何天友+瞿印權(quán)+徐雯+陳凌艷+榮俊冬+鄭郁善

摘 要：目的：建立并優(yōu)化澤瀉反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，篩選出多態(tài)性、重復(fù)性較好的ISSR引物，為澤瀉種源鑒別以及指紋圖譜的構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)。方法：利用單因素試驗(yàn)法，對(duì)Mg2+濃度、dNTPs濃度、TaqDNA聚合酶濃度、引物濃度及模板DNA含量這5個(gè)PCR反應(yīng)體系主要成分以及退火溫度進(jìn)行篩選，并利用建立優(yōu)化的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序?qū)σ酝鶟蔀a文獻(xiàn)報(bào)道的ISSR引物進(jìn)行篩選。結(jié)果：建立了最佳PCR反應(yīng)體系：20μL的反應(yīng)液中含2.0mmol·L-1Mg2+，0.4mmol·L-1dNTPs，1.0 U TaqDNA聚合酶，0.4mol·L-1引物，10ng模板DNA，2μL 10xBuffer，13.1 μL dd H2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s。58.9℃退火45s，72℃延伸90s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。結(jié)論：利用優(yōu)化的澤瀉的反應(yīng)體系，篩選出15條多態(tài)性較好的引物，并對(duì)澤瀉的21個(gè)種源進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的條帶清晰、多態(tài)性較高，證實(shí)了該體系具有較高穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和適用性。此體系也為澤瀉種源間的遺傳多樣性研究以及ISSR分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：澤瀉；ISSR；反應(yīng)體系；優(yōu)化

中圖分類號(hào) R282.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）07-0023-05

Abstract：Objectives：To establish optimized ISSR system of Alisma orientale（Samuel）Juz for selection of ISSR primers with high stability and repeatability. Methods：Applied the single factor design for optimizing five factors on ISSR amplification，such as Mg2+ concentration，dNTPs concentration，TaqDNA polymerase concentration，primer concentration and template DNA concentration.Results：The results showed that the optimal 20μL ISSR-PCR reaction system for Alisma orientale（Samuel）Juz contained 2.0mmol/L Mg2+，0.4mmol/L dNTPs，1.0 U TaqDNA polymerase，0.4mol/L primer，10ng DNA template，2μL 10xBuffer，13.1 μL ddH2O.On this optimal ISSR amplification system，15 primers were screened with good polymorphism baased on previous achievement on Alisma orientale（Samuel）Juz primers.Conclusion：15 primers with high polymorphism were effectively selected based on the optimized ISSR system.The test showed that the system was stable ，reliable and applicative. The optimal ISSR-PCR reaction system is suitable for the study of genetic diversity in plant of Alisma orientale（Samuel）Juz in different provenances.

Key words：Alisma orientale（Samuel）Juz；ISSR；Reaction system；Optimize

澤瀉[Alisma orientale（Samuel）Juz]為澤瀉科植物，在我國(guó)主要分布在福建、四川、江西等省區(qū)，生長(zhǎng)在海拔幾十米至2 500m左右的湖泊、水塘、溝渠、沼澤中[1]，具有抑制動(dòng)脈硬化、降血脂、利尿、降血壓、抗脂肪肝等作用，為地道藥材[2-3]。除了藥用外，園林上也有將澤瀉種植于淺水區(qū)供觀賞用。目前已從包括形態(tài)解剖學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域?qū)χ袊?guó)地道藥材澤瀉進(jìn)行了不少的分類研究[4]。國(guó)內(nèi)也有不少關(guān)于澤瀉類植物鑒別方面的研究，例如，胡珊梅等[5]運(yùn)用了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)RAPD技術(shù)，對(duì)不同種原的澤瀉科植物澤瀉進(jìn)行了研究，結(jié)果表明同種異地藥材所形成的不同的居群具有不同的遺傳特征。賀佳等[6]運(yùn)用了簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記ISSR技術(shù)，對(duì)四川產(chǎn)澤瀉ISSR反應(yīng)體系中各個(gè)主要影響因子進(jìn)行了優(yōu)化和篩選，并建立了最適反應(yīng)體系。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（Inter Simper Sequence Repeat，ISSR）是一種建立于PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的DNA分子標(biāo)記技術(shù).近年來(lái)，ISSR已成功用于植物遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建、分子生態(tài)學(xué)研究等領(lǐng)域[7]。本試驗(yàn)擬在澤瀉主產(chǎn)區(qū)福建、四川、廣西選擇21個(gè)不同種源的澤瀉樣品為研究材料，建立并篩選出關(guān)于澤瀉的最適ISSR-PCR反應(yīng)體系，在此基礎(chǔ)上篩選出高多態(tài)性、重復(fù)性引物，為深入研究澤瀉的種質(zhì)資源居群差異及良種選育研究提供理論支持，也為澤瀉資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)與利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 試驗(yàn)所用材料澤瀉采集于廣西、四川、廣西、福建和江西，盡量選取嫩幼、新鮮的葉片，用硅膠干燥保存，并盡快轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱，以備DNA的提取。

