何天友+瞿印權+徐雯+陳凌艷+榮俊冬+鄭郁善

摘 要：目的：建立并優(yōu)化澤瀉反應體系和擴增程序，篩選出多態(tài)性、重復性較好的ISSR引物，為澤瀉種源鑒別以及指紋圖譜的構建提供理論基礎。方法：利用單因素試驗法，對Mg2+濃度、dNTPs濃度、TaqDNA聚合酶濃度、引物濃度及模板DNA含量這5個PCR反應體系主要成分以及退火溫度進行篩選，并利用建立優(yōu)化的反應體系和擴增程序對以往澤瀉文獻報道的ISSR引物進行篩選。結果：建立了最佳PCR反應體系：20μL的反應液中含2.0mmol·L-1Mg2+，0.4mmol·L-1dNTPs，1.0 U TaqDNA聚合酶，0.4mol·L-1引物，10ng模板DNA，2μL 10xBuffer，13.1 μL dd H2O。反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性45s。58.9℃退火45s，72℃延伸90s，40個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。結論：利用優(yōu)化的澤瀉的反應體系，篩選出15條多態(tài)性較好的引物，并對澤瀉的21個種源進行ISSR擴增，擴增出的條帶清晰、多態(tài)性較高，證實了該體系具有較高穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和適用性。此體系也為澤瀉種源間的遺傳多樣性研究以及ISSR分子標記奠定了基礎。

關鍵詞：澤瀉；ISSR；反應體系；優(yōu)化

中圖分類號 R282.7 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）07-0023-05

Abstract：Objectives：To establish optimized ISSR system of Alisma orientale（Samuel）Juz for selection of ISSR primers with high stability and repeatability. Methods：Applied the single factor design for optimizing five factors on ISSR amplification，such as Mg2+ concentration，dNTPs concentration，TaqDNA polymerase concentration，primer concentration and template DNA concentration.Results：The results showed that the optimal 20μL ISSR-PCR reaction system for Alisma orientale（Samuel）Juz contained 2.0mmol/L Mg2+，0.4mmol/L dNTPs，1.0 U TaqDNA polymerase，0.4mol/L primer，10ng DNA template，2μL 10xBuffer，13.1 μL ddH2O.On this optimal ISSR amplification system，15 primers were screened with good polymorphism baased on previous achievement on Alisma orientale（Samuel）Juz primers.Conclusion：15 primers with high polymorphism were effectively selected based on the optimized ISSR system.The test showed that the system was stable ，reliable and applicative. The optimal ISSR-PCR reaction system is suitable for the study of genetic diversity in plant of Alisma orientale（Samuel）Juz in different provenances.

Key words：Alisma orientale（Samuel）Juz；ISSR；Reaction system；Optimize

澤瀉[Alisma orientale（Samuel）Juz]為澤瀉科植物，在我國主要分布在福建、四川、江西等省區(qū)，生長在海拔幾十米至2 500m左右的湖泊、水塘、溝渠、沼澤中[1]，具有抑制動脈硬化、降血脂、利尿、降血壓、抗脂肪肝等作用，為地道藥材[2-3]。除了藥用外，園林上也有將澤瀉種植于淺水區(qū)供觀賞用。目前已從包括形態(tài)解剖學、細胞生物學、遺傳學、生物化學、分子生物學等多個領域對中國地道藥材澤瀉進行了不少的分類研究[4]。國內也有不少關于澤瀉類植物鑒別方面的研究，例如，胡珊梅等[5]運用了隨機擴增多態(tài)RAPD技術，對不同種原的澤瀉科植物澤瀉進行了研究，結果表明同種異地藥材所形成的不同的居群具有不同的遺傳特征。賀佳等[6]運用了簡單重復序列標記ISSR技術，對四川產澤瀉ISSR反應體系中各個主要影響因子進行了優(yōu)化和篩選，并建立了最適反應體系。

