張安妮+沈紅池+陳雪珍+周新程+張文藝

摘要：為制備出兼具溶藻及降解藻毒素（MC-LR）的雙效工程菌，研究不同的親本原生質(zhì)體滅活方式、不同PEG濃度、pH以及作用的溫度對原生質(zhì)體融合的影響，探討溶藻細菌F8與藻毒素降解菌T1菌株的原生質(zhì)體融合的適宜條件。結(jié)果表明，對F8菌株的原生質(zhì)體采用45 ℃熱滅活、T1菌株的原生質(zhì)體紫外滅活，采用pH為8.0的30%的PEG溶液，融合溫度為30 ℃，原生質(zhì)體融合率可達28.17%。

關(guān)鍵詞：溶藻細菌；藻毒素降解菌；原生質(zhì)體融合

中圖分類號：Q813.2；X172；X524 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）06-1033-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.010

Abstract： In order to prepare double engineering bacterium which could both dissolve algae and degradation of microcystin degrading bacteria（MC-LR）， the influence of different parent protoplast inactivating methods， concentrations of PEG， pH and temperature on the protoplast fusion were studied. And the suitableconditions of protoplast fusion between dissolve algae bacteria F8 and algae toxin degradation bacterium T1 strain were explored. The results indicated that when the F8 protoplast was inactivated heat by 45 ℃，T1 protoplast was under UV inactivated， pH of PEG solution was 8.0， the mass fraction of PEG solutionwas 30% and the fusion temperature was 30 ℃， the protoplast fusion rate could reach 28.17%.

Key words： algae-lysing bacteria； microcystin degrading bacteria； protoplast fusion

21世紀以來，細胞融合技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)的核心技術(shù)之一得到迅速發(fā)展，廣泛用于農(nóng)牧業(yè)、輕工、醫(yī)療等方面，在植物細胞遺傳學(xué)和育種學(xué)領(lǐng)域，通過細胞融合技術(shù)使得植物細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)重新組合，獲得雜種細胞，進而培育成新植物體[1-3]；在人源化抗體的研制方面，已經(jīng)培育出具有較高價值的能夠用于診斷及治療病癥的單克隆抗體[4，5]；在輕工業(yè)方面，原生質(zhì)體融合技術(shù)主要用于酒精發(fā)酵工藝的改良，構(gòu)建能夠直接發(fā)酵淀粉的酵母菌株用于降低能耗[6-10]。隨著越來越多的學(xué)者對原生質(zhì)體融合技術(shù)的重視，這一方法也逐漸拓寬到環(huán)境保護領(lǐng)域[11-15]。本研究利用原生質(zhì)體融合技術(shù)實現(xiàn)溶藻與藻毒素（MC-LR）降解功能的融合，引入所需的目標(biāo)功能，滿足環(huán)境保護與治理的需求。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

本研究已篩選出的TR3菌株、實驗室從太湖流域野生白鰱魚腸中篩選的MC-LR降解菌F8（Lysinibacillus fusiformis），在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank中注冊序列號JQ991003，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號CGMCC NO.6106。

1.2 樣品準備

對處于細菌生長遲滯期的F8菌株進行原生質(zhì)體的制備與再生，所使用的溶菌酶濃度為5 mg/L，酶解時間為30 min，酶解溫度為33 ℃，制備后的原生質(zhì)體分別進行45 ℃熱滅活。

將培養(yǎng)至對數(shù)期的T1菌株進行原生質(zhì)體的制備與再生，試驗過程中采用的溶菌酶濃度為0.05 mg/mL，酶解溫度為30 ℃，酶解時間為1 h。制備的原生質(zhì)體，分別進行紫外滅活（點光源距離15 cm，照射60 min）、45、50、55、60 ℃熱滅活，分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ處理，以備后用。

1.2.1 原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的制備按照以下方法進行，以溶菌酶濃度、酶解溫度、酶解時間、細菌生長階段為影響因素，探索其對原生質(zhì)體制備的影響。

