郎培蕾，韓 赟，田 榮，谷 巍,3*，邱蓉麗，馬奇翰，吳文慶，劉夢(mèng)雪，鞠瑞鑫

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000；3. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

澤瀉(Alismatis rhizoma)為澤瀉科植物東方澤瀉Alismaorientale或澤瀉A.plantago-aquatica的干燥塊莖[1]，分別習(xí)稱(chēng)為“建澤瀉”與“川澤瀉”，傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)分別為福建建甌和四川彭山。澤瀉的活性成分以原萜烷型三萜為主[2]，其中23-乙酰澤瀉醇B 具有利尿、降血脂、保肝和抗腫瘤等生物活性[3—5]，23-乙酰澤瀉醇C 除利尿、降血脂作用外還具有抗骨質(zhì)疏松的功效[6]，二者均被2020 版《中國(guó)藥典》規(guī)定為澤瀉質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[1]。有研究表明，澤瀉品質(zhì)受環(huán)境因素影響，其功效物質(zhì)具有明顯的產(chǎn)地特異性[7]，而功效物質(zhì)種類(lèi)和含量差異均會(huì)影響臨床療效[8—9]。

生態(tài)因子是影響道地藥材生長(zhǎng)的主導(dǎo)因素[10]。有效積溫是植物生育期內(nèi)有效溫度(日平均溫度與生物學(xué)下限溫度的差值)的總和[11]，可反映植物生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)熱量的需求，是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要生態(tài)因子[12]。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物通過(guò)調(diào)整抗氧化酶活性和次生代謝產(chǎn)物以適應(yīng)環(huán)境變化[13—14]，而對(duì)產(chǎn)地環(huán)境的適應(yīng)正是道地藥材形成的生態(tài)學(xué)機(jī)制之一[15]。相關(guān)研究表明，不同產(chǎn)地的藥材其功效物質(zhì)含量存在顯著差異，且其含量與藥材生育期內(nèi)有效積溫顯著相關(guān)[16]。在不同有效積溫條件下，植物體內(nèi)的抗氧化酶活性也存在差異[17]。明確有效積溫對(duì)不同基原澤瀉抗氧化能力及功效物質(zhì)積累的影響對(duì)闡述其道地性成因具有重要意義，但目前相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)分析建澤瀉和川澤瀉主產(chǎn)地近40 年氣象數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)兩地澤瀉大田生長(zhǎng)期有效積溫?cái)?shù)據(jù)并進(jìn)行模擬研究，分析有效積溫對(duì)建澤瀉和川澤瀉的抗氧化能力與功效物質(zhì)積累的影響差異，明確有利于兩者功效物質(zhì)積累的有效積溫，為探究澤瀉道地性成因以及規(guī)范化栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為采自福建建甌的建澤瀉和四川彭山的川澤瀉，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)谷巍教授鑒定分別為澤瀉科植物東方澤瀉和澤瀉。

實(shí)驗(yàn)于南京中醫(yī)藥大學(xué)人工氣候室進(jìn)行，將建澤瀉和川澤瀉幼苗在大田栽培一周后，選取生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，栽植于盆高30 cm、上口徑33 cm、下口徑20 cm 的塑料盆內(nèi)，每盆定苗3 株，置于人工氣候室中緩苗10 d 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將適應(yīng)性培養(yǎng)后的建澤瀉和川澤瀉幼苗分別放置在2 間人工氣候室中，按照兩地建澤瀉和川澤瀉生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律及其有效積溫分析結(jié)果，設(shè)置整體處理時(shí)間為120 d。具體實(shí)驗(yàn)分組和各組有效積溫見(jiàn)表1。

表1 建澤瀉和川澤瀉實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Experimental grouping of Jian Zexie and Chuan Zexie

除溫度外，兩間人工氣候室其他實(shí)驗(yàn)條件均一致，光照強(qiáng)度300 μmol·m–2·s–1，光照周期為12 h(08:00～20:00)，相對(duì)濕度80%，按照規(guī)范化種植進(jìn)行栽培管理。

從進(jìn)行溫度處理的當(dāng)天開(kāi)始取樣，隨后每隔15 d 取樣一次，共取樣9 次；每組指標(biāo)均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 有效積溫計(jì)算

