張雙，伊淑帥，王一鳴，郭夢茹，李響，胡桂學(xué)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118；2.松原出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林松原 138000)

?

吉林省犬細(xì)小病毒流行毒株的分離及VP2基因序列分析

張雙1，伊淑帥1，王一鳴1，郭夢茹1，李響2，胡桂學(xué)1*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118；2.松原出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林松原 138000)

為了解吉林省寵物醫(yī)院就診犬犬細(xì)小病毒流行現(xiàn)狀及毒株變異情況，從吉林省長春、吉林、遼源、松原、九臺(tái)地區(qū)采集就診犬肛門拭子73份，采用膠體金快速檢測試劑盒檢測后，陽性樣品15份。選取具有代表性的6份病料使用F81細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離，成功分離到6株病毒(暫命名為JL-CC1、JL-CC2、JL-JL、JL-SY、JL-JT、JL-LY)，經(jīng)通用引物鑒定均為犬細(xì)小病毒。VP2基因序列分析結(jié)果顯示，6株CPV分離株之間的核苷酸同源性為99.3%～100%，與近年來國內(nèi)分離株核苷酸同源性為98.9%～99.9%，與國外分離株核苷酸同源性為98.3%～99.7%。遺傳進(jìn)化樹結(jié)果表明，6株分離株分屬4個(gè)分枝：JL-CC1、JL-LY、JL-SY與山東、遼寧分離株同屬1個(gè)分枝，JL-CC2與黑龍江分離株同屬1個(gè)分枝，JL-JT與吉林分離株同屬1個(gè)分枝，JL-JL與2013年吉林、黑龍江分離株同屬1個(gè)分枝。氨基酸序列比對顯示6株分離株JL-CC1、JL-CC2、JL-JT、JL-LY、JL-SY屬于New CPV-2a基因亞型，JL-JL株為屬于New CPV-2b基因亞型。此外，6株CPV分離株在267、324、377、440位氨基酸發(fā)生了變異。結(jié)果表明，吉林省CPV以CPV-2a亞型為主，CPV-2b亞型為輔，并存在基因多變現(xiàn)象，可為吉林省CPV的有效防控提供數(shù)據(jù)支持。

吉林?。蝗?xì)小病毒；分離；VP2基因

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus, CPV)感染引起的一種犬急性高度接觸性傳染病，主要感染幼犬，臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、出血性腸炎以及白細(xì)胞顯著減少。自1977年美國科學(xué)者Eugstet等首次從患病犬糞便中觀察到CPV后，加拿大、日本、法國、德國、韓國等國家先后報(bào)道了本病的發(fā)生[1-2]。我國首次于1982年由梁世哲等報(bào)道了本病的發(fā)生，并于次年由徐漢坤等確定了本病在我國的流行[3]。目前，CPV已呈世界性流行，對寵物犬健康以及毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。