1）菌體重懸：將4 mL活化的菌液4 500 r/min離心10 min，以SMM緩沖液洗滌2～3次后，用SMM緩沖液重懸；

2）酶解：加入溶菌酶使得體系濃度達到設(shè)定值，設(shè)置不同溫度與時間，水浴保溫酶解；

3）原生質(zhì)體重懸：3 000 r/min離心后以0.55 mol/L的NaCl溶液洗滌原生質(zhì)體2～3次，再用4 mL 0.55 mol/L NaCl溶液重懸原生質(zhì)體。

4）測定原生質(zhì)體制備率：將溶菌酶處理前的細胞和酶解后的原生質(zhì)體懸液均用無菌水稀釋到合適梯度，放置10 min，使得原生質(zhì)體吸水脹破，取100 μL涂布于細菌固體培養(yǎng)基，每個梯度做3個平行，30 ℃倒置培養(yǎng)48 h，分別計菌落數(shù)A和B，計算原生質(zhì)體制備率，以檢驗制備效果。

原生質(zhì)體制備率=■×100%

式中，A為總菌落數(shù)，即未經(jīng)溶菌酶處理的菌液涂布于細菌平板上生長的菌落數(shù)；B為未原生質(zhì)體化的細菌菌落數(shù)，即原生質(zhì)體懸液經(jīng)無菌水稀釋后涂布于細菌平板上生長的菌落數(shù)。

1.2.2 原生質(zhì)體的再生 原生質(zhì)體的再生按照以下方法，研究溶菌酶濃度、酶解溫度、酶解時間、細菌生長階段對原生質(zhì)體再生的影響。

取“1.2.1”步驟（4）的原生質(zhì)體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的3個梯度，分別吸取100 μL涂布于高滲固體培養(yǎng)基，每個梯度做3個平行，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計再生菌落數(shù)C，計算原生質(zhì)體再生率，以檢驗再生效果。

原生質(zhì)體再生率=■×100%

式中，A為總菌落數(shù)；B為未原生質(zhì)體化的細菌菌落數(shù)；C為再生菌落數(shù)，即原生質(zhì)體懸液，經(jīng)高滲NaCl溶液稀釋后在高滲平板上長出來的菌落數(shù)。

1.3 培養(yǎng)基

1）細菌培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。固體細菌培養(yǎng)基加入瓊脂粉20～24 g/L。

2）高滲液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸出汁5 g/L，牛肉膏5 g/L，蔗糖170 g/L（0.5 mol/L），調(diào)節(jié)pH至7.2。高滲固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20～24 g/L。

上述培養(yǎng)基均在高壓滅菌鍋中于121 ℃條件下滅菌20 min。

1.4 方法

將不同滅活方式處理后的兩親本原生質(zhì)體各取1 mL于5 mL滅菌離心管中，混勻后3 800 r/min離心20 min，棄去上清液，加入新生磷酸鈣溶液0.2 mL，搖勻，加入1.8 mL適當(dāng)濃度的PEG（聚乙二醇）4 000，在不同溫度下水浴保溫不同時間，3 800 r/min離心10 min，棄去上清液，用SMM（磺胺間甲氧嘧啶鈉）溶液定容至2 mL，并以SMM梯度稀釋到適當(dāng)濃度，吸取100 μL涂布于高滲固體培養(yǎng)基，每個梯度做3個平行，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計融合子形成個數(shù)E，計算原生質(zhì)體融合率，以檢驗融合效果。

原生質(zhì)體融合率=（■）×100%

式中，E為融合處理后再生的細菌菌落數(shù)；F為兩原生質(zhì)體滅活處理后存活的平均菌落數(shù)；G為兩親本酶解前完全平板上平均菌落數(shù)；H為兩原生質(zhì)體滅活處理后未原生質(zhì)體化的菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本滅活方式對原生質(zhì)體融合的影響

為提高篩選效率，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)對滅活原生質(zhì)體融合開展了研究，熱滅活與紫外滅活成為各國學(xué)者主要選用的方法[16-19]。但就雙親均采用熱滅活方式進行融合的這一方式存在一定的分歧，李佳瑋等[20]成功以雙親熱滅活融合出具有親本有效性狀的菌株，而國外部分學(xué)者認為雙親熱滅活融合后能獲得兼具親本性狀的菌株可能性較小[21]。因此，選用5種親本滅活方式，對親本滅活方式對原生質(zhì)體融合的影響進行探索，尋求獲得高融合率的親本最優(yōu)滅活方式。