1.2 主要試劑與儀器 所用TaqDNA聚合酶、dNTPs Mixture、Mg2+、RNA降解酶、DNA ladder Marker、10xPCR Buffer、6xloading Buffer均購(gòu)上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；瓊脂糖、核酸染料均購(gòu)自北京賽西盛公司。引物參以往澤瀉文獻(xiàn)報(bào)道的ISSR引物，由上海生工合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA的提取與檢測(cè) 采用博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒提取的方法從澤瀉葉片上提取DNA，取2μLDNA樣品，加7μL雙蒸水，于1%的瓊脂糖凝膠上電泳，電壓100V，時(shí)間30min。紫外攝相儀觀察并攝相，看是否有一條完整清晰的DNA條帶，如出現(xiàn)多條帶或嚴(yán)重的拖尾，則表明DNA降解或斷裂，需要重新提取。最后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度、純度。

1.3.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系試驗(yàn)設(shè)計(jì) 經(jīng)過(guò)試驗(yàn)初步篩選，選用引物UBC811對(duì)澤瀉反應(yīng)體系中的Mg2+濃度、dNTPs濃度、TaqDNA聚合酶濃度、引物濃度以及模板DNA含量逐一做單因素多水平梯度試驗(yàn)，各因素水平見(jiàn)表1。

1.3.3 ISSR-PCR原初體系和擴(kuò)增程序的建立 參考有關(guān)澤瀉ISSR分析文獻(xiàn)[6]，設(shè)定的原初擴(kuò)增程序?yàn)椋悍磻?yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s。56℃退火45s，72℃延伸90s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。原初擴(kuò)增反應(yīng)體系為l0×Buffer 2μL；dNTPs：10mmol·L-1 0.4μL；引物：10μmol·L-1 0.8μL；MgCl2：25mmol·L-1 2.0μL；模板DNA：10ng·μL-12μL，TaqDNA聚合酶1U；滅菌ddH2O 13.6μL。

1.3.4 退火溫度篩選 引物的退火溫度一般下浮理論退火溫度5～10℃[8]，因此設(shè)置退火溫度最低為50℃，最高為60℃。PCR儀自動(dòng)對(duì)退火溫度生成12個(gè)梯度，篩選出最佳退火溫度。

1.3.5 ISSR-PCR擴(kuò)增體系的應(yīng)用 利用優(yōu)化的澤瀉ISSR反應(yīng)體系，用提取出的澤瀉基因組DNA分別與備選引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)反復(fù)篩選與比較分析，獲得適用于澤瀉的多態(tài)性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的15條引物。并隨機(jī)選取引物UBC825，對(duì)澤瀉的21個(gè)種源進(jìn)行DNA的擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.1.1 dNTPs濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響 dNTPs是ISSR反應(yīng)的原料，dNTPs濃度的變化對(duì)ISSR帶的數(shù)量和強(qiáng)弱影響較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明濃度在0.4mmol·L-1擴(kuò)增條帶較多而且比較亮，效果最佳。低于0.4mmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)量逐漸減少且條帶模糊，可能由于dNTPs濃度過(guò)低，Mg2+不能有效的激活TaqDNA聚合酶，合成產(chǎn)物的量減少；高于0.4mmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增條帶擴(kuò)增結(jié)果較一致。所以考慮到實(shí)驗(yàn)成本，dNTPs終濃度定為0.4mmol·L-1。