CPV隸屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，為單股正鏈DNA病毒。病毒粒子為等軸對稱的二十面體結(jié)構(gòu)，直徑為20～24 nm，由衣殼和核酸組成，病毒無囊膜。CPV病毒粒子結(jié)構(gòu)堅(jiān)實(shí)致密，對外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)。CPV基因組長約5200 nt，分子量為1.7×106，其基因組中包含2個(gè)啟動(dòng)子，利用宿主的RNA聚合酶Ⅱ分別啟動(dòng)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1, VP2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1, NS2)編碼基因的轉(zhuǎn)錄[4-6]。CPV只有一個(gè)抗原型，與FPV、MEV同源性較近，序列分析表明FPV與CPV的基因組差異不到1%，但宿主范圍、血凝性、抗原性等存在著明顯的差異。CPV可以通過基因漂移不斷進(jìn)化，隨時(shí)間發(fā)生基因突變，CPV已由最初分離的CPV-2亞型，變異為CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)5中基因亞型。其變異的主要特征為VP2蛋白第426位氨基酸的變異，426-天冬酰胺(Asn)為CPV-2與CPV-2a亞型，變異為天冬氨酸(Asp)，則為CPV-2b亞型，變異為谷氨酸(Glu)，則為CPV-2c亞型[7]。目前，中國流行的主要為CPV-2a、CPV-2b亞型，2010年報(bào)道CPV-2c亞型的感染，但未形成大的流行[8]。為了解吉林省寵物醫(yī)院就診犬CPV流行毒株的變異情況及基因亞型分布情況，本試驗(yàn)采用膠體金快速診斷試劑盒對長春、吉林、九臺(tái)等5個(gè)地區(qū)寵物醫(yī)院就診犬病例進(jìn)行了檢測，并對CPV陽性病例進(jìn)行了病毒分離與VP2基因測序及分析，以了解吉林地區(qū)CPV的分子流行病學(xué)與VP2基因遺傳變異情況，以期為本地CPV的有效防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株及細(xì)胞株 CPV陽性毒株為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；F81細(xì)胞為軍事獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器 犬細(xì)小膠體金快速檢測試劑盒購于意大利KoQine公司；Virus Genomic DNA Kit，Gel Extraction kit，Plasmid Mini Preparation kit購自Axygen公司；Ex Taq酶、10×buffer、dNTP、PMD-18T、DL 2000 maker等均購自TAKARA公司；MEM、0.05%胰酶、雙抗、胎牛血清購自gibco公司。MikRo 22R高速冷凍離心機(jī)(德國HETTICH公司)、MIR-162 CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)、TC-25/H PCR儀(BIOER公司)、DYY-6B電泳儀凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)等。

1.3 病料來源及處理 病料采集自2015-2016年吉林省長春、吉林、松原、九臺(tái)、遼源5個(gè)地區(qū)寵物醫(yī)院就診的寵物犬，為患病犬的糞便樣本。采集的糞便樣本中加入含有1%雙抗溶液的MEM渦旋混勻，反復(fù)凍融3次后，5000 r/min離心5 min，收集上清液10000 r/min離心5 min，再次收集上清液于新的離心管中，處理后的樣本于-80 ℃保存。

1.4 犬細(xì)小膠體金試紙條檢測 病料處理液使用KoQine公司的犬細(xì)小膠體金快速檢測試劑盒進(jìn)行檢測，并設(shè)置陽性對照與陰性對照。

1.5 病毒分離 膠體金快速檢測試劑盒檢測結(jié)果為陽性的病料處理液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，按培養(yǎng)液體積的1/10接種于F81細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對照組，37 ℃吸附1 h，補(bǔ)充細(xì)胞維持液，37 ℃、5% CO2溫箱中靜置培養(yǎng)4～5 d，每日觀察細(xì)胞病變情況。若無病變則于培養(yǎng)4～5 d后收集培養(yǎng)液，按照常規(guī)方法進(jìn)行盲傳，盲傳5代后無病變則視為陰性；出現(xiàn)病變的細(xì)胞經(jīng)反復(fù)凍融3次后收集病毒液，-80 ℃保存。

1.6 犬細(xì)小通用引物鑒定 使用Virus Genomic DNA Kit提取出現(xiàn)典型犬細(xì)小CPE的病毒液DNA，以病毒DNA為模板，去離子水、CPV陽性毒株DNA為陰、陽對照，使用CPV通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.7 VP2全基因擴(kuò)增及序列分析 根據(jù)NCBI上已發(fā)表的CPV-2株(GenBank登錄號：M38245)基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增VP2全基因序列的引物，引物序列為VP2-F: 5’-ATGAGTGATGGAGCAGTTC-3’，VP2-R: 5’-AATATAATTTTCTAGGTGCTAG-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1755 bp。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1min 45 s，72 ℃終延伸10 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，經(jīng)膠回收后連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性菌落提取質(zhì)粒，并送往上海生工有限公司測序。查找GenBank上已發(fā)表的國內(nèi)外不同基因型的CPV毒株VP2基因序列，使用MEG7.0軟件進(jìn)行基因序列及氨基酸序列同源性分析，并繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 膠體金試劑盒檢測結(jié)果 本試驗(yàn)共采集患病犬糞便樣本73份，經(jīng)犬細(xì)小膠體金快速診斷試劑盒檢測，CPV陽性樣品15份，分別為長春6份、吉林3份、松原2份、九臺(tái)2份、遼源2份。