由表1可知，雙親均采用熱滅活或雙親分別采用熱滅活與紫外滅活方式下，融合子的形成個數(shù)差異較大。在不同融合方式下形成融合子的融合率如圖1所示，雙親采用熱滅活方式，不同滅活溫度條件的變化，其形成融合子的融合率均較低，不能達到較好的融合效果，而雙親株中，對F8原生質(zhì)體采用45 ℃熱滅活、T1原生質(zhì)體紫外滅活后進行融合可達到31.97%的融合率。這與國外學(xué)者的研究結(jié)果相類似。

2.2 不同濃度的PEG溶液對原生質(zhì)體融合的影響

PEG溶液的作用是在高滲條件下促使原生質(zhì)體相互聚集、融合，其分為多種不同分子質(zhì)量劑型，國內(nèi)外學(xué)者一般采用的PEG劑型為4 000～6 000[22-24]，選用分子質(zhì)量6 000的PEG為促融劑，研究PEG不同濃度條件下對原生質(zhì)體融合的影響，以融合率衡量融合效果。

由圖2可知，過高濃度的PEG溶液會對細胞產(chǎn)生一定的毒性作用。40%～45%濃度的PEG溶液之間可能存在一個臨界值，高于該值，原生質(zhì)體可能會因為毒害作用導(dǎo)致死亡，造成原生質(zhì)體融合率下降。PEG濃度在30%～40%之間時，原生質(zhì)體融合率變化不大，略有減小趨勢，這可能是30%的PEG溶液已經(jīng)達到了比較好的融合效果，繼續(xù)增加PEG濃度，其毒害作用會在一定程度上逐步體現(xiàn)，但并不是主流。為控制毒性作用，達到高融合率，本研究采用30%的PEG溶液作為最適濃度，進一步考慮其他因素對雙效工程菌原生質(zhì)體融合的影響。

2.3 pH對原生質(zhì)體融合的影響

由圖3可知，PEG溶液的酸堿度對融合效果影響較為明顯，pH為8.0條件下的PEG溶液促融效果最好，可達26.78%，pH偏中性條件下PEG溶液促融效果較差，僅為4.83%～8.66%；pH偏堿條件下的PEG溶液促融效果較pH為8.0條件下有所降低，為10.83%～21.89%，明顯優(yōu)于偏中性條件，這可能是由原生質(zhì)體的生理特性所決定的，原生質(zhì)體由于其細胞壁的缺失，對外環(huán)境酸堿的適應(yīng)性遠不如雙親株細菌，因此，選用pH為8.0的30%PEG溶液為促融劑。

2.4 作用溫度對原生質(zhì)體融合的影響

一定濃度條件下的PEG溶液在促進原生質(zhì)體融合時，作用溫度對原生質(zhì)體融合存在一定的影響，結(jié)果見表2。

由表2可知，在30 ℃條件下，形成融合子個數(shù)最多，達1.32×106個，此條件下融合率可達28.17%。如圖4所示，溫度高于30 ℃的條件下，隨著溫度的升高，融合子個數(shù)急劇減少，融合率顯著降低，在45～50 ℃時，融合率幾乎為0；溫度低于30 ℃時，融合子個數(shù)少于30 ℃時，融合率達20.50%。綜合上述情況，30 ℃是pH為8.0、30%PEG溶液促融條件下較為適宜的作用溫度。

3 小結(jié)

試驗結(jié)果表明，不同的親本原生質(zhì)體滅活方式對原生質(zhì)體融合產(chǎn)生較大的影響，不同濃度條件下的PEG溶液在促進原生質(zhì)體融合時，作用的溫度對原生質(zhì)體融合存在影響。此外，PEG溶液的酸堿度也是影響融合的因素。對F8原生質(zhì)體采用45 ℃熱滅活、T1原生質(zhì)體紫外滅活后，采用pH為8.0的30%PEG溶液，融合溫度為30 ℃，可達到最佳雙效工程菌原生質(zhì)體融合的效果，原生質(zhì)體融合率可達28.17%。本研究對于同步溶藻、藻毒素降解雙效工程菌基礎(chǔ)研究和雙效工程菌劑的開發(fā)有一定的理論和參考價值。

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