利用Wheat A(http://www.wheata.cn/)提取福建建甌和四川彭山兩地1982～2021 年近40 年建澤瀉與川澤瀉大田期(8 月下旬～12 月下旬)的逐日氣溫資料，計(jì)算統(tǒng)計(jì)期間各年份建澤瀉與川澤瀉大田生長(zhǎng)期≥10 ℃有效積溫(GDD)，計(jì)算公式如下：

式中，n 為統(tǒng)計(jì)階段連續(xù)天數(shù)(i=1，2，3....，n)；當(dāng)天有效積溫ei計(jì)算方式如下：

式中，ti表示日均溫，Tb(生物學(xué)零度)定為10 ℃。

第一，淘汰落后產(chǎn)能。煉油行業(yè)要認(rèn)識(shí)到產(chǎn)能過(guò)剩的嚴(yán)峻性，推進(jìn)部分產(chǎn)能退出或者企業(yè)轉(zhuǎn)型，淘汰落后產(chǎn)能不是行政命令，而是市場(chǎng)選擇。山東省公布了《關(guān)于加快七大高耗能行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的實(shí)施方案》，推進(jìn)全省500萬(wàn)噸/年及以下地方煉油企業(yè)煉油產(chǎn)能減量整合，規(guī)劃建設(shè)產(chǎn)能為3000萬(wàn)噸/年的煉化一體化項(xiàng)目，實(shí)現(xiàn)規(guī)模集約化、園區(qū)化發(fā)展；同時(shí)形成“油頭化尾”一體化產(chǎn)業(yè)模式，實(shí)現(xiàn)煉油與下游高端石化產(chǎn)品生產(chǎn)的平衡發(fā)展。未來(lái)我國(guó)煉油業(yè)要構(gòu)建“沿海戰(zhàn)略（七大煉化基地）+西部油田周邊煉廠”格局。

1.3.2 保護(hù)酶與丙二醛活性測(cè)定

選取澤瀉從內(nèi)向外第三片完全展開(kāi)功能葉，除去葉脈，剪碎混勻，精確稱(chēng)量1.0 g 置于預(yù)冷的研缽中，加入2 mL 磷酸緩沖液(pH 7.0)和石英砂在冰浴下研磨勻漿后，在4 ℃下15 000 r·min-1離心15 min，收集上清液待用。以愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性[18]、紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性[18]、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性。

精確稱(chēng)取葉片1.0 g 置于預(yù)冷的研缽中，加入10% TCA 10 mL，研磨后將所得勻漿于4000 r·min-1離心10 min 后收集上清液備用。采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定丙二醛(MDA)含量[18]。

1.3.3 功效物質(zhì)含量測(cè)定

于各時(shí)間點(diǎn)取澤瀉塊莖，洗去表面泥土，于60 ℃下烘干并研磨成粉(過(guò)5 號(hào)篩)，按《中國(guó)藥典》(2020 年版)方法測(cè)定23-乙酰澤瀉醇B 和23-乙酰澤瀉醇C 含量[1]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excle 2019、SPSS 24.0 等軟件進(jìn)行圖表繪制和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 近40 年建澤瀉與川澤瀉大田生長(zhǎng)期有效積溫及其差異分析

通過(guò)分析近40 年建澤瀉和川澤瀉大田生長(zhǎng)期有效積溫，發(fā)現(xiàn)建澤瀉大田生長(zhǎng)期有效積溫范圍在1044～1340 ℃·d 之間；川澤瀉大田生長(zhǎng)期有效積溫范圍在602～962 ℃·d 之間，二者有效積溫具有顯著差異(P< 0.05)(圖1)。建澤瀉與川澤瀉在各生長(zhǎng)階段所需有效積溫不同，兩者地上部分生長(zhǎng)期為8 月下旬至10月，有效積溫分別在815～1103 ℃·d 和539～784 ℃·d 之間，塊莖積累期在11 月至12 月下旬，有效積溫范圍分別為96～285 ℃·d 和30～158 ℃·d 。

圖1 近40 年建澤瀉與川澤瀉大田生長(zhǎng)期有效積溫分布趨勢(shì)Fig. 1 The GDD trends in Jian’ou and Pengshan in recent 40 years

