李天慈，方愛莉，韓沖芳，楊文曲，賀建東

（1.山西醫(yī)科大學麻醉學系，山西 太原 030032；2.山西醫(yī)學科學院?山西大醫(yī)院麻醉科，山西 太原 030032）

布比卡因對于大腸癌細胞的體外抑制作用

李天慈1，方愛莉2，韓沖芳2*，楊文曲2，賀建東2

（1.山西醫(yī)科大學麻醉學系，山西 太原 030032；2.山西醫(yī)學科學院?山西大醫(yī)院麻醉科，山西 太原 030032）

目的探討局麻藥布比卡因對大腸癌細胞的體外抑制作用。方法體外培養(yǎng)人結腸癌細胞Caco2，隨機分為不做處理的空白組（N組），經1 mM DPBS處理24 h的溶劑對照組（V組）以及經1 mM布比卡因處理24 h的實驗組（B組）。本實驗通過Ki67表達水平測定癌細胞增殖能力，通過MTT實驗檢測細胞存活率，并通過Western blot法測量凋亡蛋白caspase3以探尋局麻藥是否可以在體外培養(yǎng)條件下對癌細胞活性起直接抑制作用。結果在大腸癌細胞中，1mM布比卡因對癌細胞的增殖抑制作用顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但并未引發(fā)癌細胞的凋亡。結論實驗數據表明布比卡因不利于大腸腺癌細胞存活。然而基于體外細胞培養(yǎng)的特殊性，此抑制作用需要更多相關的在體實驗和臨床實驗去驗證。

局麻藥；大腸癌

癌癥作為世界最致命的疾病之一，在2012年造成全球820萬人死亡，預計2025年將有1930萬新增病例（世界衛(wèi)生組織，2015）。然而因腫瘤的具體發(fā)病機制仍未完全揭示，目前病灶切除術輔以放化療仍然是大多數惡性腫瘤的常規(guī)療法。因此，圍手術期管理對癌癥患者預后的影響已成為一個熱門的研究課題。值得注意的是，一些臨床回顧性數據表明，在手術期間聯(lián)合應用局麻劑與較低水平的癌癥復發(fā)和轉移率相關[1]。因此，進一步研究局麻藥對癌細胞的作用是必要的。

本研究旨在探討廣泛使用的酰胺類局麻藥布比卡因對結腸癌細胞的影響，以研究酰胺類局麻藥能否在體外培養(yǎng)環(huán)境直接抑制癌細胞。

1 資料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人大腸腺癌細胞系Caco2購自Public Health England（Salisbury，UK）。用于本研究的培養(yǎng)液為RPMI 1640（L-Glu+，Life Technologies，Paisley，UK），其中混合10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum）（Fischer Scientific，Leicestershire，UK）和1%青霉素-鏈霉素（Sigma-Aldrich，Dorset，UK）。在McCoy's 5A Medium Modified（Sigma-Aldrich）培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）細胞在加15 mL制備培養(yǎng)液的T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并至少每兩天更換一次培養(yǎng)液。從培養(yǎng)瓶底部分離細胞時使用5ml 0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mM EDTA /瓶，經5 min消化后離心10 min，細胞板重懸于30 mL培養(yǎng)基中以在培養(yǎng)瓶中種植（接種密度為5×104個活細胞/cm2）。

1.1.1 培養(yǎng)皿中的細胞接種

在60 mm培養(yǎng)皿和96孔板中，細胞通過細胞計數器分別按0.8×106/3 mL和5×104/200 μ的密度在培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.1.2 藥物處理

用制備培養(yǎng)液稀釋布比卡因鹽酸鹽等滲溶液（Marcaine，0.5%w / v，AstraZeneca，Luton，UK）到1 mM，而DPBS（Modified 1×，Thermo Scientific，Utah，USA）與載體以和實驗組相同的比例加入培養(yǎng)液中。當細胞生長面積達90%時給予藥物處理24 h。

1.2 方法

1.2.1 MTT法

將細胞植于96孔板中培養(yǎng)過夜，各處理組取5個樣孔，每孔加入5 mg/mL的噻唑藍（MTT）（Thermo Scientifc）培養(yǎng)3 h后加入100 μL二甲基亞砜并在室溫下避光放置2 h。充分振蕩后將孔板置于酶聯(lián)免疫檢測儀上570 nm處各樣孔的吸光度（OD值）。各孔內細胞存活率為OD值與空白組OD值的比值。

1.2.2 免疫熒光

通過對Ki67免疫染色測定細胞增殖率。將多鳥氨酸包被的玻璃蓋玻片置于培養(yǎng)皿中以利細胞附著。將細胞固定洗后將蓋玻片轉移至24孔板，并在室溫下用3%驢血清（Millipore，UK）封閉1 h。隨后將細胞在含有Ki67初級抗體（1：200，鼠多克隆抗體；DakoCytomation，Produktionsvej，Denmark）的PBST中4℃培育過夜。第二天洗滌后避光敷二抗（200μl/孔，1：200，IgG，Florence；Millipore）1 h。洗滌后滴加DAPI放置到載玻片上。在Nikon E1000M（Nikon，Surrey，UK）熒光顯微鏡下以20×物鏡觀察細胞。用相同的曝光設置拍攝圖像。