2.2 病毒分離 選擇具有代表性的6份膠體金檢測陽性臨床樣品處理液，接種單層培養(yǎng)的F81細(xì)胞，并觀察細(xì)胞病變。6份臨床樣品均于接毒后48～96 h細(xì)胞出現(xiàn)腫脹圓縮、拉網(wǎng)、脫落典型的細(xì)胞病變，對照組細(xì)胞正常(圖1)。連續(xù)盲傳3代，出現(xiàn)穩(wěn)定的細(xì)胞病變，證明成功分離到6株病毒，暫命名為JL-CC1、JL-CC2、JL-JL、JL-SY、JL-JT、JL-LY。

A：接毒組細(xì)胞腫脹圓縮、拉網(wǎng)、脫落；B：對照組細(xì)胞無病變圖1 接毒后細(xì)胞病變

2.2 犬細(xì)小通用引物鑒定結(jié)果 采用犬細(xì)小病毒通用引物對提取的病毒液DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均在845 bp左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。經(jīng)序列測定及在線Blast比對，與CPV同源性為98.3%～99.9%，確定分離到的6株病毒均為CPV。

2.3 VP2全基因擴(kuò)增結(jié)果 采用設(shè)計(jì)的VP2全基因引物VP2-F/VP2-R對6株CPV分離株的VP2基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均在1755 bp左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。

2.4 VP2基因遺傳進(jìn)化分析 CPV分離株VP2基因經(jīng)PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化后，將陽性克隆質(zhì)粒送往上海生工生物工程公司測序，測序結(jié)果經(jīng)拼接后得到CPV分離株的VP2全基因序列，均為1755 bp?；赩P2基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，6株CPV分離株之間的核苷酸同源性為99.3%～100%，與近年來國內(nèi)分離株核苷酸同源性為98.9%～99.9%，與國外分離株核苷酸同源性為98.3%～99.7%。其中，JL-CC1、JL-LY、JL-SY核苷酸同源性高達(dá)99.7%～100%；JL-CC2株與2013年黑龍江分離株核苷酸同源性達(dá)99.8%，JL-JT株與2008年吉林分離株核苷酸同源性達(dá)99.7%，JL-JL株與2013年吉林分離株核苷酸同源性達(dá)99.8%，6株CPV分離株與山東、遼寧等地方分離株核苷酸同源性也達(dá)到98.9%以上。查找GenBank上國內(nèi)外不同基因型的CPV VP2基因序列，應(yīng)用MEG 7.0軟件進(jìn)行序列分析，并繪制遺傳進(jìn)化樹(圖4)。

M：DL 2000Maker；1～6：JL-CC1、JL-CC2、JL-JL、JL-SY、JL-JT、JL-LY；7：陽性對照；8：陰性對照圖2 犬細(xì)小通用引物鑒定結(jié)果

M：DL 2000Maker；1～6：JL-CC1、JL-CC2、JL-JL、JL-SY、JL-JT、JL-LY；7：陰性對照圖3 CPV分離株VP2基因擴(kuò)增結(jié)果

圖4 CPV VP2核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹(▲代表CPV分離株)

由圖可知，VP2基因遺傳進(jìn)化樹分為2個(gè)大的分枝，分別為A分枝(主要包括本試驗(yàn)6株分離株與山東、遼寧、吉林、黑龍江、印度以及韓國分離株)與B分枝(主要包括美國、法國分離的CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c毒株)。6株分離株分屬4個(gè)分枝：JL-CC1、JL-LY、JL-SY與山東、遼寧分離株同屬1個(gè)分枝，JL-CC2與黑龍江分離株同屬1個(gè)分枝，JL-JT與吉林分離株同屬1個(gè)分枝，JL-JL與2013年吉林、黑龍江分離株同屬1個(gè)分枝。