根據(jù)近40 年建澤瀉與川澤瀉大田期每日平均溫度和有效積溫范圍，分別設(shè)置福建組(J)和四川組(C)溫度處理，即依據(jù)兩地晝夜溫差平均值，兩組處理的晝夜溫差均設(shè)為8 ℃(圖2)。

圖2 實(shí)驗(yàn)期間福建組、四川組每日平均溫度設(shè)置及有效積溫變化Fig. 2 Variation of daily mean temperature and effective accumulated temperature in Fujian and Sichuan formations during the experiment

2.2 在不同有效積溫條件下澤瀉保護(hù)酶活性差異

建澤瀉和川澤瀉SOD、POD 和CAT 酶活性變化趨勢(shì)均呈“M”型(圖3)。其中SOD 在處理期間變化平穩(wěn)，川澤瀉和建澤瀉SOD 活性第二次升高后變化趨勢(shì)略有不同，四川組川澤瀉(CAp) SOD 活性第二次升高的最高點(diǎn)出現(xiàn)在105 d，隨后快速下降，福建組川澤瀉(JAp) SOD活性則在75 d時(shí)達(dá)到高點(diǎn)，隨后緩慢降低。福建組建澤瀉(JAo)和四川組建澤瀉(CAo) SOD 活性分別在105 d 和90 d 時(shí)到達(dá)最高點(diǎn)，隨后快速下降(圖3A)。

圖3 不同有效積溫條件下建澤瀉和川澤瀉抗氧化酶活性Fig. 3 Effect of GDD on the activities of protective enzymes in Jian Zexie and Chuan Zexie

在整個(gè)處理期間，建澤瀉和川澤瀉POD 酶活性均在道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下較高(圖3B)。兩組澤瀉POD 酶活性升至最高的時(shí)間點(diǎn)也略有差異，其中福建組建澤瀉(JAo)和川澤瀉(JAp)及四川組川澤瀉(CAp)葉片中POD 活性均在105 d 時(shí)增至最大，而四川組建澤瀉(CAo)葉片POD 活性在90 d 升至最高，隨后降低。

建澤瀉和川澤瀉CAT 活性有初始差異，但在處理60 d 時(shí)兩組澤瀉的CAT 酶活性均下降至最低值，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度降低，CAT 活性在90 d達(dá)到最高，此時(shí)在道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下的建澤瀉和川澤瀉中CAT 活性分別較四川組建澤瀉(CAo)和福建組川澤瀉(JAp)高19.86%和30.01%，隨后在處理末期降至最低。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間建澤瀉和川澤瀉CAT 酶活性均在道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下較高(圖3C)。

2.3 不同有效積溫條件下澤瀉MDA 含量差異

建澤瀉和川澤瀉中MDA 含量均呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，但變化幅度隨品種和有效積溫的不同而略有差異。福建組建澤瀉(JAo)與四川組川澤瀉(CAp)中MDA 含量變化較為平穩(wěn)，而四川組建澤瀉(CAo)和福建組川澤瀉(JAp)中MDA 含量變化幅度較大，其中兩組中的建澤瀉MDA 活性在0～45 d 的變化幅度一致，在75 d 后兩者差距增大，此時(shí)四川組建澤瀉(CAo) 有效積溫為770 ℃·d ，福建組建澤瀉(JAo)有效積溫為1028 ℃·d 。在處理末期，四川組建澤瀉(CAo) MDA 含量較福建組建澤瀉(JAo)高158.48%。

而福建組川澤瀉(JAp)在生長(zhǎng)前期受有效積溫影響較大，其MDA 含量在0～30 d 快速上升，且在第30 天達(dá)最大值，此時(shí)MDA 含量較四川組川澤瀉(CAp)高73.07%；在此期間四川組川澤瀉(CAp)有效積溫為400 ℃·d ，而福建組川澤瀉(JAp)有效積溫達(dá)511 ℃·d 。隨后福建組川澤瀉(JAp) MDA 含量在45～90 d 逐漸下降后趨于平穩(wěn)；在采收期兩組川澤瀉MDA 含量變化趨勢(shì)一致。整個(gè)處理期內(nèi)，建澤瀉與川澤瀉MDA 含量均在道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下保持較低水平(圖4)。