簡單重復序列標記（Inter Simper Sequence Repeat，ISSR）是一種建立于PCR反應基礎上的DNA分子標記技術.近年來，ISSR已成功用于植物遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構建、分子生態(tài)學研究等領域[7]。本試驗擬在澤瀉主產區(qū)福建、四川、廣西選擇21個不同種源的澤瀉樣品為研究材料，建立并篩選出關于澤瀉的最適ISSR-PCR反應體系，在此基礎上篩選出高多態(tài)性、重復性引物，為深入研究澤瀉的種質資源居群差異及良種選育研究提供理論支持，也為澤瀉資源的可持續(xù)開發(fā)與利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料 試驗所用材料澤瀉采集于廣西、四川、廣西、福建和江西，盡量選取嫩幼、新鮮的葉片，用硅膠干燥保存，并盡快轉移至-80℃冰箱，以備DNA的提取。

1.2 主要試劑與儀器 所用TaqDNA聚合酶、dNTPs Mixture、Mg2+、RNA降解酶、DNA ladder Marker、10xPCR Buffer、6xloading Buffer均購上海生物工程技術服務有限公司；瓊脂糖、核酸染料均購自北京賽西盛公司。引物參以往澤瀉文獻報道的ISSR引物，由上海生工合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA的提取與檢測 采用博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒提取的方法從澤瀉葉片上提取DNA，取2μLDNA樣品，加7μL雙蒸水，于1%的瓊脂糖凝膠上電泳，電壓100V，時間30min。紫外攝相儀觀察并攝相，看是否有一條完整清晰的DNA條帶，如出現(xiàn)多條帶或嚴重的拖尾，則表明DNA降解或斷裂，需要重新提取。最后用紫外分光光度計檢測其濃度、純度。

1.3.2 ISSR-PCR反應體系試驗設計 經(jīng)過試驗初步篩選，選用引物UBC811對澤瀉反應體系中的Mg2+濃度、dNTPs濃度、TaqDNA聚合酶濃度、引物濃度以及模板DNA含量逐一做單因素多水平梯度試驗，各因素水平見表1。

1.3.3 ISSR-PCR原初體系和擴增程序的建立 參考有關澤瀉ISSR分析文獻[6]，設定的原初擴增程序為：反應程序為94℃預變性5min；94℃變性45s。56℃退火45s，72℃延伸90s，40個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。原初擴增反應體系為l0×Buffer 2μL；dNTPs：10mmol·L-1 0.4μL；引物：10μmol·L-1 0.8μL；MgCl2：25mmol·L-1 2.0μL；模板DNA：10ng·μL-12μL，TaqDNA聚合酶1U；滅菌ddH2O 13.6μL。

1.3.4 退火溫度篩選 引物的退火溫度一般下浮理論退火溫度5～10℃[8]，因此設置退火溫度最低為50℃，最高為60℃。PCR儀自動對退火溫度生成12個梯度，篩選出最佳退火溫度。

1.3.5 ISSR-PCR擴增體系的應用 利用優(yōu)化的澤瀉ISSR反應體系，用提取出的澤瀉基因組DNA分別與備選引物進行PCR擴增，經(jīng)反復篩選與比較分析，獲得適用于澤瀉的多態(tài)性高、重復性好、穩(wěn)定性好的15條引物。并隨機選取引物UBC825，對澤瀉的21個種源進行DNA的擴增。

2 結果與分析

2.1 ISSR反應體系的優(yōu)化

2.1.1 dNTPs濃度對ISSR擴增的影響 dNTPs是ISSR反應的原料，dNTPs濃度的變化對ISSR帶的數(shù)量和強弱影響較大。實驗結果（圖1）表明濃度在0.4mmol·L-1擴增條帶較多而且比較亮，效果最佳。低于0.4mmol·L-1時，擴增條帶數(shù)量逐漸減少且條帶模糊，可能由于dNTPs濃度過低，Mg2+不能有效的激活TaqDNA聚合酶，合成產物的量減少；高于0.4mmol·L-1時，擴增條帶擴增結果較一致。所以考慮到實驗成本，dNTPs終濃度定為0.4mmol·L-1。