2.5 VP2基因推導(dǎo)氨基酸序列分析 根據(jù)CPV分離株VP2基因推導(dǎo)VP2氨基酸序列，共編碼584個(gè)氨基酸。比對6株分離株與GenBank中典型CPV基因型的氨基酸序列，分析CPV分離株基因變異位點(diǎn)(表1)。由代表CPV基因亞型的第87位、426位氨基酸可知，JL-CC1、JL-CC2、JL-JT、JL-LY、JL-SY均為426N，屬于New CPV-2a基因亞型，僅JL-JL株為426D，屬于New CPV-2b基因亞型。此外，6株CPV分離株在267、324、377、440位氨基酸發(fā)生了變異，主要表現(xiàn)為267: F→Y，324: Y→I，377: R→K，440: T→A，與中國分離株CPV/CN/HB1/2013、CPV/CN/JL6/2013等存在相同的變異，屬于一個(gè)特殊的分枝。

表1 CPV VP2基因推導(dǎo)氨基酸分析

3 討 論

犬細(xì)小病毒主要感染幼犬，幼犬感染CPV后發(fā)病率高達(dá)90%，病死率可達(dá)到20%～50%。不同年齡階段的幼犬感染后表現(xiàn)為不同的臨床癥狀，子宮內(nèi)感染或8周齡以下幼犬感染多表現(xiàn)為心肌炎型，2～6月齡幼犬感染多表現(xiàn)為腸炎型[9]。此外，部分CPV毒株還可以感染貓科動(dòng)物、貂等毛皮動(dòng)物，對寵物犬貓健康以及毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。CPV僅有一個(gè)血清型，但經(jīng)過長期變異后形成不同的基因亞型，主要包括CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c。1978-1980年，主要為CPV-2基因型；1980年后，CPV-2 VP2蛋白發(fā)生了5個(gè)氨基酸的變異后成為CPV-2a亞型；1984年后，CPV-2a亞型VP2蛋白第426為氨基酸發(fā)生了變異進(jìn)化為CPV-2b基因亞型；近年來，德國、阿根廷、南美等國家報(bào)道了CPV-2c基因亞型的出現(xiàn)[7, 10]。目前，世界范圍內(nèi)主要流行的毒株為CPV-2a與CPV-2b亞型，但部分國家流行毒株則以CPV-2c亞型為主，如巴西、烏拉圭等國家[11]。據(jù)報(bào)道，我國目前流行的毒株主要為CPV-2a亞型，其次是CPV-2b亞型，2010年報(bào)道了CPV-2c亞型的發(fā)生，但未形成大規(guī)模流行。CPV的診斷臨床上主要依靠臨床癥狀的觀察以及生化、血常規(guī)、膠體金快速檢測試劑盒，實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠病毒分離鑒定、PCR、LAMP等分子生物學(xué)檢測技術(shù)以及血凝試驗(yàn)、ELISA等免疫學(xué)診斷方法[12]。病毒分離主要使用F81、MDCK、CRFK等細(xì)胞?；蛐丸b定方法主要依據(jù)VP2基因，包括VP2全基因擴(kuò)增與VP2基因可變區(qū)核酸PCR等方法，如Chinchkar等建立的VP2全基因擴(kuò)增引物、Senda和Pereira等設(shè)計(jì)的CPV基因可變區(qū)PCR引物等[13-14]。本試驗(yàn)采用膠體金試紙條對臨床樣本進(jìn)行初步檢測，陽性樣品使用F81細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，成功分離到6株病毒，經(jīng)CPV通用引物鑒定為CPV毒株，并暫命名為JL-CC1、JL-CC2、JL-JL、JL-SY、JL-BC、JL-LY。