圖4 不同有效積溫對(duì)建澤瀉和川澤瀉MDA 含量的影響Fig. 4 Effect of GDD on the contents of MDA in Jian Zexie and Chuan Zexie

2.4 不同有效積溫條件下澤瀉功效物質(zhì)含量差異

不同有效積溫處理下的建澤瀉和川澤瀉功效物質(zhì)含量呈現(xiàn)不同變化趨勢(shì)，其中福建組建澤瀉(JAo)和四川組川澤瀉(CAp)中23-乙酰澤瀉醇B 和23-乙酰澤瀉醇C 含量均隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加；福建組川澤瀉(JAp)呈上升–下降–上升–下降–上升的趨勢(shì)，而四川組建澤瀉(CAo)呈上升–下降–上升的趨勢(shì)(圖5)。

圖5 有效積溫對(duì)建澤瀉和川澤瀉功效物質(zhì)積累的影響Fig. 5 Effects of GDD on active ingredient contents of Jian Zexie and Chuan Zexie

福建組建澤瀉(JAo)和四川組川澤瀉(CAp)的23-乙酰澤瀉醇B 快速積累期均出現(xiàn)在處理105～120 d，此時(shí)兩者有效積溫(日均溫度)分別為1185 ℃· d (10～12 ℃)、843 ℃· d (7～9 ℃)，且在整個(gè)處理期間，23-乙酰澤瀉醇C 含量增長(zhǎng)均較為平穩(wěn)。四川組建澤瀉(CAo)與福建組川澤瀉(JAp) 23-乙酰澤瀉醇B 與23-乙酰澤瀉醇C 的積累則呈不規(guī)律變化。四川組建澤瀉(CAo)中23-乙酰澤瀉醇B 的快速積累期出現(xiàn)在處理90～105 d，此時(shí)其有效積溫(日均溫度)為830～843 ℃· d (10～12 ℃)，隨著處理溫度的下降，在105～120 d，日均溫為7～9 ℃條件下，四川組建澤瀉(CAo)中23-乙酰澤瀉醇B 未見(jiàn)顯著變化，而23-乙酰澤瀉醇C 含量顯著增加。福建組川澤瀉(JAp)中23-乙酰澤瀉醇B 的快速積累期出現(xiàn)在處理45～60 d (有效積溫720～893 ℃· d)和75～90 d (有效積溫1028～1126℃· d)，而在90～120 d(塊莖積累期)，其23-乙酰澤瀉醇B 含量未見(jiàn)明顯增長(zhǎng)，而23-乙酰澤瀉醇C 含量在75～90 d (有效積溫1028～1126 ℃· d)快速升高，隨后呈現(xiàn)先降低后升高的規(guī)律。

在采收期，福建組建澤瀉(JAo)和四川組川澤瀉(CAp)塊莖中23-乙酰澤瀉醇B 含量分別較四川組建澤瀉(CAo)和福建組川澤瀉(JAp)增加 60.56%和19.81%，但23-乙酰澤瀉醇C 含量卻分別降低47.22%、37.73%。

3 討論

有效積溫作為反映植物生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)熱量需求的指標(biāo)[19]，其不足或過(guò)高均會(huì)影響植物生長(zhǎng)及其品質(zhì)[20]，如有效積溫不足會(huì)導(dǎo)致魔芋Amorphophalluskonjac球莖膨大期生長(zhǎng)時(shí)間縮短，發(fā)育受抑制[21]，而有效積溫過(guò)高會(huì)導(dǎo)致丹參Salviamiltiorrhiza中功效物質(zhì)含量顯著降低[22]。低溫脅迫作為影響植物生存的最重要限制因子之一，能誘導(dǎo)植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物特別是萜類(lèi)物質(zhì)的變化[23]，但過(guò)度脅迫會(huì)抑制植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物積累[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，福建組和四川組建澤瀉雖然都在10～12 ℃條件下完成23-乙酰澤瀉醇B 的快速積累，但四川組建澤瀉(CAo)的23-乙酰澤瀉醇B 積累速率和采收時(shí)功效物質(zhì)含量均低于福建組建澤瀉(JAo)，可能是四川組建澤瀉在地上部分生長(zhǎng)期有效積溫不足，導(dǎo)致其生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，進(jìn)而影響其次生代謝產(chǎn)物積累[25]，且在處理末期，隨著四川組溫度設(shè)置的降低，23-乙酰澤瀉醇B 含量幾乎沒(méi)有增長(zhǎng)，這可能是后期溫度低于建澤瀉的適宜溫度范圍，導(dǎo)致其生長(zhǎng)受到抑制。而福建組川澤瀉(JAp)中23-乙酰澤瀉醇B 的快速積累始于處理45 d，且在塊莖積累期(90～120 d)并未出現(xiàn)23-乙酰澤瀉醇B 含量快速增加。在最后采收時(shí)，其23-乙酰澤瀉醇B 含量也低于道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下的川澤瀉，這可能是由于福建組川澤瀉在地上部分生長(zhǎng)期有效積溫較高導(dǎo)致其快速生長(zhǎng)，塊莖中23-乙酰澤瀉醇B 提前積累；同時(shí)，在塊莖積累期有效積溫較高不利于川澤瀉的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其塊莖中23-乙酰澤瀉醇B 含量幾乎不變。23-乙酰澤瀉醇B 作為澤瀉的主要藥效成分，在栽培中需考慮有效積溫對(duì)其積累的影響。