1.2.3 Western blot法

使用Western blot法檢測caspase3的相對表達量。處理或對照24 h后，細胞由裂解液分解脂質膜。將細胞培養(yǎng)皿置于冰上半小時后離心10 min將蛋白上清液移至新管中，用Bradford（Bio-Rad laboratories，Hercules， CA，USA）蛋白定量測算50 μg蛋白質/組的樣本體積。以3：1的比例混合樣品和SDS樣品緩沖液（Invitrogen）后95℃振動10 min。室溫下離心3 min后將樣品與5 μg、Sharp上樣液一起注入NuPAGE4～12%Bis-Tris預制凝膠（Thermo Scientific，UK）并以200 V電泳50 min。后用蒸餾水漂洗凝膠并轉移到PVDF膜上以甲醇固定，以脫脂乳封閉1 h。使用初級抗體caspase3 p17 （H-60）（3：1000；兔多克隆抗體；Santa Cruz Biotechnology，UK）標定膜。第二天洗膜后在室溫下孵育二抗1 h。用TBST洗滌后，通過增強化學發(fā)光（ECL）系統(tǒng)（Santa Cruz，Dallas，TX，USA）和Syngene GeneSnap軟件（Syngene，Cambridge，UK）成像。本實驗使用GAPDH作為內參，用ImageJ評估蛋白質條帶的灰度強度。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數據進行統(tǒng)計分析，計量資料以“s”表示，采用t檢驗；計數資料采用x2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

本實驗通過有絲分裂標記物Ki-67蛋白質進行免疫染色以檢測增殖狀態(tài)，B組Ki-67陽性比率顯著低于N組和V組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MTT實驗和Western blot實驗中，應用1 mM布比卡因24 h并未引起細胞顯著凋亡或壞死以及凋亡蛋白caspase3的表達變化，見表1。

表1 三組Caco2細胞增殖陽性率、存活率和凋亡蛋白表達的比較（n=3，s）

表1 三組Caco2細胞增殖陽性率、存活率和凋亡蛋白表達的比較（n=3，s）

注：與N組相比，ap＜0.05

組別 增殖陽性率 細胞存活率 凋亡蛋白表達N組 92.33±6.74 98.22±1.11 1.06±0.35 V組 98.66±1.17 97.56±2.00 1.24±0.52 B組 54.93±7.64a96.25±2.79 1.35±0.43

3 討 論

根據以上結果，1 mM布比卡因處理24 h在Caco2細胞系中可顯著引起細胞周期停滯而不能誘發(fā)細胞凋亡。

噻唑藍可被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶水解為藍紫色結晶甲瓚并被二甲基亞砜溶解，而該反應不會出現在凋亡或壞死的細胞中。因此通過對此化學物質的吸光值檢測可間接反應細胞活性?；诎┘毎陨碓隗w外培養(yǎng)條件下的存活狀態(tài)，對照組/實驗組與空白組的比值可以較為準確地反應出藥物處理對細胞活性的影響。

Western blot實驗此處用于檢測大腸癌細胞中凋亡蛋白caspase3在布比卡因處理后的表達水平。Caspase3屬于蛋白水解酶家族并以前體形式存在于胞漿中。當細胞遭遇外界損傷引發(fā)胞內caspase家族級聯(lián)反應時，caspase3作為下游執(zhí)行蛋白，在前體被水解為活性形式后可誘發(fā)細胞凋亡。本實驗通過檢測caspase3裂解后活性形態(tài)表達量以探尋布比卡因能否抑制癌細胞的活性。

作為細胞增殖的必要蛋白，核蛋白Ki67廣泛存在于間期細胞中。Ki67蛋白質僅存在于處于G1-M細胞周期的細胞中，而不存在于靜息或損傷的細胞中，對于靜息細胞和受損細胞，細胞核中Ki67消失。增殖是癌癥進展和惡性腫瘤的另一個重要因素并與許多復雜的細胞通路相關聯(lián)，如NF-γB通路和PI3K/Akt/mTOR通路[2]。在本研究中，在1 mM布比卡因處理24 h后，Ki67+細胞的百分比在Caco2細胞中顯著降低，這意味著局麻藥可誘導細胞周期停滯。此外已有實驗證實酰胺類局麻藥羅哌卡因和布比卡因具有對結腸腺癌細胞的體外抑制作用[3]。

復合麻醉中局麻藥的使用可以減弱機體免疫抑制，特別是對自然殺傷細胞有活性恢復作用[4]。同時，進一步研究指出酰胺類局麻藥本身對癌細胞具直接抑制作用[5]。其機制包括通過阻斷電壓門控Na+通道而抑制MAPK轉錄途徑降低結腸癌細胞的侵襲力[6]。此外，酰胺類局麻藥還可以通過TNF-α誘導的Src激活和細胞間粘附分子-1磷酸化來抑制肺癌細胞的轉移，這兩者都不依賴于鈉通道阻滯劑的特性[7]。然而，關于這類抑制作用的特定分子機制仍然需要更多的研究。

本實驗結果顯示布比卡因可對結腸癌細胞的增殖能力發(fā)揮直接抑制作用而不能誘發(fā)顯著凋亡。由于局麻藥的不同應用方法會導致較大的血漿濃度跨度，因而此結論還需要進行更多的時間和濃度相關性在體實驗和臨床研究去驗證。

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本文編輯：趙小龍

R735.3+4

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ISSN.2095-8242.2017.003.547.02

韓沖芳，E-mail：hanchongfang2003@foxmail.com