2.1.2 TaqDNA聚合酶對ISSR擴增的影響 TaqDNA聚合酶用量直接影響ISSR-PCR反應的成功與否，TaqDNA聚合酶在PCR中的用量受酶活性、反應體積、酶耐熱性等因素的制約[9]。本試驗設置了從0.25U至1.75U等7個梯度（見圖2），酶用量在0.25～1.0U，隨著酶用量的增加，擴增條帶的數(shù)量逐漸增多且條帶逐漸清晰、明亮。為了避免高濃度TaqDNA聚合酶會引起非特異性擴增[10]，確定最佳使用量為1.0U。

2.1.3 引物濃度對ISSR擴增的影響 引物濃度過高會引起堿基間的錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率，這兩者又競爭使用TaqDNA聚合酶、dNTPs，這些均會使得擴增效率下降[11]。本實驗中將引物濃度設置在0.1～0.7μmol·L-1，濃度呈梯度變化，不同引物濃度擴增結果見圖3。本實驗中當引物濃度為0.1μmol·L-1時，擴增條帶較模糊。引物濃度太高，可能會導致非特異性產物的出現(xiàn)，而在本實驗中，引物濃度為0.2～0.7μmol·L-1時，擴增的條帶基本一致，比較清晰而且條帶比較多，但濃度為0.5～0.7μmol·L-1時條帶稍弱，綜合考慮經(jīng)濟因素，確定最后引物濃度為0.3μmol·L-1。

2.1.4 Mg2+濃度對ISSR擴增的影響 Mg2+會極大的影響TaqDNA聚合酶活性，還影響著模板與PCR產物的解鏈溫度、產物的特異性、引物的退火和引物二聚體的形成等[12]。本實驗（圖4）設置了0.5～3.5mmol·L-1等7個梯度，當Mg2+濃度<1.5mmol·L-1時沒有擴增出條帶。當Mg2+濃度在2.0、2.5、3.0、3.5mmol·L-1L等4個濃度時，條帶清晰，亮度逐漸變亮，條帶逐漸減少，最終確定Mg2+濃度為2.0mmol·L-1。

2.1.5 模板DNA含量對ISSR擴增的影響 DNA模板的用量是影響PCR擴增的重要因素。實驗結果表明（圖5），本試驗設計的7個梯度水平的DNA含量，均能擴增出清晰，明亮的條帶且無明顯差異。這與吳鑫等研究結果相一致[13]?？紤]到DNA用量越少越好，因此本實驗選擇10ng模板DNA含量為ISSR-PCR反應體系的最佳含量。

2.2 退火溫度的確定及有效引物篩選 退火溫度取決于引物的堿基組成、長度和濃度[14]。一般來說，較低的退火溫度可提高PCR反應的敏感性但可能會出現(xiàn)非特異性現(xiàn)象，而較高的退火溫度則可提高PCR反應的特異性但卻降低了其擴增產率。一般情況下，退火溫度應下浮引物Tm值5℃左右[15]，實際實驗時應根據(jù)所要求的PCR反應的特異性和靈敏度做出相應的調整。因此，優(yōu)化退火溫度的最理想方法是設置一系列對照反應來確定最佳退火溫度。本實驗設置了51.0、51.2、51.8、52.7、53.8、55.1、56.4、57.7、58.9、59.8、60.5、60.9℃12個退火溫度。結果表明（見圖6）：在退火溫度小于55.1℃時，產物少，當溫度大于60.5℃時，無擴增產物，可能是因為退火溫度過高，擴增反應受到限制，產物有所減少，當溫度為58.9℃時擴增產物多明顯，故引物UBC811最適合的退火溫度為58.9℃。