研究表明，植物通過(guò)提高抗氧化酶活性，尤其是SOD、POD 和CAT 活性來(lái)減少外部溫度變化對(duì)自身的影響[26—27]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下的建澤瀉和川澤瀉保護(hù)酶活性變化趨勢(shì)一致，MDA 含量變化也較為平穩(wěn)，說(shuō)明兩種澤瀉均適應(yīng)道地產(chǎn)區(qū)的溫度條件，對(duì)此溫度變化細(xì)胞能通過(guò)抗氧化保護(hù)酶之間的協(xié)同作用降低脂膜過(guò)氧化程度，同時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，從而提高自身抗性[28]。而福建組川澤瀉(JAp)在0～30 d 有效積溫過(guò)高，四川組建澤瀉(CAo)在地上部分生長(zhǎng)期有效積溫不足，保護(hù)酶活性受到抑制，導(dǎo)致其MDA 含量顯著升高，有效積溫對(duì)建澤瀉和川澤瀉的抗氧化能力影響顯著?？寡趸赶到y(tǒng)作為植物自身的保護(hù)機(jī)制，與次生代謝產(chǎn)物一起，共同抵御外界環(huán)境變化帶來(lái)的影響[29]。前人研究發(fā)現(xiàn)，植物抗氧化酶活性與其次生代謝產(chǎn)物積累密切相關(guān)[30]。本實(shí)驗(yàn)中除福建組川澤瀉(JAp)外，福建組建澤瀉(JAo)、四川組建澤瀉(CAo)和川澤瀉(CAp)塊莖中23-乙酰澤瀉醇B 快速積累期與其SOD 和POD 活性最高的時(shí)間幾乎重合，這與Tang等[31]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明抗氧化酶和次生代謝產(chǎn)物在適應(yīng)環(huán)境變化的過(guò)程中具有協(xié)同作用。

溫度可以通過(guò)影響植物體內(nèi)次生代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)影響萜類(lèi)物質(zhì)含量的變化[32]，其中細(xì)胞色素P450(CPY450)對(duì)萜類(lèi)物質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化起到重要作用[33]。研究表明，栽培在四川彭山的建澤瀉中CYP71 和CYP85 家族的差異表達(dá)基因(DEGs)表達(dá)水平較栽培在福建建甌的建澤瀉顯著上調(diào)，這可能導(dǎo)致栽培在兩地的建澤瀉出現(xiàn)三萜組分含量差異[34]。本實(shí)驗(yàn)中，道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下的建澤瀉和川澤瀉23-乙酰澤瀉醇B 含量升高，23-乙酰澤瀉醇C降低，這可能是由于有效積溫通過(guò)影響建澤瀉與川澤瀉體內(nèi)代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)導(dǎo)致功效物質(zhì)間的競(jìng)爭(zhēng)性轉(zhuǎn)化，從而使23-乙酰澤瀉醇B 和23-乙酰澤瀉醇C 的含量產(chǎn)生差異，但其內(nèi)在轉(zhuǎn)化機(jī)制還需進(jìn)一步研究。上述結(jié)果為以功效物質(zhì)為目標(biāo)的定向培育提供理論支撐。