使用設(shè)計(jì)的VP2全基因序列引物對6株CPV分離株VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序，并與國內(nèi)外CPV分離株進(jìn)行基因比對分析與推導(dǎo)氨基酸變異情況分析。VP2基因遺傳進(jìn)化樹主要分為2個(gè)大的分枝：A分枝與B分枝，6株CPV分離株屬于A分枝，還包括2008-2014年我國山東、吉林、遼寧、黑龍江等地方分離株以及印度、韓國等亞洲分離株。B分枝主要包括美國、法國等歐美國家分離的不同基因亞型的CPV毒株。A分枝中，JL-CC1、JL-LY、JL-SY與山東、遼寧分離株同屬1個(gè)分枝，同源性高達(dá)99.7%～100%；JL-CC2株與2013年黑龍江分離株同屬1個(gè)分枝，核苷酸同源性達(dá)99.8%；JL-JT株與2008年吉林分離株同屬1個(gè)分枝，核苷酸同源性達(dá)99.7%；JL-JL株與2013年吉林分離株同屬1個(gè)分枝，核苷酸同源性達(dá)99.8%。經(jīng)VP2基因推導(dǎo)氨基酸變異情況分析，6株分離株共存在6處變異，分別為267、300、324、377、426、440位氨基酸位點(diǎn)。其中，JL-CC1、JL-CC2、JL-JT、JL-LY、JL-SY426位氨基酸為天冬酰胺(N)，屬于New CPV-2a基因亞型，僅JL-JL株為天冬氨酸(D)，屬于New CPV-2b基因亞型。此外，6株CPV分離株在267、324、377、440位氨基酸發(fā)生了變異，主要表現(xiàn)為267: F→Y，324: Y→I，377: R→K，440: T→A，與中國分離株CPV/CN/HB1/2013、CPV/CN/JL6/2013等存在相同的變異。該變異已被相關(guān)文章報(bào)道過，中國、韓國、朝鮮等國家CPV分離株VP2蛋白第267、324、440位氨基酸與美國、歐洲等CPV分離株存在差異，形成了一個(gè)特殊的CPV分枝。丁軻等對2010-2013年河南省CPV流行毒株進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果7株河南分離株VP2蛋白第267、322、324、333、440等11處氨基酸發(fā)生了變異，與本試驗(yàn)變異情況相似。此外，調(diào)查結(jié)果證明河南省流行的CPV以CPV-2a型和CPV-2b型并存，但以CPV-2a型為主，且基因呈多變異現(xiàn)象[15]。通過本試驗(yàn)對吉林省寵物醫(yī)院就診犬CPV流行毒株進(jìn)行了分離及序列分析，結(jié)果提示吉林省CPV以CPV-2a亞型為主，CPV-2b亞型為輔，并存在基因多變現(xiàn)象，可為吉林省CPV的有效防控提供數(shù)據(jù)支持。

[1] Eugster A K, Bendele R A, Jones L P. Parvovirus infection in dogs [J]. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1978, 173(10): 1340-1345.

[2] Goddard A, Leise A L. Canine parvovirus [J]. Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice, 2010, 40(6): 1041-1053.

[3] 梁士哲, 魏喜仁, 范文光, 等. 狗傳染性腸炎的研究[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué), 1982, 4: 17-20.

[4] 孫梅, 吳建華, 白文軍. 犬細(xì)小病毒研究進(jìn)展[J]. 北京農(nóng)業(yè), 2013, 36: 29-31.

[5] Parrish C R, Have P, Foreyt W J,etal. The global spread and replacement of canine parvovirus strains [J]. J General Virology, 1988, 69 (5): 1111-1116.

[6] Desario C, Decaro N M, Cavalli A,etal. Canine parvovirus infection: which diagnostic test for virus?[J]. Journal of Viro-logical Methods, 2005, 126(1/2): 179-185.