2.1.2 TaqDNA聚合酶對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響 TaqDNA聚合酶用量直接影響ISSR-PCR反應(yīng)的成功與否，TaqDNA聚合酶在PCR中的用量受酶活性、反應(yīng)體積、酶耐熱性等因素的制約[9]。本試驗(yàn)設(shè)置了從0.25U至1.75U等7個(gè)梯度（見(jiàn)圖2），酶用量在0.25～1.0U，隨著酶用量的增加，擴(kuò)增條帶的數(shù)量逐漸增多且條帶逐漸清晰、明亮。為了避免高濃度TaqDNA聚合酶會(huì)引起非特異性擴(kuò)增[10]，確定最佳使用量為1.0U。

2.1.3 引物濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響 引物濃度過(guò)高會(huì)引起堿基間的錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率，這兩者又競(jìng)爭(zhēng)使用TaqDNA聚合酶、dNTPs，這些均會(huì)使得擴(kuò)增效率下降[11]。本實(shí)驗(yàn)中將引物濃度設(shè)置在0.1～0.7μmol·L-1，濃度呈梯度變化，不同引物濃度擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)引物濃度為0.1μmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增條帶較模糊。引物濃度太高，可能會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)，而在本實(shí)驗(yàn)中，引物濃度為0.2～0.7μmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增的條帶基本一致，比較清晰而且條帶比較多，但濃度為0.5～0.7μmol·L-1時(shí)條帶稍弱，綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素，確定最后引物濃度為0.3μmol·L-1。

2.1.4 Mg2+濃度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響 Mg2+會(huì)極大的影響TaqDNA聚合酶活性，還影響著模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物的退火和引物二聚體的形成等[12]。本實(shí)驗(yàn)（圖4）設(shè)置了0.5～3.5mmol·L-1等7個(gè)梯度，當(dāng)Mg2+濃度<1.5mmol·L-1時(shí)沒(méi)有擴(kuò)增出條帶。當(dāng)Mg2+濃度在2.0、2.5、3.0、3.5mmol·L-1L等4個(gè)濃度時(shí)，條帶清晰，亮度逐漸變亮，條帶逐漸減少，最終確定Mg2+濃度為2.0mmol·L-1。

2.1.5 模板DNA含量對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響 DNA模板的用量是影響PCR擴(kuò)增的重要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖5），本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的7個(gè)梯度水平的DNA含量，均能擴(kuò)增出清晰，明亮的條帶且無(wú)明顯差異。這與吳鑫等研究結(jié)果相一致[13]。考慮到DNA用量越少越好，因此本實(shí)驗(yàn)選擇10ng模板DNA含量為ISSR-PCR反應(yīng)體系的最佳含量。

2.2 退火溫度的確定及有效引物篩選 退火溫度取決于引物的堿基組成、長(zhǎng)度和濃度[14]。一般來(lái)說(shuō)，較低的退火溫度可提高PCR反應(yīng)的敏感性但可能會(huì)出現(xiàn)非特異性現(xiàn)象，而較高的退火溫度則可提高PCR反應(yīng)的特異性但卻降低了其擴(kuò)增產(chǎn)率。一般情況下，退火溫度應(yīng)下浮引物Tm值5℃左右[15]，實(shí)際實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)所要求的PCR反應(yīng)的特異性和靈敏度做出相應(yīng)的調(diào)整。因此，優(yōu)化退火溫度的最理想方法是設(shè)置一系列對(duì)照反應(yīng)來(lái)確定最佳退火溫度。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了51.0、51.2、51.8、52.7、53.8、55.1、56.4、57.7、58.9、59.8、60.5、60.9℃12個(gè)退火溫度。結(jié)果表明（見(jiàn)圖6）：在退火溫度小于55.1℃時(shí)，產(chǎn)物少，當(dāng)溫度大于60.5℃時(shí)，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，可能是因?yàn)橥嘶饻囟冗^(guò)高，擴(kuò)增反應(yīng)受到限制，產(chǎn)物有所減少，當(dāng)溫度為58.9℃時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物多明顯，故引物UBC811最適合的退火溫度為58.9℃。