITP發(fā)病存在一定關(guān)系。推測(cè)NK細(xì)胞減少或活性降低后，失去抑制B淋巴細(xì)胞增殖分化的能力，導(dǎo)致大量B細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量抗血小板抗體，血小板被大量破壞，進(jìn)而導(dǎo)致ITP發(fā)生。可見，NK細(xì)胞是人體內(nèi)一種重要的免疫細(xì)胞，其數(shù)量的下降可直接導(dǎo)致固有免疫殺傷，且清除相關(guān)病原微生物感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的能力下降，間接導(dǎo)致調(diào)節(jié)特異性免疫功能的因子分泌減少，造成免疫功能失調(diào)，大量血小板破壞消耗，從而介導(dǎo)小兒ITP的發(fā)生。本研究的結(jié)果為這一猜測(cè)提供了有利證據(jù)，表明NK細(xì)胞數(shù)量下降與ITP的發(fā)生密切相關(guān)，在治療過(guò)程中下降的NK細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)回升的趨勢(shì)，與療效呈正相關(guān)。

NK樣T細(xì)胞既表達(dá)T細(xì)胞表型，也表達(dá)NK細(xì)胞表型，即CD3+/CD16+CD56+的一類細(xì)胞。區(qū)別于一般T細(xì)胞，其TCR不與MHC分子組成復(fù)合物，而是特異性識(shí)別抗原提呈細(xì)胞表面CD1d分子遞呈的糖脂類抗原，三者形成復(fù)合體后，可促使NK樣T細(xì)胞迅速活化，直接清除體內(nèi)病毒、細(xì)菌感染的異常細(xì)胞，同時(shí)可間接通過(guò)分泌大量細(xì)胞因子如INF-γ等，增強(qiáng)Th1細(xì)胞活性，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，相反，對(duì)Th2細(xì)胞增殖具有抑制作用則抑制體液免疫功能[7-8]。在成人慢性免疫性血小板減少癥的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，NK樣T細(xì)胞數(shù)量的改變與ITP的發(fā)生有著密切的聯(lián)系[9]。本研究中，ITP患兒外周血中NK樣T細(xì)胞數(shù)量較正常兒童明顯下降，故推測(cè)當(dāng)機(jī)體內(nèi)存在病毒、細(xì)菌感染時(shí)，由于NK樣T細(xì)胞數(shù)量的減少，不能及時(shí)清除病原體，調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞因子分泌不足，長(zhǎng)時(shí)間致使機(jī)體特異性免疫機(jī)制紊亂，即細(xì)胞免疫功能不足、體液免疫功能亢進(jìn)，異常B細(xì)胞不但得不到有效清除，反而大量增殖分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量抗血小板抗體，同時(shí)，活化增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，大量血小板被破壞，發(fā)生ITP。

槐杞黃顆粒作為免疫調(diào)節(jié)劑在小兒臨床相關(guān)治療中廣為應(yīng)用，主要成分為槐耳菌質(zhì)、枸杞子、黃精，其君藥槐耳菌質(zhì)中含有多種氨基酸和微量元素，有激活NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞增殖及成熟分化，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞平衡的作用[10-11]。有研究表明，槐杞黃對(duì)兒童過(guò)敏性紫癜Th17/Treg失衡具有一定調(diào)節(jié)作用[12]。同時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生小劑量、多刺激與聯(lián)合作用的內(nèi)源性細(xì)胞因子，增強(qiáng)體液免疫。臣藥枸杞子可促進(jìn)免疫細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)免疫功能；黃精可增加白細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)機(jī)體對(duì)病原微生物的及時(shí)清除，可大大改善機(jī)體的固有免疫功能[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，加用槐杞黃顆粒口服的ITP患兒與常規(guī)治療的ITP兒童相比，臨床癥狀消失快，血小板計(jì)數(shù)恢復(fù)正常迅速并能維持在較高水平，NK細(xì)胞及NK樣T細(xì)胞數(shù)量上升幅度大，趨于平衡所用的時(shí)間短，證明其對(duì)于兒童可通過(guò)提升機(jī)體NK細(xì)胞、NK樣T細(xì)胞數(shù)量來(lái)增強(qiáng)并平衡固有免疫、細(xì)胞免疫、體液免疫功能，進(jìn)而輔助治療兒童ITP。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，固有免疫細(xì)胞中的NK細(xì)胞及NK樣T細(xì)胞數(shù)量的改變與ITP的發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后有著極為重要的聯(lián)系。在ITP糖皮質(zhì)激素治療方法上聯(lián)合槐杞黃顆粒，可明顯提高外周血血小板計(jì)數(shù)，加快機(jī)體NK細(xì)胞及NK樣T 細(xì)胞數(shù)量上升，促進(jìn)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能趨于穩(wěn)態(tài)平衡，改善療效，縮短療程。

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Quantitative changes of NK and NK-like T cells in children with acute immune thrombocytopenia and the effect of Huaiqihuang oral combined with glucocorticoid

MA Wen-dian,ZHANG Kun,WANG Hong*,LI Xue,HAO Liang-chun

(Hematology Treatment Center，Pediatric Hematology Department,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110022,China)

Objective To investigate the effect of the quantity of NK-like T cells and NK cells on the pathogenesis of acute immune platelet disease (ITP) in children,and to observe the effect of Huaiqihuang oral combined with glucocorticoid on ITP in children.Methods A prospective,controlled study was conducted to collect data on 70 children with ITP and 30 healthy children from January to December 2016 who were diagnosed and hospitalized in our department.All patients received peripheral blood tests without any treatment.Lymphocyte subsets,NK-like T cells and statistical analysis were compared.The 70 ITP children were randomly divided into experiment group and control group,35 cases in each group.In experiment group,oral administration of Huaiqihuang was added on the basis of routine glucocorticoid therapy,while control group was only treated by hormone therapy.During the treatment,the clinical condition of the two groups was observed.Blood samples were collected in the morning fasting.Platelet count was recorded.The expression of lymphocyte subsets and NK-like T cells was detected by flow cytometry.Results The number of NK cells (6.2%±1.37%) and NK-like T cells (0.98%±0.41%) in ITP children was significantly lower than that in healthy children (15.92%±3.84%,3.56%±0.78%) and the total number of B cells was higher.The difference was statistically significant (P<0.05);the effective rate in observation group was significantly higher than that of control group (94.3% vs.85.7%,P<0.05);the average hospitalization time was shortened (P<0.05).After treatment,the platelet count returned to the normal range and the number of NK cells and NK-like T cells increased in observation group during the treatment period,compared with control group,the difference being significant (P<0.05).Conclusion NK cells and NK-like T cells may be related to the incidence of ITP in children.The combination treatment of Huaiqihuang and glucocorticoid for children with ITP may improve the number of NK cells and NK-like T cells and improve the recovery of platelet count by improving immune function,which thus shorten the course of treatment.

Immune thrombocytopenia;Huaiqihuang;NK cells;NK-like T cells

2017-01-06

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液病治療中心 小兒血液科,沈陽(yáng) 110022

國(guó)家自然科學(xué)基金(81101528);遼寧省自然科學(xué)基金(2015020542)

10.14053/j.cnki.ppcr.201704006

*通信作者