[7] Decaro N, Desario C, Parisi A,etal. Genetic analysis of canine parvovirus type 2c [J]. Virology, 2009, 385(1): 5-10.[8] 張仁舟, 楊松濤, 馮昊, 等. 中國國內(nèi)首次檢測到犬細(xì)小病毒CPV-2c[J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 2010,(4): 246-249.

[9] 李廷軍. 犬細(xì)小病毒病的病理學(xué)觀察[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2009, 30(8): 125-128.

[10]Nicola D, Costantina D, Diane D A,etal. Molecular Epide-miology of Canine Parvovirus, Europe[J]. Emerging Infectious Diseases, 2007, 13(8): 1222-1224.

[11]Calderon M G, Mattion N, Bucafusco D,etal. Molecular characterization of canine parvovirus strains in Argentina: detection of the pathogenic variant CPV2c in vaccinated dogs[J]. Journal of Virological Methods, 2009, 159(2): 141-145.[12]Prittie J. Canine parvoviral enteritis: a review of diagnosis, management, and prevention[J]. Journal of Veterinary Emergency & Critical Care, 2004, 14(3): 167-176.

[13]Chinchkar S R, Subramanian B M, Rao N H,etal. Analysis of VP2 gene sequences of canine parvovirus isolates in India[J]. Archives of Virology, 2006, 151(9): 1881-1887.[14]Senda M, Parrish C R, Harasawa R,etal. Detection by PCR of wild-type canine parvovirus which contaminates dog vaccines[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1995, 33(1): 110-113.

[15]丁軻, 余祖華, 彭春平, 等. 2011-2013年河南省犬細(xì)小病毒分子流行病學(xué)調(diào)查與分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 45(10): 1671-1678.

(編輯：李文平)

Isolation and VP2 Gene Sequence Analysis of Epidemic Canine Parvovirus Strain in Jilin Province

ZHANG Shuang1，YI Shu-shuai1，WANG Yi-ming1，GUO Meng-ru1，LI Xiang2，HU Gui-xue1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun, 130118,China; 2.SongyuanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Songyuan,Changchun,138000,China)

To investigate current prevalence and viariation of canine parvovirus (CPV) among dogs in pet clinics in Jilin province, 73 anal swabs of dogs in treatment were collected from Changchun, Jilin, Liaoyuan, Songyuan and Jiutai area, Jilin province. After detection by using colloid gold fast examination reagent kit, 6 representative samples from 15 positive samples were added to F81 cell culture, and all 6 isolates(tentatively named JL-CC1, JL-CC2, JL-JL, JL-SY, JL-JT, JL-LY) were successfully isolated and identified as CPV by universal primers. VP2 gene sequence analysis showed that the nucleotide sequence homology among 6 CPV isolates was 99.3%～100%, 98.9%～99.9% compared to current domestic isolates and 98.3%～99.7% compared to abroad isolates. Phylogenetic analysis indicated that the 6 isolates belonged to 4 branches: JL-CC1, JL-LY and JL-SY isolates in same branch with Shangdong and Liaoning isolates; JL-CC2 with Heilongjiang isolate; JL-JT with Jilin isolate; JL-JL with Jilin and Heilongjiang isolates (2013). Amino acid sequence alignment showed that the 5 CPV isolates JL-CC1、JL-CC2、JL-JT、JL-LY、JL-SY belonged to New CPV-2a gene subtype, while JL-JL belonged to New CPV-2b gene subtype. Besides, there were mutations appeared at the 267th, 324th, 377th and 440th amino acid. The above results indicate that CPV, accompanying with gene variation, is mainly CPV-2a gene subtype, and CPV-2b gene subtype is a supplement in Jilin province, which will provide data support for effective prevention and control of CPV in Jilin province.

Jilin province; canine parvovirus; isolation; VP2 gene

國家重點(diǎn)研究計(jì)劃(2016YDF0501002)

張雙，碩士研究生，從事動(dòng)物病毒學(xué)研究。

胡桂學(xué)。E-mail: huguixue901103@163.com

2016-10-01

A

1002-1280 (2017) 03-0015-06

S852.4